Modélisation du cycle de vie du virus Ebola Sous biosécurité de niveau 2 Conditions de particules de type viral contenant Tetracistronic minigénomes

L'objectif général de l'expérience suivante est de modéliser le cycle de vie du virus Ebola hautement pathogène dans des conditions de niveau de biosécurité deux. Cela est réalisé en produisant des particules pseudovirales, qui possèdent la même composition protéique que les particules du virus Ebola, mais qui contiennent un mini génome au lieu du génome viral. Un mini génome est une version miniature du génome viral dans laquelle les gènes viraux ont été supprimés et remplacés par un gène rapporteur tel que la luciférase.

Il est important de noter que le mini génome utilisé pour cette expérience conserve également un certain nombre de gènes viraux, qui codent pour les protéines virales VP40, GP-1,2 et VP24. Des particules pseudo-virales sont produites en exprimant un mini génome dans des cellules 293T appelées cellules productrices, conjointement avec les protéines virales NP, VP35, VP30 et L, qui ensemble sont également appelées protéines RNP.

Le mini génome est ensuite répliqué et transcrit en ARNm par les protéines virales. Les ARNm codent pour le rapporteur luciférase et les protéines virales supplémentaires VP40, GP-un-deux et VP24. Ensemble, ces trois protéines conduisent à la production de particules pseudovirales, appelées particules pseudovirales compétentes pour la transcription et la réplication, ou TRVLPs, car les nucléocapsides qu'elles contiennent sont capables de répliquer et de transcrire le génome. Étant donné que les TLPs portent la glycoprotéine GP-un-deux du virus Ebola, elles sont capables d'infester les cellules cibles.

Ces cellules cibles ont été préalablement transfectées avec un plasmide d'expression pour np, VP35, VP30 et L. Ensemble, ces protéines du RNP reconnaissent le mini génome qui a été introduit dans les cellules cibles à l'intérieur des TRVLP. Le mini génome est ensuite répliqué et transcrit, entraînant une activité rapporteur ainsi que la production de nouveaux TRVLP, qui peuvent à nouveau être utilisés pour infecter de nouvelles cellules cibles.

Importamment, le mini génome ne contient pas l'information génétique nécessaire à sa réplication. Par conséquent, les TRVLPs ne peuvent pas infecter de manière productive des cellules qui n'expriment pas les quatre protéines du RNP. Cela rend le système sûr à utiliser dans des conditions de niveau de biosécurité deux.

Le principal avantage de cette méthode est qu'elle nous permet de modéliser l'ensemble du cycle de vie du virus, y compris la réplication du génome, l'expression des produits géniques viraux, la production de particules virales et l'infection de cellules cibles au cours de plusieurs cycles d'injection de facteurs, sous des conditions de niveau de biosécurité 2. Cela signifie que ces travaux peuvent être réalisés sans laboratoire de confinement maximal, qui serait autrement nécessaire pour manipuler des virus Ebola vivants. Cette méthode peut être combinée à d'autres techniques, telles que l'interférence ARN pour la diminution des facteurs cellulaires ou leur surexpression, afin d'étudier le rôle de ces facteurs en biologie virale. De plus, nous pouvons introduire des mutations dans les gènes viraux afin d'étudier le rôle de ces gènes viraux et de leurs produits en biologie virale.

Faire la division des cellules en éliminant le milieu des cellules 293T ayant une confluence de 80 à 90 %, en les lavant deux fois avec du PBS et en ajoutant deux millilitres de trypsine aux cellules. Attendre que les cellules s'arrondissent.

Ensuite, les détacher en tapotant le flacon et en ajoutant huit mL de milieu contenant 10 % de FBS aux cellules. Compter les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé, puis diluer les cellules à deux fois 10⁵ cellules par millilitre et ensemencer deux mL dans chaque puits d’une plaque de six puits. Remettre les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂. Après 24 heures, transfecter les cellules avec les plasmides nécessaires à la production de particules virales pseudotypées (TRVLPs). Dans une cabine de sécurité biologique (BSC), prélever le ADN à l’aide d’une pipette et le transférer dans un tube en utilisant des embouts filtrants. Comme témoin négatif, dans un puits, omettre le plasmide codant pour la polymérase virale L et transfecter à la place un plasmide codant pour la GFP afin de visualiser l’efficacité de la transfection. Ajouter ensuite 100 microlitres de Opti-MEM par puits au ADN. Vortexer le tube puis le centrifuger brièvement.

Ensuite, ajoutez 7,5 microlitres du réactif de transfection transIT LT-one à l'ADN dilué. Vortexez doucement le tube et incubez-le à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, mélangez délicatement le mélange de transfection en aspirant et en rejetant avec une pipette, puis ajoutez 100 microlitres dans chaque puits d'une plaque à six puits, goutte à goutte.

