Name: Léquilibre de sédimentation dune Membrane Protein Petit Oligomer formation: Effet de lhistidine Protonation sur pentamériques stabilité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Découvrez l'équilibre de sédimentation pour étudier la formation d'oligomères de protéines membranaires et leur stabilité pentamérique selon le pH. Cette méthode révèle l'effet de la protonation de l'histidine sur les interactions protéiques virales.

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Ce travail a été financé par la subvention de la Fondation nationale de la recherche NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) et la subvention de niveau 1 RG 51/13.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce document fournit un protocole expérimental pour la préparation et l&#39;analyse d&#39;oligomérisation d&#39;une petite protéine membranaire dans un détergent en utilisant l&#39;équilibre sédimentation échantillon. Le protocole décrit est également valable pour simpler- -et protéines solubles, comme l&#39;étape d&#39;adaptation de la densité ne est pas nécessaire. En effet, le système est constitué par un mélange de détergent et de protéines. Pour réaliser des études de sédimentation, le détergent doit être invisible ...

Ultracentrifugation analytique 1-5 est une des méthodes les plus importantes pour étudier les interactions des macromolécules dans des conditions physiologiques, étant accessibles à la fois aux interactions faibles et forts. Le procédé est sans marqueur et utilise l&#39;absorption de lumière ou d&#39;interférences, et même des systèmes optiques de fluorescence peut être utilisée pour accéder à des plages de concentration de plusieurs ordres de magnitude 6. Cette méthode est particulièrement utile étant donné que la plupart des processus biochimiques dépendent des interactions réversibles. La stoechiométrie et la force de ces interactions doivent être caractérisée quantitativement à comprendre des processus biologiques, et un certain nombre de méthodes existent à cette fin 7, 8. Cependant, les interactions transitoires sont difficiles à étudier neuf. Le choix d&#39;une méthode pour caractériser les interactions macromoléculaires dépend de sa nature statique ou dynamique. Dans le premier cas, Sedim<html> vitesse de entation (SV) est utilisé, où le taux de transport radial est mesuré et complexes sont fractionné sur la base des différences de masse flottante et la forme. En revanche, les associations dynamiques qui sont réversibles sur l&#39;échelle de temps de l&#39;expérience ne peuvent pas être physiquement séparés. Dans ce cas, l&#39;auto-hétéro ou interactions conduisant à des interactions non covalentes sont dans un équilibre qui dépend de la concentration totale en protéines. Ces interactions dynamiques peuvent être étudiés à la fois l&#39;équilibre de sédimentation (SE) et de la vitesse de sédimentation (SV) 10. Toutefois, le premier procédé est plus simple à réaliser et est décrite ici. Dans SE, la centrifugation est réalisée à une vitesse suffisamment basse de sorte qu&#39;un équilibre est atteint entre la diffusion et la sédimentation. À ce stade, le profil d&#39;équilibre d&#39;un signal optique (UV-VIS) en fonction de la distance radiale, peut être analysé en utilisant des modèles thermodynamiques prédéfinis pour les associations 11. ve_content &quot;&gt; Dans le présent document, une étude de sédimentation à l&#39;équilibre est présenté de l&#39;auto-association d&#39;une protéine de membrane virale qui forme canaux ioniques. En raison de son caractère hydrophobe, l&#39;expérience est conduite en présence d&#39;un détergent, et dans ce cas, la densité de solvant doit être adaptée à celle du détergent. Cependant, le protocole décrit serait identique dans le cas d&#39;une protéine soluble dans l&#39;eau, à l&#39;exception qu&#39;aucun solvant de recherche de densité serait nécessaire. La protéine utilisée est codé dans le virus respiratoire syncytial humain (hRSV), un pneumovirus enveloppé dans la famille de paramyxoviridae qui cause la maladie des voies respiratoires inférieures chez les nourrissons, les personnes âgées et les populations immunodéprimées dans le monde entier 12. Jusqu&#39;à 64 millions de cas déclarés d&#39;infection hRSV et 160 000 décès surviennent chaque année. Le génome de hRSV transcrit 11 protéines, y compris les trois protéines membranaires F, G, et petite hydrophobe (SH). protéine SH est impliquédans la pathogenèse de l&#39;infection par le VRS. RSV dépourvu du gène SH (de RSVΔSH) était viable, a provoqué la formation de syncytia et a grandi ainsi que le type sauvage (WT) virus 13-16. Cependant, le virus RSVΔSH reproduit 10 fois moins efficace que le WT dans le tractus respiratoire supérieur 15, 16. En outre, le virus a été atténuée dans RSVΔSH chez la souris in vivo et des modèles de chimpanzés 13, 17. La protéine SH est un groupe (sous-groupe de RSV A) 64 ou 65 (VRS sous-groupe B) acides aminés II protéine de membrane intégrale qui se accumule principalement dans les membranes de Golgi le compartiment 18 de type long. protéine SH a une seule prédit une hélice transmembranaire (TM) domaine 19 qui est hautement conservée 20,21. Les domaines de extramembrane C- et N-terminales sont orientées lumenally / extracellulaire et cytoplasmique, respectivement. Les deux domaines TM synthétique (résidus 18-43) Et pleine longueur de protéine SH ont été représentés pour former homopentamers dans une variété de détergents. La forme homopentameric est responsable de l&#39;activité du canal dans des bicouches lipidiques planes 22,23. L&#39;orientation correcte des monomères de TM dans la bicouche lipidique a été déterminée en utilisant le site dichroïsme infrarouge spécifique 23, qui a montré Sa-22 pour être dans un luminal, près de inter-hélicoïdale, l&#39;orientation. Le même domaine TM orientation a été confirmée par des études de RMN qui reconstruit le pentamère un faisceau en hélice de la protéine de pleine longueur dans dodécylphosphocholine (DPC) 22 micelles. Dans ce modèle de «micelles», un seul domaine de TM hélicoïdale a- était flanqué N-terminale par une hélice, et C-terminale par un b-épingle prolongée. Les deux résidus protonables de protéine SH, His-22 et His-51, se trouvent dans le domaine TM (orienté lumenally), et à l&#39;extrémité de la extramembrane β épingle C-terminal (loin du pore du canal), respectivement. Dans un enviro bicellarnement, cependant, la TM α-hélice se étend jusqu&#39;à His-51, et les deux résidus His, sont disponibles à la lumière du canal 24. Structure de canal adopte une architecture en forme d&#39;entonnoir 22, où la région étroite (Ser-29 à Cys-45) 22 est revêtu avec des chaînes latérales hydrophobes (Ile-32, Ile-36 Ile-40 et Leu-44), et Ile-36 définit le point le plus étroit dans la lumière du canal. His-22 est située à la plus grande ouverture de cet entonnoir, alors que His-51 est à l&#39;extrémité de la plus petite ouverture. Dans le présent document, la centrifugation analytique dans un mode de sédimentation à l&#39;équilibre a été utilisée pour déterminer si sa protonation affecte la stabilité de la protéine pentamère SH. Dans ce cas, la protéine SH a été solubilisé dans un détergent C14-bétaïne, qui a été utilisé précédemment pour montrer que les formes de la protéine SH oligomères 22 pentamères.

