Name: Un protéoliposome-Based Assay Efflux pour déterminer les propriétés unique molécule de Cl - Chaînes et transporteurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Découvrez un protocole d'efflux basé sur des protéoliposomes pour mesurer quantitativement l'activité de transport des canaux et transporteurs de chlorure reconstitués. Cette méthode permet de déterminer le taux de transport unitaire et la stochiométrie du complexe protéique actif avec précision.

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Ce travail a été soutenu par une subvention des NIH GM085232 et une bourse Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (à A.A.).

1. Préparation des lipides <ol><li> Aliquoter les lipides quantité désirée dans un tube de verre clair. Tu Vois. coli extrait lipidique polaire, mais la plupart des compositions lipidiques peuvent être utilisés. Si les lipides sont sous forme de poudre, les remettre en suspension dans du chloroforme à une concentration de 20 mg / ml. Sécher les lipides à température ambiante sous N2 gaz jusqu&#39;à ce que tout le solvant se est évaporé. </li><li> Reprendre les lipides dans le pentane et le sécher à nouveau un flux régulier de gaz N 2 pour éliminer les traces de restes de chloroforme. Sec jusqu&#39;à ce que tout le solvant se est évaporé. Bien que le séchage, faire tourner doucement le tube de façon que le lipide est distribué dans un film uniforme couvrant le tiers inférieur du tube plutôt que d&#39;une formation d&#39;une masse dense à la base. </li><li> Ajouter le tampon de reconstitution contenant un détergent (300 mM de KCl, 50 mM d&#39;acide citrique, 25 mM de K 2 HPO 4, à pH 4,5, CHAPS 35 mM) pour dissoudre les lipides. Utiliser d&#39;autres détergents doux pour cette étape si la protéine est mal tolérants à CHAPS. </li><li> ResuspenD les lipides à la clarté en utilisant un appareil à ultrasons à bain d&#39;eau. Plonger le tube dans le centre du bain de sonicateur de l&#39;eau à la puissance maximale à court (30 sec-1 min) avec des impulsions de courte durée (30 sec-1 min) pauses. La solution doit devenir clair. NOTE: Le dernier degré de clarté atteint dépend de la composition lipidique spécifique utilisé. Une certaine variation de lot à lot dans cette étape, même parmi les lipides nominalement identiques, est également possible. Trouble résiduel est dû à la diffusion de lumière par les grosses particules dans la suspension, qui peuvent être éliminés par centrifugation. </li><li> Incuber les lipides remises en suspension à température ambiante pendant 20 à 60 min. </li></ol> 2. Formation protéoliposome REMARQUE: Plusieurs stratégies peuvent être employées pour introduire la protéine solubilisée par un détergent dans des liposomes. Pour CLC-ec1 dialyse fonctionne bien et est donc la méthode de choix 6,9,10. <ol><li> Ajouter la protéine purifiée de la protéine souhaitée à des lipides (P / L) rapport (exprimé en pg o<html> f protéine / mg de lipide). Le choix du rapport P / L dépend du but de l&#39;expérience. <ol><li> Si le but est d&#39;évaluer l&#39;activité de la protéine d&#39;intérêt, à haute reconstituer P / L&#39;s pour maximiser le signal, chaque liposome contient des copies multiples de la protéine. Pour quantifier l&#39;activité et / ou la vitesse de transport unitaire de la protéine, reconstituer dans un régime à basse dilution Poisson P / L&#39;s, de sorte que chaque vésicule contient en moyenne une protéine. Voir l&#39;étape 7 et discussion pour une analyse plus approfondie de l&#39;utilisation de chaque régime. </li></ol></li><li> Pour déterminer les valeurs P / L optimales pour les différents schémas, effectuer un titrage complet de l&#39;activité en fonction de la concentration en protéine 8,11-13. Toutefois, pour toute protéine pour laquelle le poids moléculaire (MW, exprimée en kDa) de l&#39;unité active est connu dans le P / L valeurs suivantes peuvent être utilisés comme des estimations approximatives initiales: pg &quot;/&gt; <img alt="Equation 2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li> Charger le mélange de protéines et de lipides dans un tube de dialyse pré-mouillée ou une cassette. Placer le dispositif de dialyse dans un bêcher contenant 500-1,000x le volume du tampon de reconstitution