Name: Méthodologie synthétique pour asymétrique Ferrocene dérivés Systems Bio-conjugués via solide méthodologie à base de résine de phase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Découvrez la synthèse de bioconjugués ferrocène-biotine asymétriques par méthode en phase solide sur résine. Cette technique simplifie la purification et permet l'immobilisation efficace sur surfaces d'or pour applications en biodétection.

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KG a été soutenu par la Fondation RA Welch subvention P-1760, TCU Institut Andrews de mathématiques et de sciences de l&#39;éducation (à KG), TCU recherche et la créativité Activité Grant (à KG) et TCU SERC Grant (à JHS).

1. Synthèse de biotine-Fc-cystéine (1) <ol><li> Des procédés en phase solide pour produire une résine liée. <ol><li> Placez biotine résine chargée (250 mg, 0,145 mmol) dans une seringue fritte et gonfler la résine par l&#39;élaboration de diméthylformamide (5 ml) et en secouant la seringue sur un agitateur de laboratoire pendant 20 min. Expulser la solution et répéter diméthylformamide gonflement une fois de plus. </li><li> Éliminer le groupe protecteur Fmoc en ajoutant 6/4 ml de pipéridine à 20% dans du diméthylformamide à la seringue 10 à 15 min suivi par des secousses. Répétez le processus de déprotection avec un autre 4-6 ml de pipéridine. Laver la résine avec une séquence de 3 x diméthylformamide, 3x diméthylformamide: methanol (1: 1), du methanol 3x: dichlorométhane (1: 1), 3x dichlorométhane, ~ 5 ml chacune. Faites un test à la ninhydrine (+) sur un petit échantillon (~ 10) des perles pour confirmer déprotection succès par la présence de bleu lors du chauffage. </li><li> Mélanger une solution contenant de l&#39;acide Fmoc-1&#39;-amino-ferrocène-1-carboxylique(203,3 mg, 0,4350 mmol), de 1-hydroxybenzotriazole hydraté (58,8 mg, 0,413 mmol), de diisopropylcarbodiimide (0,0673 ml, 0,435 mmol), diisopropyl éthyl amine (0,0757 ml, 0,435 mmol) et un mélange 4: 1 de dichlorométhane et diméthylformamide. Dessiner cette fritté dans la seringue et agiter doucement sur un agitateur de laboratoire pendant 6 heures. Ensuite, expulser la solution de la seringue et laver comme décrit précédemment. </li><li> Effectuer le test ninhydrine (-) tel que décrit ci-dessus pour confirmer accouplement. Le test à la ninhydrine peut encore être utile pour confirmer couplage malgré la couleur orange de la bille provenant de la fixation de la fraction contenant le fer. </li><li> Ensuite éliminer le groupe Fmoc par l&#39;addition de 20% de pipéridine dans du diméthylformamide et on l&#39;a lavé comme décrit ci-dessus. Le test à la ninhydrine (de +) doit être utilisé pour confirmer la suppression Fmoc. </li><li> Préparer une solution composée de Fmoc-Cys (Trt) -OH (254,8 mg, 0,4350 mmol), 1-hydroxybenzotriazole hydraté (58,8 mg, 0,4125 mmol), diisopropylcarbodiimide (0,0673 ml, 0,4350mmol), la diisopropylamine d&#39;éthyle (0,0757 ml, 0,4350 mmol) et un mélange 4: 1 de dichlorométhane et le diméthylformamide. Ajouter ce couplage de cystéine cocktail la seringue fritte et secouez doucement pendant 6 heures. Laver en utilisant le protocole décrit précédemment. </li><li> Confirmation du couplage à l&#39;aide du test à la ninhydrine (-), suivi par l&#39;élimination du composant Fmoc avec 20% de pipéridine et de lavage. Vérifiez la borne libre amine utilisant le test à la ninhydrine (+). </li></ol></li><li> Le clivage de la résine à partir de 1. <ol><li> Faire une solution de TFA (9,45 ml), l&#39;eau (0,25 ml), le 1,2-éthanedithiol (0,25 ml), et triisopropyl silane (0,1 ml), ajouter à la seringue et agiter doucement pendant 4 heures. </li><li> Recueillir la solution rouge-brun résultant dans un tube Eppendorf et évaporer le TFA lentement en utilisant un courant d&#39;air. </li><li> Ajouter de l&#39;éther diéthylique froid (~ 15 ml) au tube Eppendorf pour précipiter 1, qui formera une agitation douce. Isoler le produit par centrifugation (1 g, 5 min). Tcycles de répétition de poule de lavages à l&#39;éther de diéthyle (~ 60 ml au total) et la centrifugeuse afin d&#39;obtenir une forme d&#39;un solide rouge / brun. </li></ol></li></ol> 2. Caractérisation et analyse des 1 <ol><li> Se assurer que l&#39;identité correspond à la connectivité et la composition représentée sur la figure 2 en utilisant 1 H (16 scans) et 13C-RMN (512 scans) dans du methanol deutéré (300 ul) et l&#39;analyse par ESI-MS. Attendez les résultats suivants: Spectre RMN 1 H (CD 3 OD) δ / ppm: 1,407 à 1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665 à 3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4,104 (d, 2H ), 4,274 (q, 1H), 4,426 (d, 2H), 4,479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) et le spectre 13 C-RMN (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH 2), 28.300 (CH 2), 35,474 (CH 2), 38.698 (CH 2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (Cp-ring), 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-ring), 66,038 / 66,170 (Cp-ring), 69,153 / 69,328 (Cp-ring), 71,468 / 71,593 (Cp-ring), 76,466 (CH), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). ESI-MS (m / z): Trouvé: 639,00 [1 + Na] +, théorique: 639,1 [1 + Na] + et HR-MS (m / z): trouvé: 617,2049 [1 + H] +, théorique: 617.1622 [1 + H] +. </li><li> Effectuer HPLC, analyse élémentaire pour confirmer la composition de isolée 1. Effectuer des chromatogrammes HPLC en utilisant une colonne C8 à phase inversée avec 100% de MeOH à un débit de 0,5 ml / min. Remarque: temps de rétention de HPLC étaient: 3,198 à 4,674 min. </li></ol> 3. Immobilisation de 1 sur une surface d&#39;or <ol><li> polymère Cut soutenu diapositives or en carrés de ~ 0,25 en deux. </li><li> Remplir un bécher de 50 ml avec une solution d&#39;eau DI de 1 (~ 1 mM). </li><li> Ajouter la lame d&#39;or dans le bécher et couvrir avec un verre de montre. Tousow la lame de verre à incuber O / N à température ambiante sans agitation. </li><li> Retirez la lame d&#39;or de la solution et permettre sécher à l&#39;air. </li><li> Obtenir la numérisation d&#39;images de microscopie électronique en utilisant un microscope électronique à balayage (ou équivalent) pour observer une immobilisé. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La synthèse des dérivés de ferrocene asymétriques est difficile en solution. Par exemple, les tentatives pour produire une solution dans abouti à de faibles rendements en le produit désiré (moins de 20%). De même, les réactions utilisant 1&#39;-amino-ferrocene carboxylique (sans résine Fmoc) et la biotine lié conduit à un produit insoluble accord avec le produit polymérisé rapportée par Baristic et al. et le produit minime. 47 Ce est encore compliquée par le ferrocène et ses...

