Un protéoliposome-Based Assay Efflux pour déterminer les propriétés unique molécule de Cl ^- Chaînes et transporteurs

L’objectif général de cette procédure est de déterminer quantitativement l’activité de transport des canaux ou transporteurs de chlorure reconstitués. Ceci est accompli en reconstituant d’abord le transporteur purifié pur en liposomes à faible densité de sorte que chaque liposome contienne soit zéro, soit une copie du complexe actif après avoir retiré les ions chlorure externes de sorte qu’il y ait un gradient ionique dirigé vers l’extérieur, les liposomes sont ajoutés à la chambre d’enregistrement où la concentration de chlorure est surveillée à l’aide d’une électrode sensible au chlorure. Ensuite, le chlorure flx des liposomes est initié par l’ajout de Val Mycin, un ionophore de potassium, qui diminue le potentiel membranaire.

Une fois que le signal atteint l’état stable, l’expérience est terminée par l’ajout d’un détergent pour dissoudre les liposomes. Enfin, en mesurant le taux d’efflux de chlorure des liposomes de protéa, reconstitués avec un canal purifié ou un transporteur, il est possible de déterminer quantitativement le taux de transport unitaire et la stœchiométrie du complexe protéique actif. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres approches existantes, telles que les mesures de flux basées sur la fluorescence, est qu’avec cette technique, il est possible de déterminer quantitativement les paramètres clés du transporteur reconstitué, tels que le taux de renouvellement unitaire et la géométrie du complexe.

En plus de fournir des mesures quantitatives de ces paramètres clés, cette méthode peut être utilisée pour déterminer rapidement et précisément l’effet des petites molécules de mutation et surveiller les sous-unités de la protéine de transfert reconstituée. L’installation d’enregistrement se compose de deux chambres, d’une électrode de chlorure, d’un pH-mètre avec une sortie électrique analogique ou numérique, d’un numériseur et d’un ordinateur avec un logiciel d’acquisition approprié. Connectez l’électrode de chlorure au pH-mètre, puis connectez la sortie du pH-mètre au numériseur, qui est connecté à l’ordinateur.

Placez l’électrode de référence dans une chambre et le fil de recodage dans l’autre. Placez ensuite les chambres sur une plaque d’agitation avec la barre d’agitation dans la chambre d’enregistrement. Assurez-vous que la barre d’agitation ne touche pas l’électrode.

Connectez les chambres à l’aide d’un pont d’agar la nuit précédant les expériences : gonflez d’un gramme de billes de cidex G 50 dans 15 millilitres de tampon externe en secouant doucement pendant au moins trois heures à température ambiante avant utilisation. Chaque expérience nécessite environ trois millilitres de billes gonflées pendant que les liposomes dégèlent à température ambiante. Versez environ trois millilitres de billes G 50 gonflées dans chaque colonne.

Laissez-les sécher par gravité. Écoulement à température ambiante. Cela prend généralement une à deux minutes.

Ensuite, préparez les vésicules ulariques en extrudant les liposomes de protéa 11 fois à travers une mini extrudeuse à l’aide d’une coupure en téflon de 0,4 micron. Placez ensuite la colonne dans une centrifugeuse à tube rond en plastique pendant 20 à 30 secondes à 1400 G dans une centrifugeuse clinique pour éliminer l’excès de solution. Après cela, en protégeant le flux, placez la colonne dans un tube en verre de 13 x 100 millimètres et ajoutez 100 microlitres des vésicules extrudées à la colonne.

Faites tourner la colonne pendant une minute à 500 G.In une centrifugeuse clinique, collectez environ 200 microlitres du flux qui seront ajoutés à la chambre d’enregistrement. Pour effectuer la mesure de l’efflux, placez deux millilitres de chlorure de potassium de 100 millimolaires dans la chambre de référence et 1,8 millilitre de tampon externe dans la chambre d’enregistrement. Lancez le programme d’acquisition.

Laissez la ligne de base s’équilibrer. Cela peut prendre quelques minutes. Une fois que le signal atteint une ligne de base stable, commencez l’enregistrement.

Ajoutez 15 microlitres d’une solution de chlorure de potassium molaire beige pour calibrer le système. Ajoutez ensuite des liposomes. Un petit saut peut être visible en raison d’une élimination incomplète du chlorure externe des liposomes de protéa.

Attendez que la ligne de base se stabilise. Ensuite, ajoutez CIN pour lancer flx. Laissez la FLX suivre son cours temporel jusqu’à ce qu’elle plafonne.

À ce stade, ajoutez 40 microlitres de glucocide bêta Octa de 1,5 molaire préparé dans le tampon externe pour dissoudre tous les liposomes. Attendez ensuite 10 à 15 secondes. Terminez l’enregistrement et procédez à l’analyse des données comme décrit dans le protocole texte.

Lorsque des liposomes contenant une teneur élevée en chlorure interne sont immergés dans une faible teneur en chlorure, produisant un gradient de chlorure de 300 fois, aucun flux d’ions nets n’est observé. En effet, les liposomes exempts de protéines ont une faible perméabilité intrinsèque aux ions. Aucune FLX macroscopique n’est observée à partir des liposomes prot reconstitués avec le transporteur de chlorure couplé aux protons, C-L-C-E-C one.

Étant donné que la petite quantité de chlorure sortant du vesco accumule une charge positive nette dans le liposome, l’ajout de CIN permet aux ions potassium de se déplacer à travers la membrane, soulageant le potentiel électrique et initiant le chlorure flx. La réaction est terminée et la quantité totale d’ions chlorure contenue dans les vésicules est mesurée pour déterminer les propriétés des protéines reconstituées. Les données brutes de l’évolution temporelle de l’efflux sont d’abord converties de millivolts en concentration de chlorure, puis normalisées, puis ajustées dans le temps.

Il a été déterminé que la constante de temps de l’efflux est de 41 secondes et que la fraction des liposomes contenant zéro copie active de C-L-C-E-C one est le point 31, indiquant qu’environ un tiers des liposomes ne contiennent aucune protéine active à partir de ces valeurs et mesurant la teneur en chlorure des vésicules contenant au moins une copie de C-L-C-E-C one, il est possible de déterminer un taux de transport unitaire de C-L-C-E-C égal à environ 2 500 ions chlorure par seconde. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer la nécessité de faire tourner un transporteur. Ces expériences peuvent être réalisées en 10 à 15 minutes lorsqu’elles sont effectuées avec soin.

Il est essentiel d’évaluer soigneusement la qualité des liposomes, car les fuites affectent négativement les estimations du taux de renouvellement.