Evaluation fonctionnelle des neurotoxines biologique dans les cultures en réseau de cellules souches dérivées neurones système central nerveux

L'objectif de cette procédure est de mesurer précisément l'effet que les neurotoxines clostridiales exercent sur la transmission synaptique dans des cultures en réseau de neurones dérivés de cellules souches embryonnaires de souris. Cela est réalisé en adaptant d'abord les cellules souches embryonnaires à une culture en suspension sans cellules nourricières et en maintenant ces cellules adaptées dans un état pluripotent. La deuxième étape consiste à différencier les cellules souches adaptées en suspension en neurones, ou ESN, en utilisant une variante de la technique de différenciation en quatre étapes.

Ensuite, les ESN sont traités avec une série de milieux afin de favoriser leur maturation en neurones formant un réseau synaptiquement actif. La dernière étape consiste à traiter les ESN avec des neurotoxines clostridiales ou d'autres neurotoxines et à mesurer les effets sur l'activité monosynaptique à l'aide de l'électrophysiologie en configuration whole cell patch clamp. Enfin, les modifications de la production spontanée d'activité monosynaptique sont quantifiées à partir d'enregistrements électrophysiologiques normalisés par rapport à des neurones contrôles appariés en âge et par lot, puis comparées entre différentes conditions telles que les doses, les durées ou les traitements médicamenteux.

Le principal avantage de cette technique est que les ESN constituent le premier modèle cellulaire permettant de reproduire les pathologies fonctionnelles responsables des manifestations cliniques du botulisme et du tétanos. Nous avons eu l'idée de cette méthode en découvrant que les ESN étaient hautement sensibles à toutes les neurotoxines clostridiales basées sur le clivage des protéines SNARE, et qu'elles présentaient également une activité synaptique spontanée dans un comportement de réseau émergent. La démonstration de la procédure sera effectuée par Mme Megan Lyman, technicienne de mon laboratoire. Commencez par transférer la culture en suspension sans cellules nourricières, adaptée.

Transférez les agrégats de CSE dans un tube conique de 15 millilitres et laissez les agrégats se tasser en un culot compact. Une fois les agrégats tassés, aspirez le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot cellulaire. Ajoutez ensuite cinq millilitres de PBS pour laver les cellules et centrifugez à 100 × g pendant 2,5 minutes.

Aspirez soigneusement le PBS, puis ajoutez 500 microlitres de trypsine et retournez le tube plusieurs fois pour rompre délicatement le culot cellulaire. Placez ensuite le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubez pendant trois minutes. Une fois le temps d'incubation écoulé, replacez le tube dans la hotte de culture tissulaire et ajoutez 500 microlitres de milieu ESC pour diluer la trypsine.

Ensuite, passer la suspension de CEL cinq à dix fois à l’aide d’une pipette P1000 afin d’obtenir une suspension monocellulaire. Compter une aliquote des cellules à l’aide d’un hémocytomètre, puis centrifuger le reste de la suspension cellulaire à 200 × g pendant trois minutes. Après avoir aspiré le surnageant, resuspendre les cellules dans un milieu ESC pour obtenir une concentration finale de 1 × 10⁷ cellules par millilitre.

Transférez ensuite 150 microlitres de la suspension dans 10 millilitres de milieu ESC dans une boîte bactériologique de 10 centimètres et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Les ESC sont habituellement repiquées en utilisant ce protocole. Toutes les 48 heures, la différenciation des ESC en neurones commence lors d'un repiquage cellulaire de routine.

Dissocier les CSE comme précédemment, mais inclure une plaque supplémentaire pour la différenciation neuronale. Transférer 350 microlitres de la suspension cellulaire dans une boîte de 10 centimètres à faible adhérence contenant 25 millilitres de milieu de différenciation. Placer la boîte sur un agitateur orbital réglé entre 30 et 45 tr/min à l'intérieur d'une incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, et incuber pendant 48 heures.

Après 48 heures, utilisez une pipette de 25 millilitres pour transférer les agrégats cellulaires en cours de différenciation dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez immédiatement 25 millilitres de milieu de différenciation frais dans la boîte de Pétri.