lipide (par exemple, une mémoire tampon pour L 1 ml de lipide) remise en suspension sous agitation douce. <ol><li> Changer tampon 3-4 fois à intervalles&gt; 3 h. A chaque changement de solution, laver la cassette / tube et le bécher avec de l&#39;eau distillée et remplir le bécher avec le tampon de reconstitution frais. Inclure 1-2 O N / intervalles pour le changement de solution. Le nombre exact et la durée des changements de la solution dépend de la lipide exacte et les détergents utilisés. </li></ol></li><li> Après la dernière étape est terminée, retirez les liposomes de la cuve de dialyse, les aliquoter dans des tubes et flash les congeler dans un liquide N 2 ou gel à -80 ° C. </li></ol> 3. Enregistrement Set-up &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTE: L&#39;enregistrement mis en place (figure 2A) se compose de deux chambres (cylindres à fond plat, ~ 3-4 ml de volume), un Cl - (voir ci-dessous) électrode, un pH-mètre avec un analogue ou sortie numérique électrique, un numériseur et un ordinateur avec un logiciel d&#39;acquisition appropriée. <ol><li> Connecter le Cl - électrode de pH-mètre, la sortie de l&#39;appareil de mesure du pH au numériseur qui est relié à l&#39;ordinateur. Placer l&#39;électrode de référence dans une chambre de recodage et le fil dans l&#39;autre (figure 2B). NOTE: La polarité des fils est correct si AV Cal (voir l&#39;étape 6.4 et 7.2) est positif. </li><li> Placez les chambres sur une plaque d&#39;agitation avec un barreau d&#39;agitation dans la chambre d&#39;enregistrement (figure 1B). Assurez-vous que la barre d&#39;agitation ne touche pas l&#39;électrode. </li><li> Raccorder les chambres en utilisant un pont d&#39;agar (figure 2B) (100 mM de KCl et 2% d&#39;agarose). Conserver les ponts Agar dans 100 mM de KCl. </li&gt; </ol> 4. Préparation du Cl - électrode <ol><li> Prenez un vieux et -possibly- électrode de pH non-fonctionnement. Briser le revêtement de verre pour révéler complètement les fils d&#39;argent. </li><li> Retirez délicatement le revêtement des fils d&#39;argent en utilisant une lame de scalpel. Nettoyez les fils à l&#39;aide de grandes quantités de H 2 O et EtOH. </li><li> Placer dans une solution saturée de FeCl 3 (ou eau de Javel) jusqu&#39;à ce que les fils sont recouverts d&#39;un manteau sombre uniforme de AgCl. </li></ol> 5. Préparation de vésicules unilamellaires <ol><li> La nuit avant les expériences, gonfler 1 g de Sephadex G-50 perles dans 15 ml de tampon externe (1 mM de KCl, 150 mM de K 2 SO 4, l&#39;acide citrique 25 mM, pH 4,5) en agitant doucement (Ne pas remuer) pour au moins trois heures à température ambiante avant utilisation. Chaque expérience nécessite ~ 3 ml de perles gonflées. Gardez les perles gonflées à 4 ° C pendant quelques jours au plus. </li><li> Alors que les liposomes sont décongélation à température ambiante, verser dans chaque colonne ~ 3 ml de gonflées G-50 perles. Laissez-les sécher par gravité à la température ambiante; cela prend habituellement 1-2 min. </li><li> Préparer vésicules unilamellaires par extrusion des protéoliposomes 11 fois à travers un mini-extrudeuse en utilisant un seuil de coupure de 0,4 m de Teflon. </li><li> Placer la colonne dans un tube à fond rond en matière plastique. Faites tourner les colonnes pour éliminer l&#39;excès de solution. Centrifuger pendant 20 à 30 secondes à 1400 xg dans une centrifugeuse clinique. </li><li> Jeter accréditives, lieu colonne dans un tube de verre 13 x 100 mm et ajouter 100 pi des vésicules extrudées à la colonne. Spin colonne pendant 1 min à 500 g dans une centrifugeuse clinique. </li><li> Recueillir ~ 200 pi d&#39;accréditives qui seront ajoutés à la chambre d&#39;enregistrement à l&#39;étape 6.5. </li></ol> 6. Efflux mesure <ol><li> Placer 2 ml de 100 mM de KCl dans la référence (masse) chambre et 1,8 ml du tampon externe (1 mM de KCl, 150 mM de K 2 SO 4, l&#39;acide citrique mM 25 à pH 4,5) à la chambre d&#39;enregistrement. Le léger déséquilibre osmotique entre l&#39;interneet des solutions externes ne affecte pas </li><li> Démarrez le programme d&#39;acquisition. Laissez la ligne de base équilibrer, cela peut prendre quelques minutes. </li><li> Une fois le signal atteint une ligne de base stable (les liposomes