<table><tbody><tr><td>3-(N,N-diméthylmyristylammonio)propanesulfonate</td><td>Sigma</td><td>T0807</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium 99,8 %</td> <td>Isotope Cambridge</td><td>DLM-4-99.8</td><td></td></tr><tr><td>An-50 Ti Rotor, analytique, 8 places</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>An-60 Ti Rotor, analytique, 4 places</td><td>Beckman Coulter</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>Boîtier de cellule</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>334784</tr><tr><td>Centre de table à six canaux de 12 mm, rempli de charbon de bois Beckman</td><td>Coulter</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>Support de fenêtre</td><td>Beckman Coulter</td><td>305037</td><td></td></tr><tr><td>Joint de fenêtre</td><td>Beckman Coulter</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>Doublure de fenêtre</td><td>Beckman Coulter</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>Fenêtre saphir</td><td>Beckman Coulter</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>Fenêtre en quartz</td><td>Beckman Coulter</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>Rondelle à vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>362328</td><td></td></tr><tr><td>Bague à vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>301922</td><td></td></tr><tr><td>Spinkote</td><td>Beckman Coulter</td><td>306812</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de support de couple</td><td>Beckman Coulter</td><td>361318</td><td></td></tr><tr><td>Contrepoids</td><td>Beckman Coulter</td><td>360219</td><td></td></tr><tr><td>Outil d’alignement cellulaire</td><td>Beckman Coulter</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td></tr><tr><td>HeteroAnalysis&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm</td></tr><tr><td>SEDPHAT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm</td></tr></tbody></table>

l&#39;équilibre de sédimentation d&#39;une membrane protein petit oligomer formation: effet de l&#39;histidine protonation sur pentamériques stabilité