Laisser les agrégats se déposer pendant deux à cinq minutes, formant un culot visible d'une profondeur d'un à deux millimètres. Aspirer soigneusement le milieu, en ignorant les cellules isolées ou les petits agrégats encore en suspension, puis utiliser une pipette P1000 pour transférer la palette de cellules dans la boîte de Pétri. Remettre la boîte sur l'agitate

Après encore 48 heures, répétez la procédure de changement de milieu. Cette fois, ajoutez 30 millilitres de milieu de différenciation supplémenté avec six micromolaire d'acide rétinoïque tout-trans. Le culot formé aura désormais une profondeur de deux à quatre millimètres après incubation des cellules.

Comme précédemment, répétez la procédure de changement de milieu avec supplémentation en acide rétinoïque pour la dernière fois. Le culot aura une profondeur de quatre à huit millimètres à ce stade le jour suivant. Préparez les surfaces de mise en culture comme indiqué dans la partie écrite du protocole l'après-midi du jour de la mise en culture, ou prélevez cinq millilitres chacun de milieu de trypsine MPC pré-enrobé et d'inhibiteur de trypsine de soja à 0,1 %, à 37 degrés Celsius.

Ensuite, utilisez une pipette de 25 millilitres pour transférer les agrégats en cours de différenciation depuis la plaque de culture vers un tube conique de 50 millilitres. Laissez les agrégats se déposer pendant trois à cinq minutes, puis aspirez soigneusement le milieu sans perturber le culot. Ensuite, lavez le culot avec cinq à 10 millilitres de PBS, une fois que les agrégats se sont déposés.

Aspirez le PBS et répétez le lavage. Après le deuxième lavage au PBS, ajoutez cinq millilitres de milieu de mise en suspension MPC au culot et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Frapper doucement le tube deux à trois fois pendant l'incubation. Ensuite, ajouter cinq millilitres d'inhibiteur de la trypsine de soja à 0,1 % aux cellules et mélanger rapidement par retournement. Puis, triturer délicatement les cellules de 10 à 15 fois avec une pipette de 10 millilitres jusqu'à l'obtention d'une suspension cellulaire relativement homogène.

Filtrez lentement la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 40 ou 70 microns placé sur un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, une fois que toute la suspension a été filtrée, ajoutez un millilitre de milieu N2 sur le filtre pour rincer les cellules restantes à travers le tamis. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez pendant six minutes à 200 × g. Après avoir aspiré le milieu sans perturber le culot, resuspendez-le par trituration dans deux millilitres de milieu N2, puis ajoutez du milieu N2 jusqu'à un volume total de 10 millilitres.

Centrifuger cinq minutes à 200 × g. Aspirer le milieu et répéter une fois encore le processus de lavage du culot. Resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu N2.

Prélève un aliquot des cellules et compte-les à l’aide d’un hémocytomètre, puis répète la centrifugation de Reese. Suspendre les cellules dans le milieu N deux à une concentration finale de un fois dix puissance sept cellules par millilitre et les ensemencer à une densité de 150 000 à 200 000 cellules par centimètre carré. L’Indic est préparé au DIV moins un et placé dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius.

Entretenir les ESN conformément aux instructions du protocole écrit. Diluer d'abord la neurotoxine botulique du sérotype A à 100 fois la concentration finale souhaitée dans le milieu de culture des ESN, puis réchauffer à 37 degrés Celsius. Ajouter ensuite un volume approprié de toxine aux cultures d'ESN à DIV 21 ou plus.

Gonflez la boîte de culture et remettez-la dans l’incubateur au moment souhaité. Aspirez le milieu de culture ESN et lavez deux fois avec du tampon de enregistrement extracellulaire ou ERB. Ajoutez ensuite quatre millilitres de ERB supplémenté avec cinq micromolaire de tétradotoxine pour bloquer les potentiels d’action et 10 micromolaire de bicuculline pour antagoniser l’activité des récepteurs GABAa.

Ensuite, transférez la boîte vers le dispositif d'électrophysiologie. Aucune perfusion ni régulation de température n'est requise pour mesurer l'inhibition de la transmission synaptique ou pour le test de brouillard. Après avoir utilisé un tireur de micropipettes pour tirer des pipettes en silicate de bore ayant une résistance de cinq à 10 mégohms, remplissez une pipette par l'arrière avec du tampon d'enregistrement intracellulaire.

Plongez ensuite délicatement la pipette dans le réactif au silicium. Fixez fermement la pipette d'enregistrement sur le porte-électrode et reliez une seringue remplie d'air au tube raccordé au porte-électrode. Appliquez une pression positive constante à l’aide de la seringue tout en abaissant la pipette d’enregistrement dans la BER.