sont prêts et les colonnes sèches), commencer l&#39;enregistrement (figure 3A). </li><li> Ajouter 15 ul d&#39;une solution 10 mM de KCl pour calibrer le système (figure 2A). </li><li> Ajouter liposomes. Un petit saut pourrait être visible en raison de l&#39;élimination incomplète de Cl externe - des protéoliposomes (figure 3A). Attendez que la ligne de base se stabilise. </li><li> Ajouter valinomycine (1 ul à 1 mg / ml dans EtOH) pour initier l&#39;efflux (figure 3A). </li><li> Laissez l&#39;efflux suivre son évolution dans le temps jusqu&#39;à ce qu&#39;il plateaux (figure 3A). </li><li> Ajouter 40 ul de 1,5 M β-octylglucoside (β-OG) préparé dans le tampon externe pour dissoudre tous les liposomes (figure 3A). Terminez l&#39;enregistrement. </li></ol> 7. A donnéesnalyse <ol><li> Exportez le fichier de trace à partir dans un format ASCII ou texte et l&#39;importer dans le programme d&#39;analyse de choix. </li><li> Mesurer la tension aux points suivants (figure 3A): Au début de l&#39;enregistrement (V 0); Après addition de l&#39;impulsion d&#39;étalonnage (V cal); Après addition des liposomes (V lipo); A la fin de l&#39;écoulement (V fin); Après addition de détergent (V tot); Baseline les tensions de sorte que V 0 = 0. </li><li> Utilisez l&#39;équation de Nernst-Planck pour déterminer la valeur expérimentale de <img alt="Équation 3" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" /> en mesurant <img alt="Equation 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> Où Vol Cal est le volume de l&#39;impulsion d&#39;étalonnage dans ul, 1800 est le volume de la chambre au début de l&#39;expérience exprimée en1; l, [Cl] cal / en sont les Cl - les concentrations de l&#39;impulsion de l&#39;étalonnage et de la mémoire tampon externe mM et AV cal est le saut en mV mesurée après l&#39;impulsion d&#39;étalonnage. NOTE: Cette détermination empirique de α répond à trois objectifs: il se assure que le système répond correctement, offre une mesure de la cohérence de la réponse de l&#39;instrument entre les expériences ainsi que pour vérifier qu&#39;aucun erreurs ont été commises dans la fabrication de la solution. </li><li> Calculer les concentrations en Cl après chaque étape comme suit: <img alt="Equation 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="Equation 6" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="Equation 7" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> Le facteur 3/400 vient de la dilution de l&#39;impulsion de calibrage de 15 ul dans un volume final de 2000 pl. </li><li> Calculmangé les changements dans [Cl] à chaque étape, ΔCl lipo / FIN / tot. </li><li> Autre V (t) Cl (t) avec <img alt="Equation 8" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> Directement déterminer les [CL] valeurs aux points critiques et de les comparer aux valeurs calculées comme un contrôle interne. </li><li> Normaliser la trace de sorte que la lipo Cl rel = 0 et Cl rel tot = 1 <img alt="Equation 9" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li> Monter le cours de temps d&#39;écoulement à l&#39;équation suivante: <img alt="Equation 10" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> Où L est le taux de Cl - fuite qui est déterminé expérimentalement en mesurant Cl - efflux de liposomes exempts de protéines préparés dans les mêmes conditions et τ est la constante de temps du processus. </li><li> Calculer v, la vitesse initiale: Lorsque ΔCl ailette est exprimée en millimoles et V est le volume de la chambre en pi. </li><li> Calculer le taux de transport / conductance <img alt="Equation 12" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> Où p est le rapport P / L, MW est le poids moléculaire du complexe actif exprimée en kDa </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Nous avons décrit un protocole détaillé pour mesurer Cl - le transport médié par les canaux ou transporteurs reconstitués dans des liposomes anioniques sélectif purifiés. L&#39;exemple utilisé était le procaryote H + / Cl - Échangeur CLC-CE1. Toutefois, la méthode peut être facilement adapté à l&#39;étude canaux gated par des ligands 12,13,15, 11,12 tension, ou de sport différente sélectivité anionique 15,16 en remplaçant le Ag: AgCl par celle adaptée pour l&#39;ion...