Biocapteurs sont de petits appareils qui utilisent la technologie de reconnaissance biomoléculaire comme plate-forme pour l&#39;analyse sélective et sont utilisés pour leur spécificité, la vitesse et à faible coût. Biocapteurs électrochimiques pour la détection de biomolécules sont à la pointe de ce domaine en raison de leur simplicité, de l&#39;efficacité des coûts, et une sensibilité élevée. 1,3 L&#39;anatomie générale de ces capteurs est une électrode équipé d&#39;une molécule de reconnaissance spécifique pour le marqueur biologique d&#39;intérêt . La liaison du marqueur biologique par la molécule de reconnaissance se traduit par un changement local de potentiel ou de courant qui peut être détecté par une simple mesure. Jusqu&#39;à présent, le fragment de reconnaissance peut varier de enzymes, anticorps 4-8, 9-12, 13-16 cellules entières récepteurs, 17-20 21-23 peptides et d&#39;ADN 24 et ont largement porté sur grosses molécules biologiques. 25-28 de recherche efforts dans ce domaine se sont concentrés principalement sur immunocapteurs WHere une immunoglobuline est immobilisée avec un noyau actif redox (tel que le ferrocène) et utilisé pour détecter un anticorps d&#39;intérêt. Ces études ont été exclus des applications cliniques en raison d&#39;une mauvaise précision et la consommation de temps découlant des complications découlant de l&#39;utilisation de l&#39;antigène / anticorps. 1,3 Une attention croissante a mis l&#39;accent sur ​​la détection de petites molécules (moins de 1 kg / mol) de la recherche biomédicale , de la nourriture et de l&#39;intérêt de l&#39;environnement, en plus de la sécurité nationale. 29 Les exemples les plus connus de dispositifs de biocapteurs sont auto-test moniteurs de glucose, qui ont sérigraphiées électrodes enzymatiques couplés à un mètre ampérométrique poche. Ces systèmes utilisent généralement une méthode coulométrique où la quantité totale de charge générée par la réaction d&#39;oxydation du glucose est mesurée sur une période de temps. Dispositifs de placement doivent être portable, robuste et de la main-lieu de faire usage facile pour la population en général. Balises d&#39;oxydoréduction telles que ferrocène sont nécesry de fournir la détection électrochimique de biomarqueurs ou de petites molécules en solution comme la plupart des biomarqueurs ne sont pas intrinsèquement électrochimiquement active. 30-38 Ferrocene est une molécule organométallique qui est une norme d&#39;or pour l&#39;électrochimie, ce qui en fait un excellent choix pour l&#39;intégration dans des biocapteurs électrochimiques. espèces actives redox à base de ferrocène-ont déjà attiré l&#39;attention considérable en raison de leur petite taille, une bonne stabilité, un accès synthétique pratique, modification chimique facile, lipophilie relative, et la facilité de réglage redox. 3,30-42 petites molécules basé sur le noyau de ferrocène ont été largement utilisés comme détecteurs d&#39;ions métalliques et de petites molécules. 32-38,43 systèmes de ciblage tels que les espèces plus grandes biomolécules ont utilisé la fixation d&#39;anticorps ou d&#39;immunoglobulines grandes aux dérivés du ferrocene qui ont été intégrés sur une surface électrochimique. 1,3,39 , 44 Dans chaque cas, l&#39;intensification potentielle et actuelleté du couple redox Fe III / Fe II a été modifié lors du couplage moléculaire, produisant ainsi une nouvelle poignée spectroscopique indiquant la présence de la molécule d&#39;analyte. Cette variation résulte de l&#39;étendue de chevauchement qui se produit entre le système pi-des noyaux cyclopentadiényle et les orbitales d de fer. Si le système de PI est modifiée, ce est à dire, dérivé ou réagi, puis l&#39;interaction orbitale, à son tour, le changement. Ceci affectera le noyau Fe et peut être observé comme un changement dans le potentiel du couple Fe III / Fe II. 40,45,46 Ces propriétés rendent un tel système attractif pour une utilisation en tant qu&#39;agent de quantification dans un dosage immunologique ou électrochimique biocapteur. Afin de produire des systèmes de ferrocène contenant spécifiques pour les capacités de biocapteurs il est optimal pour modifier une bague de Cp avec le bio-récepteur spécifique pour une molécule cible et d&#39;utiliser l&#39;autre anneau Cp comme une attache moléculaire pour la lecture électrochimique ou electrode (Figure 1). La synthèse de ces dérivés de ferrocene asymétriques est contestée par des réactions secondaires et la formation d&#39;espèces dimères et polymères formés par réticulation intermoléculaire. 47 Toutefois, le couplage chimie produisant une liaison amide est la route la plus directe pour fournir des dérivés simples de ferrocène impliquant composants biologiques tels que des peptides et de leurs métabolites. Par conséquent, les techniques de première phase solide développés dans les années 1950 par Merrifield pour la synthèse peptidique peuvent être appliquées à des composés organométalliques contenant du ferrocène. Grâce à l&#39;utilisation de la molécule d&#39;acide 1&#39;-Fmoc-amino-ferrocène-1-carboxylique orthogonalement substitué, un système de ferrocène qui peut contenir un fragment de récepteur (biotine), lecture électrochimique (ferrocène) et le composant de blocage de segment de liaison (cysteine) présente été construit et détaillé ici. La synthèse de ce bio-conjugué est traité ainsi que des preuves pour l&#39;immobilisation sur une surface d&#39;or. Ce représen de travailts la première présentation d&#39;un système composé de biotine, ferrocène et un acide aminé pour l&#39;immobilisation sur une surface d&#39;or.

