Name: Un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Découvrez une plateforme de génotypage SNP basée sur MALDI-TOF pour détecter simultanément les traits clés des moustiques vecteurs du paludisme. Cette méthode améliore les stratégies de contrôle et de prévention.

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Nous remercions les Drs. Anthony Cornel et Laura Norris à l&#39;UC Davis et le Dr Katharina Kreppel à l&#39;Université de Glasgow pour fournir des spécimens de moustiques de la Tanzanie. Nous remercions Mme Smita Das et le Dr Douglas Norris de la Johns Hopkins School of Public Health de partager des échantillons de moustiques de la Zambie. Nous remercions également M. Lee V. Millon au Laboratoire de génétique vétérinaire de formation sur la conception de l&#39;essai. Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national de la santé et accorder R01AI 078183 R21AI062929.

1. Amplification par PCR <ol><li> Mélanger tous les amorces de PCR (Voir Tableau supplémentaire S1) dans un microtube de 1,5 ml. Chaque SNP a deux amorces (avant et arrière). Assurez-vous que la concentration de l&#39;action de chaque amorce PCR est maintenue à 100 um. Faire assez mélange d&#39;amorces pour les réactions 500-1000 pour réduire pipetage erreur et le temps sur le banc (Voir Tableau supplémentaire S2). Si vous le souhaitez, pour préparer des aliquotes de 100 à 200 réactions par tube et conserver à -20 ° C. </li><li> Préparer cocktail de PCR tel que décrit dans le protocole du fabricant (tableau 1). Le volume de réaction 96 comprend un surplomb de 20%. Vortex le tube contenant le cocktail PCR légère et centrifuger pendant 30 secondes à 2000 x g. </li><li> Distribuer 3 ul du cocktail PCR dans chaque puits d&#39;une non-jupe plaque de 96 puits. Une pipette de répéteur peut gagner du temps pour ce processus. </li><li> Ajouter 2 ul de l&#39;ADN génomique appropriée de moustiques dans chaque puits. Note: Le processus d&#39;obtention de l&#39;ADN génomique de m<html> tissus osquito (tête / thorax, l&#39;abdomen ou corps entier) est décrite dans les autres littératures 29-32. Choisir un protocole d&#39;extraction d&#39;ADN appropriée pour différencier ceux avec Plasmodium dans le sang (abdomen) à partir de moustiques infectieux (Plasmodium dans la tête / thorax). Nous utilisons généralement l&#39;ADN extrait des parties du corps (tête / thorax ou de l&#39;abdomen) de moustiques, donc la concentration de l&#39;ADN varie de 0.05-2ng / ul. Bien que l&#39;entrée de l&#39;ADN total est inférieur à la recommandation du constructeur (5-10ng / rxn), nous obtenons généralement robuste SNP appelle à partir de 98% des échantillons d&#39;ADN sans amplification du génome entier. </li><li> Sceller la plaque, mélanger délicatement ou vortex et centrifuger pendant 1 min à 370 x g. </li><li> Utiliser le protocole de cyclage thermique suivant pour effectuer l&#39;amplification par PCR: (1) 94 ° C pendant 2 min, (2) 94 ° C pendant 30 secondes, (3) 56 ° C pendant 30 secondes, (4) 72 ° C pendant 1 min (5) répéter l&#39;étape (2) - (4) pendant 45 cycles, (6) 72 ° C pendant 1 min et 4 ° C en attente. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Traitement SAP <ol><li> Préparer la solution d&#39;enzyme SAP dans une plaque à 96 puits (voir le tableau 2). Traiter 96 échantillons en une plaque. Le volume de réaction 96 comprend un surplomb de 20%. </li><li> Vortex le tube de solution enzymatique SAP légère et centrifuger pendant 30 secondes à 2000 x g. Distribuer 2 pi de la solution d&#39;enzyme SAP dans chaque puits. Encore une fois, une pipette de répéteur peut gagner du temps pour ce processus. </li><li> Sceller la plaque, mélanger délicatement ou vortex et centrifuger pendant 1 min à 370 x g. Incuber la plaque comme suit: (1) 37 ° C pendant 40 min, (2) 85 ° C pendant 5 minutes pour inactiver l&#39;enzyme, (3) 4 ° C en attente. A l&#39;achèvement de cette étape, la plaque stocker à -20 ° C avant de poursuivre. Traitement de la plaque stockée dans les 2 semaines. </li></ol> 3. SNP Extension <ol><li> Si la plaque d&#39;échantillon est gelé après le traitement SAP, lui permettre de dégeler à la température ambiante avant de procéder. </li><li> Préparer le mélange extension d&#39;amorce (tableau supplémentaire S2). Chaque SNP a une exteamorce nsion. Maintenir la concentration de l&#39;action de chaque amorce d&#39;extension à 500 