Une fois que vous avez ajouté les complexes de transfection aux cellules, inclinez la plaque vers l'avant et vers l'arrière, puis d'un côté à l'autre. N'agitez pas la plaque en la faisant tourner, car cela entraînerait une transfection inégale. Ensuite, remettez les cellules dans l'incubateur. Vingt-quatre heures après la transfection, retirez le surnageant des cellules. Puis ajoutez quatre millilitres de milieu contenant 5 % de FBS aux cellules et remettez-les dans l'incubateur.

24 heures après la transfection des cellules productrices, diviser les cellules 293T comme décrit précédemment. 24 heures après le fractionnement, les transfecter avec les plasmides codant pour les protéines RNP du virus Ebola, ainsi que Tim-one, qui agit comme facteur d'adhésion pour les virus Ebola. 72 heures après la transfection des cellules productrices et 24 heures après la transfection des cellules cibles, recueillir le surnageant des cellules productrices et le transférer dans un tube de 15 millilitres.

Après avoir récupéré le surnageant, éliminez tout liquide résiduel et ajoutez 250 microlitres de tampon de lyse luminescent sur les cellules, puis incubez-les pendant au moins 10 minutes à température ambiante. Ensuite, mesurez l'activité de la luciférase comme décrit à l'étape trois de cette vidéo. Pendant ce temps, centrifugez le surnageant provenant des cellules productrices pendant cinq minutes à 800 g et à température ambiante.

Ensuite, retirez le milieu des cellules cibles et ajoutez trois millilitres du surnageant clarifié des cellules P-zéro aux cellules cibles. Effectuez cette étape une puits à la fois. Une fois terminé, remettez les cellules cibles dans l’incubateur. 24 heures après l’infection.

Éliminer le surnageant des cellules cibles. Ensuite, ajouter quatre millilitres de milieu contenant 5 % de FBS aux cellules et les replacer dans l'incubateur. Pour déterminer l'activité du rapporteur dans les cellules productrices ou cibles, ces cellules sont récoltées 72 heures après la transfection dans le cas des cellules productrices et 72 heures après l'infection dans le cas des cellules cibles.

Pour ce faire, retirez le surnageant des cellules et ajoutez 250 microlitres de tampon de lyse luminescent aux cellules, puis incubez-les pendant au moins 10 minutes à température ambiante. Si désiré, le surnageant peut être utilisé pour infecter un nouvel ensemble de cellules cibles. Dans ce cas, récoltez le surnageant et infectez les cellules cibles comme décrit à l'étape deux de cette vidéo.

Entre-temps, décongeler 40 microlitres par puits de tampon de dosage de la luciférase et ajouter un centième volume de substrat de luciférase au tampon. Vortexer le réactif de luciférase fini et s'assurer qu'il a atteint la température ambiante avant de poursuivre. Puis, pipeter 40 microlitres de réactif dans une plaque 96 puits blanche opaque. Afin d'éviter les problèmes de crosstalk, il est conseillé de laisser un puits libre entre les puits d'échantillons. Une fois l'incubation de 10 minutes terminée, laver les cellules dans le tampon de lyse par pipetage et transférer le lysat cellulaire dans un tube. Centrifuger les lysats pendant trois minutes à 10 000 g et à température ambiante. Après cela, pipeter 40 microlitres des lysats dans la plaque 96 puits contenant le réactif de luciférase. Incuber les échantillons pendant 10 minutes à température ambiante. Au bout de 10 minutes, mesurer l'activité de la luciférase à l'aide d'un luminomètre. Le temps d'intégration pour la mesure de la luminescence doit être d'une seconde. Avec un luminomètre microplaque Modulus, les signaux de luminescence typiques pour le témoin positif devraient être d'environ 1 × 10⁶ à 1 × 10⁷, tandis que le signal pour le témoin négatif devrait être au moins deux à trois ordres de grandeur inférieur. Lors des passages ultérieurs, l'activité du rapporteur dans les témoins positifs devrait rester stable, tandis que l'activité du rapporteur dans les témoins négatifs devrait chuter au niveau du bruit de fond.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de produire des particules pseudovirales compétentes pour la réplication et la transcription du virus Ebola, de les utiliser pour infecter des cellules cibles et de mesurer l'activité du marqueur dans les cellules productrices et les cellules cibles.

Il est important de noter que cette méthode peut être combinée à d'autres techniques, telles que l'interférence ARN pour la diminution de facteurs cellulaires, afin d'étudier le rôle de ces facteurs en biologie virale. De plus, on peut introduire des mutations dans les composants viraux utilisés dans cette méthode afin d'étudier le rôle de ces composants dans le cycle de vie du virus Ebola. Des détails expérimentaux supplémentaires et des réactifs spécifiques sont disponibles dans l'article accompagnant cette vidéo.