Dans les deux dernières décennies, la capacité de surexprimer et purifier des protéines de transport membranaire a considérablement augmenté: les canaux ioniques, les transporteurs primaires et secondaires sont maintenant couramment purifiés à partir de systèmes d&#39;expression hétérologues, ainsi que des sources naturelles. De nouvelles approches pour surveiller l&#39;expression, améliorer et faciliter l&#39;extraction et à améliorer la stabilité de ces protéines sont constamment mises au point 1-5. Ces avancées technologiques ont joué un rôle dans le déclenchement de l&#39;explosion de l&#39;information structurelle niveau atomique de protéines membranaires qui, à son tour, amélioré notre compréhension des bases structurelles de leur fonction. En revanche, notre capacité à sonder les propriétés fonctionnelles des protéines purifiées ne ont pas augmenté au même rythme, de sorte que dans certains cas, des informations structurelles haute résolution est accompagnée de données fonctionnelles qualitatives, limitant ainsi notre capacité à tester quantitativement prédictions basées sur la structure. Par conséquent, la mist des analyses fonctionnelles quantitatives et généralisables est une étape clé pour l&#39;élucidation des fondements mécanistes de la fonction des protéines de la membrane. Nous décrivons ici un essai d&#39;écoulement qui peut être utilisé pour déterminer quantitativement des propriétés fonctionnelles clés de reconstituées purifiées et Cl - canaux et des transporteurs. Les principes qui sous-tendent l&#39;analyse peuvent être généralisés à une variété de systèmes de transport, ainsi que des protéines de transport non-ioniques. Les liposomes sont reconstitués purifiés avec canal Cl - / transporteurs en présence d&#39;un grand Cl - gradient (Figure 1A, B). Cl - efflux est initiée par l&#39;addition d&#39;un ionophore pour permettre un flux contre-ion, dans notre cas le K + ionophore valinomycine, qui shunter la tension établie par le Cl - gradient et régler le potentiel de la membrane initiale au potentiel de K d&#39;équilibre + 6,7. Sans til ne ionophore Cl nette significative - efflux se produit, comme cela est empêché par la génération d&#39;un potentiel transmembranaire. Les données sont quantitativement décrite par deux paramètres mesurables (figure 1c): τ, la constante de temps de Cl - efflux, et f 0, la fraction de liposomes ne contenant pas de protéine active. De τ et f 0 Cl unitaire - taux de transport, la fraction de protéines actives et la masse moléculaire du complexe actif peuvent être dérivées 8. La technique est illustrée ici en utilisant protéoliposomes reconstituées avec la SIC-CE1, un type bien caractérisé CTC H + / Cl - échangeur de la structure et de la fonction connue. Ce dosage est facilement généralisable à des canaux ou transporteurs à sélectivité ionique ou différent, dont l&#39;activité dépend de la présence de tension et / ou des ligands. En outre, ce test peut être utilisé pour déterminer si petites molécules affectent directement la protéine reconstitué,pour quantifier les effets de ces composés et de la façon dont la composition de la membrane ou des réactifs lipidiques modificateurs affectent la fonction des canaux reconstituées et les transporteurs.