um. Eventuellement, aliquote de 100 à 200 réactions par tube et conserver à -20 ° C. </li><li> Préparer prolongement mélange comme décrit dans le tableau 3. Le volume 96 de réaction comprend un surplomb de 20%. </li><li> Vortex le tube de l&#39;extension cocktail légère et centrifuger pendant 30 secondes à 2000 x g. Distribuer 2 pl du cocktail d&#39;extension dans chaque puits. Encore une fois, une pipette de répéteur peut gagner du temps pour ce processus. </li><li> Sceller la plaque, mélanger délicatement ou vortex et centrifuger pendant 1 min à 370 x g. Thermocycle la plaque, comme le montre la figure 1. À ce stade, procéder à la spectrométrie de masse ou de stocker la plaque à -20 ° C jusqu&#39;à deux semaines. </li></ol> 4. Conditionnement du produit Extension SNP pour optimiser l&#39;analyse de spectrométrie de masse <ol><li> Si la plaque d&#39;échantillon est gelé après l&#39;extension SNP, lui permettre de dégeler à la température ambiante avant de procéder. </li><li> Transférer 15 mg de résine à partir de son contaINER sur la plaque en utilisant une cuillère fossette allongée. Utilisez le grattoir pour répandre la résine dans les puits de la plaque fossette. Balayer le racleur de gauche à droite à travers la plaque fossette de répandre la résine. Assurez-vous qu&#39;il est de la résine dans chaque puits. </li><li> Grattez l&#39;excédent de résine de la plaque fossette d&#39;utiliser le racloir. Laisser reposer la résine dans la coupelle de fossette pendant au moins 20 min. Tout en laissant reposer la résine dans la coupelle de fossette, ajouter 41 ul d&#39;eau de qualité HPLC à chaque puits de la plaque d&#39;échantillons. </li><li> Placez délicatement la plaque d&#39;échantillon à l&#39;envers, sur la plaque fossette. Assurez-vous que les réinitialisations de plaques échantillons contre le petit poste arrondie de la plaque fossette, qui aligne les puits dans la plaque de l&#39;échantillon avec les puits de la plaque fossette. </li><li> Tenir la plaque de l&#39;échantillon et la plaque fossette ensemble, retournez-les délicatement sur tant la résine se situe hors de la plaque fossette dans les puits de la plaque de l&#39;échantillon. Appuyez sur la plaque fossette donc la résine tombe dans la plaque de l&#39;échantillon. Assurez-vous que toute la résine dans le diplaque de mple tombe dans les puits de la plaque d&#39;échantillon. Centrifuger la plaque à 3200 g pendant 30 sec. </li><li> Faire tourner la plaque d&#39;échantillons sur un agitateur pendant 5 min à température ambiante. Rotateur doit tourner la plaque d&#39;échantillons 360 ° autour de l&#39;axe de temps. </li><li> Centrifuger la plaque d&#39;échantillon à 3200 g pendant 5 min. Après cette étape, mémoriser la plaque d&#39;échantillons à -20 ° C jusqu&#39;à 2 semaines avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li></ol> 5. MALDI-TOF spectrométrie de masse <ol><li> Transférer le produit d&#39;extension SNP conditionné sur un BioArray comme SpectroCHIP selon les instructions du fabricant. Nous utilisons MassARRAY Nanodispenser pour cette étape. </li><li> Une fois le transfert terminé, définir comment essais et plaques doivent être mis en place dans la base de données de test. Nommez le dosage et les plaques de telle sorte que chaque plaque a identificateur unique qui relie à la conception de test spécifique (tableau supplémentaire S3). </li><li> Après analyse et la plaque ont été définis, d&#39;acquérir des spectres en utilisant un spectromètre de masse. </li></ol><ol><li> Effectuer l&#39;analyse des données en utilisant une analyse PCR logiciels d&#39;interprétation de données en temps réel telles que typer Analyzer ou TyperViewer (Sequenom). Obtenir des données dans le format .xml qui contient la disposition de l&#39;échantillon, spectrogramme de masse pour chaque puits, les informations de marqueur y compris le nom, la masse attendue pour chaque variante du SNP correspondant, et toute erreur ou des messages d&#39;avertissement associés à chaque réaction. Voir Figure 2 pour le spectrogramme de masse résultante. </li><li> Procéder à une analyse de clustering SNP génotype en fixant le seuil de détection (de magnitude ou rapport signal sur bruit) et la tolérance / variance autorisé pour chaque génotype. La figure 3 montre un exemple de 04707-KDR # 2 SNP grappes génotypiques. </li><li> Exporter les appels résultant SNP génotype dans un tableur. </li></ol>