<table><tbody><tr><td>Biotine Novatag Résine</td><td>NovaBiochem</td><td>8550510001</td><td></td></tr><tr><td>TORVIQ 10 ml Luer Lock Seringue frittée</td><td>Fisher</td><td>NC9299151</td><td></td></tr><tr><td>pipéridine</td><td>Acros</td><td>P/3520/PB05</td><td></td></tr><tr><td>test de ninhydrine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017-1ea</td><td></td></tr><tr><td>1'-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid</td><td>Omm Scientific</td> Special <td>Order</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime ; -Diisopropylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D125407-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Novabiochem</td><td>8520080025</td><td></td></tr><tr><td>acide trifluoroacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5408</td><td></td></tr><tr><td>1,2-éthanedithiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>silane triisopropylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes (20 ml)</td><td>Toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Toute source</td><td></td><td>Sécher avec des tamis moléculaires Avant utilisation & Stocker dans un flacon de 100 ml pour une utilisation facile</td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>Toute source</td><td></td><td>Sécher avec des tamis moléculaires Avant utilisation & Stocker dans un flacon de 100 ml pour une utilisation facile</td></tr><tr><td>Diméthylformamide</td><td>N’importe quelle source</td><td></td><td>sécher avec des tamis moléculaires avant utilisation & Conserver dans un flacon de 100 ml pour</td></tr> une <tr><td>utilisation facile centrifuger</td><td>n’importe quelle source</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