<table><tbody><tr><td>Liposomicateur, Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>&nbsp ; Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>610200</td><td></td></tr><tr><td>IEC Centra CL2 Benchtop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orion Research Model 701A Compteur</td><td></td><td></td> numérique pH-mV <td>Ceux-ci peuvent être trouvés sur Ebay.</td></tr><tr><td>Sonde de pH non fonctionnelle N’importe</td><td></td><td></td><td>quelle sonde de pH-mètre avec des fils d’argent fonctionnera. Le revêtement en verre/plastique doit être enlevé et les fils nettoyés.</td></tr><tr><td>DI-710 Enregistreur de données</td><td>DATAQ instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition WinDAQ Instruments</td><td>DATAQ Colonnes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>en plastique jetables Pierce, écoulement par gravité, 2ml</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>29922</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de culture KIMAX, jetables, verre borosilicaté</td><td>Kimble Chase</td><td>73500-13100</td><td></td></tr><tr><td>Set d’extrudeuse avec support/bloc</td> <td>chauffantAvanti Polar Lipids Inc.</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un protéoliposome-based assay efflux pour déterminer les propriétés unique molécule de cl<sup&gt; -</sup&gt; chaînes et transporteurs

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Les 15 dernières années ont été caractérisées par une explosion de la capacité à surexprimer et à purifier les protéines membranaires des organismes procaryotes ainsi que des eucaryotes. Cette augmentation a été largement motivée par la poussée réussie pour obtenir des informations structurelles sur les protéines membranaires. Cependant, la capacité d’interroger fonctionnellement ces protéines n’a pas progressé au même rythme et est souvent limitée à des tests qualitatifs de valeur quantitative limitée, limitant ainsi les informations mécanistes qu’elles peuvent fournir. Un test permettant d’étudier quantitativement l’activité de transport des canaux ou transporteurs de Cl- reconstitués est décrit. Le dosage est basé sur la mesure du taux d’efflux de Cl- des protéoliposomes suite à l’ajout de l’ionophore K+ valinomycine pour shunter le potentiel membranaire. Une électrode sensible aux ions est utilisée pour suivre l’évolution temporelle de l’efflux d’ions à partir de protéoliposomes reconstitués avec la protéine souhaitée. La méthode est très adaptée aux études mécanistes, car elle permet de déterminer quantitativement les propriétés clés de la protéine reconstituée, telles que son taux de transport unitaire, la fraction de protéine active et la masse moléculaire de l’unité fonctionnelle. Le test peut également être utilisé pour déterminer l’effet de composés à petites molécules qui inhibent/activent directement la protéine reconstituée, ainsi que pour tester les effets modulateurs de la composition membranaire ou des réactifs modifiant les lipides. Dans la mesure du possible, la comparaison directe entre les résultats obtenus à l’aide de cette méthode s’est avérée être en bon accord avec ceux obtenus à l’aide d’approches électrophysiologiques. La technique est illustrée à l’aide de CLC-ec1, un échangeur H+/Cl- de type CLC, comme système modèle. Le test d’efflux peut être utilisé pour étudier n’importe quel canal/transporteur conducteur de Cl et, avec des changements minimes, peut être adapté pour étudier n’importe quelle protéine transporteuse d’ions.

Nous décrivons un protocole détaillé et robuste pour mesurer Cl - le transport médié par la SIC-ec1 purifiée, un type CTC procaryote H + / Cl - échangeur, reconstituée dans des liposomes. Une représentation schématique de l&#39;expérience est illustré à la figure 3 protéoliposomes reconstituées avec la SIC-ec1 purifié et contenant haute Cl interne -. Sont immergés dans une solution de bain contenant faible Cl -. Dans ces conditions Cl net -</su...