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<li>Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+the+Sequenom+MassARRAY+iPLEX+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform.</a> Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).</li>
<li>Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+MassARRAY+technology+for+high+throughput+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).</li>
<li>Wright, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+MassARRAY+spectrometry+%28iPLEX%29+produces+a+fast+and+economical+test+for+56+familial+hypercholesterolaemia-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations.</a> Clin Genet. 74, 463-468 (2008).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+of+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae.</a> PLoS Biol. 3, e285(2005).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-population-specific+selection+and+differentiation+between+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).</li>
<li>Stump, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-proximal+differentiation+and+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).</li>
<li>Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+for+high-throughput+genotyping+of+Anopheles+arabiensis+in+East+and+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa.</a> J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).</li>
<li>Holt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li>
<li>Lawniczak, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+divergence+between+incipient+Anopheles+gambiae+species+revealed+by+whole+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences.</a> Science. 330, 512-514 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le MDA est composé de cinq étapes principales: amplification PCR, phosphatase alcaline de crevette (SAP) réaction, vulgarisation SNP, produit d&#39;extension conditionnement et laser assistée par matrice de désorption / ionisation - temps de vol (MALDI-TOF) spectrométrie de masse 33-37. La première étape d&#39;amplification PCR amplifie l&#39;ADN flanquant chaque SNP sorte que l&#39;ADN matrice assez sera disponible à l&#39;étape d&#39;extension SNP. La réaction de SAP neutralise dNTP non utilisées qui peuven...

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii et Anopheles gambiae sont les principaux vecteurs responsables de la transmission du paludisme en Afrique 1. Ces trois espèces sont morphologiquement indiscernables 2 et ne peuvent être distingués par des analyses moléculaires 9.3. En outre, il existe de nombreux tests en aval régulièrement menées pour faciliter les études de génétique épidémiologique et de la population. Il se agit notamment (1) un test de génotypage pour les îles de spéciation 10-12, (2) un test de génotypage reconnaissant SNP non synonymes dans le 1014 ème acide aminé en position de codon du gène par (la résistance knock-down, ou KDR, SNP) 13 -18, (3) la détection des parasites PCR 19-23, et (4) le dépistage de l&#39;ADN spécifique de l&#39;hôte dans estomacs de moustiques 24,25. Nous avons développé un essai multi-détection (MDA) qui combine tous ces essais dans une réaction multiplex unique avec l&#39;objectif d&#39;unealyzing caractéristiques épidémiologiques importantes de vecteurs du paludisme en Afrique. Le dosage MDA comprend plusieurs marqueurs de détection (1) espèce (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, ou autres (aucun des trois)), (2) la résistance aux insecticides représentés dans kdr SNP (deux L1014F et L1014S) , (3) la présence de deux grandes parasites du paludisme, Plasmodium falciparum et P. vivax, et (4) une source aviaire et six sang des hôtes mammifères. Traditionnellement, ces essais ont été réalisés dans des réactions en chaîne par polymérase séparées. Lorsque tous ces essais sont effectués en utilisant une plate-forme PCR conventionnelle, il faut mener 8-10 dosages PCR de réaction et l&#39;accompagnement des mesures d&#39;électrophorèse en gel. Chaque réaction individuelle PCR de la préparation à la documentation des résultats prend 4-5 h, alors que la méthode MDA présenté ici prend environ 5 heures en totalité. Ceci est équivalent à un 90% d&#39;économies sur les seuls coûts de main-d&#39;œuvre. Le MDA présentée ici coûte 5 $par échantillon pour génotyper les 33 SNP. Ce est beaucoup moins cher que les tests à base de gel agarose simples, qui coûte environ 1,50 $ par échantillon. Dosages de détection toutes les caractéristiques couvertes par le MDA exigerait un minimum de 8 à 10 essais à base de gel agarose distincts à un coût de 12 à 15 $ par échantillon. En outre, le MDA diminue considérablement le risque de génération d&#39;un faux positif ou négatif par l&#39;utilisation d&#39;au moins trois marqueurs pour chaque détection de parasite ou de la source hôte. La plate-forme nous avons utilisé est pas limitée aux vecteurs du paludisme, mais peut être utilisé dans une grande variété d&#39;applications telles que la médecine, de la médecine vétérinaire et de la biologie de base de 26 à 28. Des études approfondies d&#39;association ou la génétique des populations études impliquant un grand nombre (dans l&#39;ordre de 100s) des échantillons nécessitent des essais rentables dépistage de marqueurs multiples simultanément. La plupart des études qui utilisent deux ou plusieurs tests de PCR séparées puissent appliquer la MDA pour des résultats plus rapides à un coût moindre. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>Spectrométrie</td><td></td><td></td> de <td>masse MALDI-TOF pour les applications génomiques afin d’analyser les acides nucléiques.</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodispenser</td><td>Sequenom</td><td>RS1000</td><td>Transfère les produits de réaction iPLEX terminés vers le SpectroCHIP</td></tr><tr><td>iPLEX Gold Genotyping Reagent</td><td>Set Sequenom</td><td>10158</td><td>Réactifs utilisés pour le test iPLEX, y compris le kit SAP.</td></tr></tbody></table>