méthodologie synthétique pour asymétrique ferrocene dérivés systems bio-conjugués via solide méthodologie à base de résine de phase

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Une détection précoce est la clé de la réussite du traitement de la plupart des maladies, et il est particulièrement indispensable pour le diagnostic et le traitement de nombreux types de cancer. Les techniques les plus courantes sont utilisées modalités d&#39;imagerie telles que imagerie par résonance magnétique (IRM), par émission de positrons Topographie (PET), et calculé Topographie (CT) et sont optimales pour la compréhension de la structure physique de la maladie, mais ne peuvent être effectués une fois tous les quatre à six semaines en raison de l&#39;utilisation d&#39;agents d&#39;imagerie et le coût global. Dans cet esprit, le développement de «point de service» techniques, telles que biocapteurs, qui évaluent le stade de la maladie et / ou l&#39;efficacité du traitement dans le bureau du clinicien et le faire d&#39;une manière opportune, allait révolutionner les protocoles de traitement. 1 Comme un moyen d&#39;exploration de base de ferrocène biocapteurs pour la détection de molécules d&#39;intérêt biologique 2, des méthodes ont été développées pour produire des bio-conjugués du ferrocène-biotine décrits ici. Ce rapport mettra l&#39;accent sur un système biotine-ferrocène-cystéine qui peut être immobilisé sur une surface d&#39;or.

La forme liée de résine de 1 est représenté sur la Figure 2. La fixation covalente du composant de ferrocène donne lieu à une teinte orange sur les perles de résine qui est persistante avec lavage en continu et indicatif d&#39;un fer immobilisé contenant le complexe plutôt que l&#39;absorption du fer par le composant PEG de la perle de résine. La forme d&#39;une sans résine est identique en couleur pour les billes de résine. Après l&#39;élimination du composé de la rési...

La synthèse d’espèces asymétriques de ferrocène est un défi à l’aide de techniques de solution. Ce rapport se concentre sur les méthodes mises en œuvre pour produire un bioconjugué ferrocène-biotine à l’aide de réactions simples et propres réalisées par synthèse en phase solide. Il est démontré que l’incorporation d’un fragment thioléate confère la capacité d’immobilisation sur les surfaces aurifères.

Méthodologie synthétique pour asymétrique Ferrocene dérivés Systems Bio-conjugués via solide méthodologie à base de résine de phase

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire des conjugués asymétriques de ferne, biotine, bio qui peuvent être immobilisés sur une surface en or. Cela est réalisé par la synthèse du conjugué ferne-biotine-bio sur une résine en phase solide. Dans une deuxième étape, le conjugué est éliminé de la résine, ce qui permet l'isolement et la caractérisation du composé.Ensuite, le bioconjugué est incubé avec une surface en or afin de permettre l'adhésion des thiolates à l'or. Les résultats montrent qu'un bioconjugué ferne peut être produit avec un bon rendement et une bonne pureté, puis immobilisé sur une surface en or. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les méthodes en solution, est que la purification est simple et directe.En plus d'éviter les sous-produits générés par les méthodes en solution, nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en réfléchissant à l'efficacité et à l'aspect pratique des capteurs de glucose utilisés pour surveiller les patients diabétiques. Cette procédure sera démontrée par Sean Rodich de mon laboratoire, et par Paulina Gonzalez, étudiante de licence et étudiante diplômée respec

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