Les protéoliposomes sont utilisés pour étudier les canaux purifiés et les transporteurs reconstitués dans un environnement biochimique bien défini. Une procédure expérimentale pour mesurer l’efflux médié par ces protéines est illustrée. Les étapes de préparation des protéoliposomes, d’enregistrement et d’analyse des données pour déterminer quantitativement les propriétés fonctionnelles de la protéine reconstituée sont décrites.

Un protéoliposome-Based Assay Efflux pour déterminer les propriétés unique molécule de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Chaînes et transporteurs

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer quantitativement l'activité de transport des canaux ou transporteurs de chlorure reconstitués. Cette détermination s'effectue tout d'abord en reconstituant le transporteur purifié dans des liposomes à faible densité, de sorte que chaque liposome contienne soit zéro, soit une copie du complexe actif. Après élimination des ions chlorure externes afin de créer un gradient ionique dirigé vers l'extérieur, les liposomes sont ajoutés dans la chambre d'enregistrement, où la concentration en chlorure est surveillée à l'aide d'une électrode sensible au chlorure. Ensuite, le flux de chlorure en provenance des liposomes est déclenché par l'ajout de Val Mycin, un ionophore de potassium, qui dissipe le potentiel membranaire.Une fois que le signal atteint un état stable, l'expérience est arrêtée par l'ajout d'un détergent afin de dissoudre les liposomes. En définitive, en mesurant la vitesse d'efflux du chlorure à partir de liposomes protéiques, reconstitués avec un canal ou un transporteur purifié, il est possible de déterminer quantitativement la vitesse de transport unitaire et la stœchiométrie du complexe protéique actif. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres approches existantes, telles que les mesures de flux basées sur la fluorescence, est qu'elle permet de déterminer quantitativement des paramètres clés du transporteur reconstitué, tels que la vitesse unitaire de renouvellement et la géométrie du complexe.En plus de fournir des mesures quantitatives de ces paramètres clés, cette méthode peut être utilisée pour déterminer rapidement et précisément l'effet de mutations, de petites molécules et pour surveiller les sous-unités dans la protéine de transfert reconstituée. Le dispositif d'enregistrement est composé de deux chambres, d'une électrode au chlorure, d'un pH-mètre doté d'une sortie électrique analogique ou numérique, d'un numériseur et d'un ordinateur muni d'un logiciel d'acquisition approprié. Connectez l'électrode au chlorure au pH-mètre, puis reliez la sortie du pH-mètre au numériseur, qui est connecté à l'ordinateur.Placer l'électrode de référence dans une chambre et le fil d'enregistrement dans l'autre. Ensuite, placer les chambres sur une plaque agitatrice avec le barreau aimanté dans la chambre d'enregistrement. Veiller à ce que le barreau aimanté ne touche pas l'électrode.Reliez les chambres à l'aide d'un pont d'agar la veille des expériences. Faites gonfler un gramme de billes de Cidex G 50 dans 15 millilitres de tampon externe avec un léger agitation pendant au moins trois heures à température ambiante avant utilisation. Chaque expérience nécessite environ trois millilitres de billes gonflées pendant que les liposomes décongèlent à température ambiante. Versez environ trois millilitres de billes G 50 gonflées dans chaque colonne.Laissez-les sécher par gravité. Faites circuler à température ambiante. Cela prend généralement de une à deux minutes.Ensuite, préparez des vésicules unilamellaires en extrudant les liposomes protéiques 11 fois à l’aide