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Ultracentrifugation analytique (AUC) peut être utilisé pour étudier les interactions entre macromolécules réversible sur une large gamme de forces d&#39;interaction et dans des conditions physiologiques. Cela rend AUC une méthode de choix pour évaluer quantitativement stoechiométrie et thermodynamique des homo- et hétéro-association qui sont transitoires et réversibles dans les processus biochimiques. Dans la modalité de l&#39;équilibre de sédimentation (SE), un équilibre entre la diffusion et la sédimentation présente un profil en fonction de la distance radiale qui dépend d&#39;un modèle d&#39;association spécifique. Ici, un protocole détaillé est décrit SE afin de déterminer la taille et de monomère-monomère association énergie d&#39;une petite oligomère de protéine de membrane en utilisant une ultracentrifugeuse analytique. AUC-ES-étiquette est libre, basé uniquement sur des principes physiques, et peut être utilisé sur les deux protéines solubles et membranaires eau. Un exemple est illustré de celle-ci, la petite hydrophobe (SH) à la protéine de virus syncytial respiratoire humain (hRSV), Un polypeptide de 65 acides aminés avec un seul transmembranaire (TM) de domaine α-hélicoïdale qui forme des canaux ioniques pentamères. Sur la base des données de structure RMN montre que la protéine SH a deux résidus His protonable dans son domaine transmembranaire qui sont orientés face de la lumière du canal. SE expériences ont été conçues pour déterminer comment le pH affecte constante d&#39;association et de la taille oligomères de la protéine SH. Bien que la forme pentamérique a été préservée dans tous les cas, sa constante d&#39;association a été réduite à un pH faible. Ces données sont en accord avec un pH dépendance similaire observée pour l&#39;activité des canaux SH, conformément à une orientation luminale des deux résidus His dans la protéine SH. Ce dernier peut éprouver une répulsion électrostatique et la stabilité d&#39;oligomères réduite à faible pH. En résumé, cette méthode est applicable à chaque fois que des informations quantitatives sur les changements subtils association protéine-protéine dans des conditions physiologiques doivent être mesurés.

Le profil radial de distribution de C14SB micelles de détergent dans du Tris 50 mM, NaCl 100 mM pH 7,3, forme un exponentielles très peu profonde qui pourrait être montée sur un modèle linéaire (figure 7A). La pente de cette distribution est inversement corrélée à la concentration de D 2 O (Figure 7B). Le point où la pente est nulle, ce est à dire l&#39;appariement D 2 O concentration, se est révélée être de 32,3%. Voir <strong...

L’équilibre de sédimentation (SE) peut être utilisé pour étudier les interactions protéine-protéine dans un environnement physiologique. Ce manuscrit décrit l’utilisation de cette technique pour déterminer l’effet du pH sur la stabilité d’un homo-pentamer formé par la petite protéine hydrophobe (SH) codée par le virus respiratoire syncytial humain (hRSV).

L&#39;équilibre de sédimentation d&#39;une Membrane Protein Petit Oligomer formation: Effet de l&#39;histidine Protonation sur pentamériques stabilité