un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Le complexe d&#39;espèces Anopheles gambiae comprend le principal moustiques transmettent le paludisme en Afrique. Parce que ces espèces sont d&#39;une telle importance médicale, plusieurs traits sont généralement caractérisés par des tests moléculaires pour aider dans les études épidémiologiques. Ces caractéristiques comprennent l&#39;identification des espèces, la résistance aux insecticides, l&#39;état de l&#39;infection par le parasite, et de préférence d&#39;hôte. Comme les populations du complexe Anopheles gambiae sont morphologiquement indiscernables, une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est traditionnellement utilisée pour identifier les espèces. Une fois l&#39;espèce est connue, plusieurs essais sont régulièrement effectuées en aval pour élucider d&#39;autres caractéristiques. Par exemple, des mutations connues sous le nom de KDR dans un gène par confèrent une résistance contre le DDT et les pyréthrinoïdes. En outre, les dosages d&#39;enzyme-linked immunosorbent (ELISA) ou Plasmodium essais de PCR de détection de l&#39;ADN du parasite sont utilisés pour détecter les parasites présents dans les tissus de moustiques. Enfin, une combination de la PCR et digestion de l&#39;enzyme de restriction peut être utilisée pour élucider préférence de l&#39;hôte (par exemple, humain contre le sang animal) par criblage de la farine de sang de moustique pour l&#39;ADN spécifique à l&#39;hôte. Nous avons développé un essai multi-détection (MDA) qui combine tous les tests mentionnés ci-dessus dans un seul multiplex 33SNPs réaction de génotypage pour 96 ou 384 échantillons à la fois. Parce que le MDA comprend de multiples marqueurs pour les espèces, Plasmodium détection, l&#39;identification et de l&#39;hôte dans le sang, la probabilité de générer des faux positifs ou négatifs est fortement réduite à partir de dosages précédentes comprenant un seul marqueur par trait. Ce test robuste et simple peut détecter ces traits de moustiques clés rentable et en une fraction du temps de tests existants.

L&#39;identification des espèces: Les cinq SNP suivants ensemble identifient trois espèces (A. arabiensis, A. et A. gambiae coluzzii) (tableau 4). Si un échantillon ne est pas l&#39;une des trois espèces, les trois SNP (01073-213, 04679-157 et 10313 -052) ne parviennent pas à amplifier. kdr génotype pour déduire la résistance aux insecticides: Le 1014 ème codon d...

Les moustiques transmettant le paludisme présentent un certain nombre de caractéristiques épidémiologiquement importantes qui ne peuvent être détectées qu’à l’aide de techniques moléculaires. À l’aide d’une plateforme de génotypage SNP basée sur MALDI-TOF, nous avons mis au point un test permettant de détecter simultanément plusieurs traits clés (espèce, résistance aux insecticides, infection parasitaire et choix de l’hôte) des vecteurs du paludisme.

Un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

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Croisements génétiques des parasites du paludisme chez les rongeurs sont effectuées en alimentant deux des parasites génétiquement distinctes pour les moustiques. Recombinant progéniture clonée à partir de sang de souris après avoir laissé les moustiques de mordre des souris infectées. Cette vidéo montre comment produire des croisements...

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Les immunodosages à fluorescence multiplex deviennent une référence pour les tests sérologiques. Leur application est toutefois limitée par la complexité et le temps nécessaire des processus de couplage bile-analyte. Ce rapport présente un protocole de couplage de microsphères multiplexes semi-automatisé et reproductible, comparable à la méthode standard, tout en réduisant considérablement le temps d’obtention des résultats.

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Découvrez une plateforme de génotypage SNP basée sur MALDI-TOF pour détecter simultanément les traits clés des moustiques vecteurs du paludisme. Cette méthode améliore les stratégies de contrôle et de prévention.

Un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme

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