d’un mini-extrudeur équipé d’un filtre en téflon de 0,4 micron. Puis, placez la colonne dans un tube conique en plastique et centrifugez pendant 20 à 30 secondes à 1400 ×g dans une centrifugeuse clinique afin d’éliminer la solution excédentaire. Après cela, en veillant à ne pas perturber le flux, placez la colonne dans un tube en verre de 13 sur 100 millimètres et ajoutez 100 microlitres des vésicules extrudées sur la colonne.Faire tourner la colonne pendant une minute à 500 G. Dans une centrifugeuse clinique, récupérer environ 200 microlitres du flux sortant, qui sera ajouté à la chambre d’enregistrement. Pour effectuer la mesure de l’efflux, placer deux millilitres de chlorure de potassium à 100 millimolaire dans la chambre de référence et 1,8 millilitre du tampon externe dans la chambre d’enregistrement. Démarrer le programme d’acquisition.Laissez l'équilibre de la ligne de base s'établir. Cela peut prendre quelques minutes. Une fois que le signal atteint une ligne de base stable, commencez l'enregistrement.Ajoutez 15 microlitres d'une solution molaire de chlorure de potassium de couleur beige pour étalonner le système. Ensuite, ajoutez les liposomes. Un petit saut pourrait être visible en raison d'une élimination incomplète du chlorure externe des liposomes protéiques.Attendez que la ligne de base se stabilise. Ensuite, ajoutez du CIN pour initier la flx. Laissez la FLX suivre son cours temporel jusqu'à ce qu'elle atteigne un plateau.À ce stade, ajoutez 40 microlitres de β-octylglucoside 1,5 M préparé dans le tampon externe afin de dissoudre toutes les liposomes. Attendez ensuite 10 à 15 secondes. Terminez l'enregistrement et passez à l'analyse des données comme décrit dans le protocole écrit.Lorsque des liposomes contenant une forte concentration interne de chlorure sont immergés dans un milieu à faible teneur en chlorure, créant un gradient de chlorure de 300 fois, aucun flux ionique net n'est observé. Cela s'explique par la faible perméabilité intrinsèque des liposomes exempts de protéines aux ions. Aucun FLX macroscopique n'est observé à partir de liposomes protéiques reconstitués avec le transporteur de chlorure couplé au proton, C-L-C-E-C one.Étant donné que la faible quantité de chlorure sortant du vésico s'accompagne d'une accumulation d'une charge nette positive dans le liposome, l'ajout de CIN permet aux ions potassium de traverser la membrane, ce qui dissipe le potentiel électrique et déclenche le flux de chlorure. La réaction est arrêtée, puis la quantité totale d'ions chlorure contenue dans les vésicules est mesurée afin de déterminer les propriétés des protéines reconstituées individuelles. Les données brutes du cours temporel de l'efflux sont d'abord converties de millivolts en concentration de chlorure, puis normalisées ; le cours temporel est ensuite ajusté.On a déterminé que la constante de temps de l'efflux est de 41 secondes et que la fraction de liposomes contenant zéro copie active de C-L-C-E-C un est de 0,31, ce qui indique qu'environ un tiers des liposomes ne contiennent aucune protéine active. À partir de ces valeurs et en mesurant la teneur en chlorure des vésicules contenant au moins une copie de C-L-C-E-C un, il est possible de déterminer un taux de transport unitaire de C-L-C-E-C un égal à environ 2 500 ions chlorure par seconde. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déterminer le besoin de renouvellement d'un transporteur. Ces expériences peuvent être réalisées en 10 à 15 minutes lorsqu'elles sont effectuées avec soin.Il est essentiel d'évaluer attentivement la qualité des liposomes, car les fuites affectent négativement les estimations du taux de renouvellement.

