Un protéoliposome-Based Assay Efflux pour déterminer les propriétés unique molécule de Cl

L'objectif général de cette procédure est de déterminer quantitativement l'activité de transport des canaux ou transporteurs de chlorure reconstitués. Cette détermination s'effectue tout d'abord en reconstituant le transporteur purifié dans des liposomes à faible densité, de sorte que chaque liposome contienne soit zéro, soit une copie du complexe actif. Après élimination des ions chlorure externes afin de créer un gradient ionique dirigé vers l'extérieur, les liposomes sont ajoutés dans la chambre d'enregistrement, où la concentration en chlorure est surveillée à l'aide d'une électrode sensible au chlorure. Ensuite, le flux de chlorure en provenance des liposomes est déclenché par l'ajout de Val Mycin, un ionophore de potassium, qui dissipe le potentiel membranaire.

Une fois que le signal atteint un état stable, l'expérience est arrêtée par l'ajout d'un détergent afin de dissoudre les liposomes. En définitive, en mesurant la vitesse d'efflux du chlorure à partir de liposomes protéiques, reconstitués avec un canal ou un transporteur purifié, il est possible de déterminer quantitativement la vitesse de transport unitaire et la stœchiométrie du complexe protéique actif. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres approches existantes, telles que les mesures de flux basées sur la fluorescence, est qu'elle permet de déterminer quantitativement des paramètres clés du transporteur reconstitué, tels que la vitesse unitaire de renouvellement et la géométrie du complexe.

En plus de fournir des mesures quantitatives de ces paramètres clés, cette méthode peut être utilisée pour déterminer rapidement et précisément l'effet de mutations, de petites molécules et pour surveiller les sous-unités dans la protéine de transfert reconstituée. Le dispositif d'enregistrement est composé de deux chambres, d'une électrode au chlorure, d'un pH-mètre doté d'une sortie électrique analogique ou numérique, d'un numériseur et d'un ordinateur muni d'un logiciel d'acquisition approprié. Connectez l'électrode au chlorure au pH-mètre, puis reliez la sortie du pH-mètre au numériseur, qui est connecté à l'ordinateur.

Placer l'électrode de référence dans une chambre et le fil d'enregistrement dans l'autre. Ensuite, placer les chambres sur une plaque agitatrice avec le barreau aimanté dans la chambre d'enregistrement. Veiller à ce que le barreau aimanté ne touche pas l'électrode.

Reliez les chambres à l'aide d'un pont d'agar la veille des expériences. Faites gonfler un gramme de billes de Cidex G 50 dans 15 millilitres de tampon externe avec un léger agitation pendant au moins trois heures à température ambiante avant utilisation. Chaque expérience nécessite environ trois millilitres de billes gonflées pendant que les liposomes décongèlent à température ambiante. Versez environ trois millilitres de billes G 50 gonflées dans chaque colonne.

Laissez-les sécher par gravité. Faites circuler à température ambiante. Cela prend généralement de une à deux minutes.

Ensuite, préparez des vésicules unilamellaires en extrudant les liposomes protéiques 11 fois à l’aide d’un mini-extrudeur équipé d’un filtre en téflon de 0,4 micron. Puis, placez la colonne dans un tube conique en plastique et centrifugez pendant 20 à 30 secondes à 1400 ×g dans une centrifugeuse clinique afin d’éliminer la solution excédentaire. Après cela, en veillant à ne pas perturber le flux, placez la colonne dans un tube en verre de 13 sur 100 millimètres et ajoutez 100 microlitres des vésicules extrudées sur la colonne.

Faire tourner la colonne pendant une minute à 500 G. Dans une centrifugeuse clinique, récupérer environ 200 microlitres du flux sortant, qui sera ajouté à la chambre d’enregistrement. Pour effectuer la mesure de l’efflux, placer deux millilitres de chlorure de potassium à 100 millimolaire dans la chambre de référence et 1,8 millilitre du tampon externe dans la chambre d’enregistrement. Démarrer le programme d’acquisition.

Laissez l'équilibre de la ligne de base s'établir. Cela peut prendre quelques minutes. Une fois que le signal atteint une ligne de base stable, commencez l'enregistrement.

Ajoutez 15 microlitres d'une solution molaire de chlorure de potassium de couleur beige pour étalonner le système. Ensuite, ajoutez les liposomes. Un petit saut pourrait être visible en raison d'une élimination incomplète du chlorure externe des liposomes protéiques.

Attendez que la ligne de base se stabilise. Ensuite, ajoutez du CIN pour initier la flx. Laissez la FLX suivre son cours temporel jusqu'à ce qu'elle atteigne un plateau.

À ce stade, ajoutez 40 microlitres de β-octylglucoside 1,5 M préparé dans le tampon externe afin de dissoudre toutes les liposomes. Attendez ensuite 10 à 15 secondes. Terminez l'enregistrement et passez à l'analyse des données comme décrit dans le protocole écrit.

Lorsque des liposomes contenant une forte concentration interne de chlorure sont immergés dans un milieu à faible teneur en chlorure, créant un gradient de chlorure de 300 fois, aucun flux ionique net n'est observé. Cela s'explique par la faible perméabilité intrinsèque des liposomes exempts de protéines aux ions. Aucun FLX macroscopique n'est observé à partir de liposomes protéiques reconstitués avec le transporteur de chlorure couplé au proton, C-L-C-E-C one.

Étant donné que la faible quantité de chlorure sortant du vésico s'accompagne d'une accumulation d'une charge nette positive dans le liposome, l'ajout de CIN permet aux ions potassium de traverser la membrane, ce qui dissipe le potentiel électrique et déclenche le flux de chlorure. La réaction est arrêtée, puis la quantité totale d'ions chlorure contenue dans les vésicules est mesurée afin de déterminer les propriétés des protéines reconstituées individuelles. Les données brutes du cours temporel de l'efflux sont d'abord converties de millivolts en concentration de chlorure, puis normalisées ; le cours temporel est ensuite ajusté.

On a déterminé que la constante de temps de l'efflux est de 41 secondes et que la fraction de liposomes contenant zéro copie active de C-L-C-E-C un est de 0,31, ce qui indique qu'environ un tiers des liposomes ne contiennent aucune protéine active. À partir de ces valeurs et en mesurant la teneur en chlorure des vésicules contenant au moins une copie de C-L-C-E-C un, il est possible de déterminer un taux de transport unitaire de C-L-C-E-C un égal à environ 2 500 ions chlorure par seconde. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déterminer le besoin de renouvellement d'un transporteur. Ces expériences peuvent être réalisées en 10 à 15 minutes lorsqu'elles sont effectuées avec soin.

Il est essentiel d'évaluer attentivement la qualité des liposomes, car les fuites affectent négativement les estimations du taux de renouvellement.