Après avoir déposé délicatement la micropipette d'enregistrement sur la SOR du neurone à enregistrer, observez une pression positive en rompant le scellement sur la seringue. Rebranchez la seringue et appliquez une pression négative soutenue par une aspiration douce afin de former un scellement de l'ordre du gigaohm.

Une fois le scellement giga-ohm formé, réduisez la tension de maintien à moins 70 millivolts. Appliquez ensuite soigneusement de brèves impulsions de pression négative à l’aide de la seringue pour accéder à la configuration en cellule entière. Surveillez les pics de capacité pendant 30 secondes afin de confirmer la stabilité du patch.

Annulez les pics de capacité dans le logiciel HEA et passez en mode de blocage de courant pour surveiller et enregistrer le potentiel de membrane au repos sans ajustement pour les potentiels de jonction liquide. Le potentiel de membrane au repos peut se situer entre moins 67 et moins 82 millivolts. Réglez le gain à deux millivolts par picoampère.

Passer en mode de blocage de tension et effectuer un enregistrement continu à moins 70 millivolts pendant trois à cinq minutes afin de détecter les courants post-synaptiques excitateurs miniatures. Analyser trois à cinq minutes de données enregistrées pour détecter les PSCm en utilisant les paramètres par défaut pour les courants post-synaptiques excitateurs des récepteurs AMPA dans MiniAnalysis, recueillir et sauvegarder les informations relatives aux événements détectés. Après avoir collecté les fréquences des PSCm pour huit à douze échantillons témoins et huit à douze échantillons traités avec la neurotoxine botulique pour chaque condition d'exposition.

Analyser la fréquence par rapport à des témoins appariés par âge et lot, puis déterminer la signification statistique du pourcentage d'inhibition de l'activité synaptique à l'aide de tests statistiques appropriés. De div 7 à div 49, les ESN expriment des compartiments neurotropes et forment des ponctions synaptiques. Interfaces taxo-dendritiques. Les ESN subissent une inhibition de l'activité synaptique lorsqu'ils sont exposés aux sérotypes de neurotoxine botulique A TG et à la toxine tétanique.

Ces tracés représentatifs provenant de réseaux de neurones spinocutanés ont été enregistrés 20 heures après l'ajout dans le bain de sérotypes de neurotoxine botulique, de toxine tétanique TG, de neurotoxine ou de véhicule. Chaque neurotoxine a réduit l'activité synaptique de plus de 95 % par rapport aux témoins. Les quatre images suivantes illustrent la sensibilité de l'utilisation de la technique MIST pour mesurer l'activité monosynaptique dans des réseaux de neurones spinocutanés traités par le sérotype A de la neurotoxine botulique.

Cette première image montre des tracés représentatifs de mesures manquées d'activité synaptique 20 heures après l'ajout en bain de la neurotoxine botulique du sérotype A. Les segments de tracés en clampage de tension ont montré une diminution de la fréquence des P-E-P-S-C après exposition à la neurotoxine botulique du sérotype A. Cette image illustre la quantification de la fréquence des P-E-P-S-C et confirme une diminution dépendante de la dose de la fréquence des P-E-P-S-C. La concentration médiane inhibitrice a été déterminée par ajustement des moindres carrés d'une régression non linéaire utilisant une pente variable à quatre paramètres. Remarque : la limite de détection par la technique MIST dans SNS est d'au moins 0,005 picomolaire.

Ce graphique en barres montre la quantification par cytométrie du clivage de SNAP 25 mesuré par immunotransfert. Remarquez la sensibilité réduite du clivage des protéines SNARE en tant qu'indicateur d'intoxication. Par rapport à mist, un astérisque unique indique une valeur P inférieure à 0,05.

Un astérisque triple indique une valeur P inférieure à 0,001. Ces résultats démontrent que les populations connectées de neurones dérivés de cellules souches offrent un modèle cellulaire physiologiquement pertinent de l'empoisonnement par les neurotoxines clostridiales. L'utilisation du SNS devrait réduire considérablement la détresse et la mortalité animales en remplaçant de manière adéquate le test de létalité chez la souris, avec l'avantage supplémentaire d'une rapidité, d'une spécificité et d'une sensibilité accrues.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurotoxicologie, qui peuvent ainsi utiliser des méthodes de criblage modérément haut débit fondées sur l'activité des réseaux neuronaux afin de faciliter le criblage thérapeutique et la détection de toxines pour les neurotoxines clostridiennes.