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JoVE Journal

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Nous introduisons une vitesse basées sur la fluorescence de dosage qui surveille le taux de la trempe de fluorescence comme une mesure de l'activité du canal gramicidine. Les canaux de gramicidine sont utilisés comme capteurs de force moléculaire pour surveiller les changements dans les propriétés de bicouche lipidique telle que détectée par des protéines bicouche couvrant.

Gramicidine basée Assay fluorescence; pour déterminer le potentiel de petites molécules pour modifier les propriétés bicouche lipidique

Ce protocole décrit une méthode pour la mesure quantitative de la translocation de peptide dans de grandes vésicules lipidiques unilamellaires. Cette méthode fournit également des informations sur le taux de translocation membranaire et peut être utilisé pour identifier des peptides qui servent efficacement et spontanément croisée bicouches lipidiques.

Mesure translocation peptide dans de grandes vésicules unilamellaires

Nous présentons un protocole pour l'étude in vitro de pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Ce protocole permet la génération d'un gradient de protons solide, réversible, et accordable à l'intérieur de la membrane du liposome et par conséquent doit être adaptable à n'importe quelle protéine de la membrane sous tension par la force protomotive.

In vitro enquête de la pompe à efflux MexAB De Pseudomonas aeruginosa

Décrit ici est un procédé rapide et efficace pour la reconstitution fonctionnelle de type sauvage purifiée et une protéine de CFTR mutante qui conserve l'activité de ce canal de chlorure, qui est défectueux dans la fibrose kystique. Efflux d'iodure de protéoliposomes reconstituées médiées par CFTR permet des études de l'activité du canal et les effets de petites molécules.

Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

Le protocole présenté décrit l’analyse du transport médié par les protéines membranaires au niveau du transporteur unique à l’aide de bicouches lipidiques sans solvant couvrant les pores. Ceci est réalisé par la création de puces de réseaux de nanopores produites en vrac, combinée à l’acquisition et à l’analyse de données hautement parallèles, permettant la mise en place future de criblages effecteurs de protéines membranaires.

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Nous décrivons un test basé sur la fluorescence pour mesurer le brouillage des phospholipides dans de grands liposomes unilamellaires reconstitués avec de l’opsine.

Un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase Activité

Ce protocole décrit les techniques utilisées pour déterminer les structures de canal d’ion par cryo microscopie électronique, y compris un système baculovirus utilisé pour exprimer efficacement gènes dans des cellules de mammifères avec le minimum d’effort et de toxicité, d’extraction de protéine, de purification, contrôle qualité, préparation des échantillons grille et dépistage, ainsi que collecte de données et traitement.

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Nous présentons ici un protocole afin d’étudier le mécanisme moléculaire de la translocation des protons à travers les membranes lipidiques des liposomes unique, à l’aide du cytochrome bo3  à titre d’exemple. Combinant l’électrochimie et la microscopie de fluorescence, les variations de pH dans la lumière des vésicules unique, contenant un seul ou plusieurs enzymes, peuvent être détectés et analysés individuellement.

Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente

Ce protocole décrit la fabrication de liposomes et comment ceux-ci peuvent être immobilisés sur une surface et représentés individuellement d'une manière parallèle massive à l'aide de la microscopie fluorescence. Cela permet de quantifier la taille et l'inhomogénéité compositionnelle entre les liposomes simples de la population.

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Les nanocorps sont des outils importants en biologie structurale et présentent un grand potentiel pour le développement de thérapies. Cependant, la sélection de nanocorps ayant des propriétés inhibitrices peut être difficile. Nous démontrons ici l’utilisation de l’électrophysiologie à membrane solide (SSM) pour la classification des nanocorps inhibiteurs et non inhibiteurs ciblant les transporteurs membranaires électrogéniques.

Sélection de nanocorps inhibiteurs ciblant les transporteurs par électrophysiologie à membrane solide (SSM)

Nous présentons une méthode rentable pour évaluer la perméabilité de la membrane liposomale avec une sensibilité et une résolution supérieures aux techniques conventionnelles. À l’aide d’une nouvelle réaction de substitution de ligand encapsulé, cette technique détecte les changements induits par la phospholipase A2 dans les membranes modèles. Facilement intégrée aux analyses standard, cette approche accessible améliore la résolution pour l’étude de la biophysique membranaire et des...

Essai de perméabilité de la membrane des liposomes pour étudier les effets des groupes phosphate de phosphatidylinositol sur l’action membranotrope du venin PLA2

Découvrez un protocole d'efflux basé sur des protéoliposomes pour mesurer quantitativement l'activité de transport des canaux et transporteurs de chlorure reconstitués. Cette méthode permet de déterminer le taux de transport unitaire et la stochiométrie du complexe protéique actif avec précision.

Un protéoliposome-Based Assay Efflux pour déterminer les propriétés unique molécule de Cl

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