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer la taille de l'oligomère formé par un petit polypeptide hydrophobe dans un détergent C14 sulfalane et la stabilité de cet oligomère lorsque le pH est modifié. Cela est réalisé tout d'abord en déterminant quelle concentration d'oxyde de deutérium correspond à la densité des micelles de détergent, annulant ainsi leur flottabilité. Dans un deuxième temps, une série d'expériences d'équilibre de sédimentation est effectuée sur les échantillons de protéines hydrophobes solubilisées.Dans le détergent C 14 sulfalane, on utilise la concentration déterminée d'oxyde de détergent. Ensuite, les première et deuxième étapes sont répétées à un pH différent afin de comparer le profil de sédimentation de la protéine à ces différentes valeurs de pH. Les résultats montreront à la fois la taille oligomérique de la petite protéine hydrophobe dans ce détergent et l'effet du pH sur la stabilité de cet oligomère dans le détergent C 14 sulfalane.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car elle comporte plusieurs étapes, telles que le montage, le chargement des cellules, l'ajustement des densités cellulaires et l'atteinte des conditions d'équilibre, ce qui peut facilement submerger et désorienter les nouveaux utilisateurs. La moindre erreur dans ces étapes peut potentiellement gaspiller plusieurs jours de travail expérimental. La procédure sera démontrée par Suria, une étudiante au doctorat dans mon laboratoire.Préparez d'abord un tampon 10 x et un détergent 50 x. Préparez des solutions mères et stérilisez-les par filtration à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 micromètre, puis recueillez-les dans un eppendorf de 1,5 millilitre à partir des solutions mères de tampon 10 x et de détergent 50 x. Préparez 200 microlitres de trois solutions échantillons distinctes contenant respectivement 10 %, 30 % et 50 % d’oxyde de deutérium en volume.Pour assembler une cellule analytique à six canaux pour ultracentrifugation sans remplissage externe, insérez le joint de fenêtre dans le support de fenêtre, courbez légèrement le revêtement de fenêtre et insérez-le dans le support de fenêtre de manière à ce que l'espace soit formé à l'opposé du support de fenêtre. Ensuite, placez une fenêtre en saphir à l'intérieur du revêtement de fenêtre en alignant la marque avec le support de fenêtre. Placez le logement de vente avec le numéro de pièce vers le bas, les rainures d'assemblage étant alignées avec la rainure du logement.Faites glisser un centre à six secteurs, côté biseauté vers le bas, dans le logement de la cellule, suivi d'un ensemble fenêtre avec la fenêtre tournée vers le bas. Enduisez ensuite légèrement les filets de l'anneau à visser et la rondelle de l'anneau à visser de lubrifiant pour revêtement par rotation. Placez une rondelle de l'anneau à visser au-dessus de l'ensemble fenêtre. Installez l'anneau à visser dans le logement de la fenêtre, le mot « out » tourné vers l'extérieur, puis serrez l'anneau à visser à la main à l'aide de l'outil d'alignement de la cellule.Ensuite, serrer l'anneau à vis à seulement 60 pouces-livres à l'aide de la clé dynamométrique. Placer ensuite une cellule avec le numéro de pièce vers le haut et positionner à 12 heures. Charger 120 microlitres de solution de référence dans les rangées de gauche et 110 microlitres de solution échantillon dans les rangées de droite.À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, veiller à ce que chaque échantillon et chaque référence soient correctement appariés avec précaution. Faire glisser un ensemble de fenêtre, la fenêtre orientée vers le bas, dans le logement de la cellule, en prenant soin de ne pas trop perturber la cellule car cela pourrait renverser son contenu. Répéter les étapes précédentes, en serrant le deuxième anneau à vis jusqu’à 120 pouces-livres.Ensuite, retournez la cellule et resserrez l'anneau de visage à 120 pouces-livres. Chargez les cellules dans le rotor. Installez le rotor dans la centrifugeuse et installez le monochromateur conformément aux instructions du fabricant.Une fois le vide suffisant atteint, faites fonctionner la centrifugeuse à 3000 tr/min. Prévisualisez le motif d'interférence dans le logiciel d'interface utilisateur et ajustez les paramètres du laser pour obtenir le contraste maximal. Ensuite, créez un nouveau fichier de configuration, en précisant la mesure d'équilibre et d'interférence.Configurer une méthode d'équilibre de sédimentation à exécuter à 45 000 tours par minute ou à la vitesse maximale prévue pour les échantillons protéiques, avec une température d'analyse de 20 degrés Celsius. Après avoir acquis un premier balayage, effectuer un balayage toutes les 15 minutes pendant au moins 12 heures. Surveiller l'avancement de l'équilibre en ouvrant les fichiers de données dans l'analyse hétérogène et en sélectionnant la fonction d'ajustement. À ce stade, assembler une cellule d'ultracentrifugation analytique à six canaux avec des fenêtres en quartz, de la même manière que précédemment.À l'aide de pointes de chargement pour gel, chargez l'échantillon de protéine hydrophobe petite taille à la concentration la plus élevée préparé précédemment dans le canal le plus proche du centre du rotor, et l'échantillon à la concentration la plus faible dans le canal le plus éloigné du centre du rotor. Pour configurer la mesure d'absorbance, créez un nouveau fichier de configuration en indiquant l'équilibre et la mesure d'absorbance. Spécifiez une longueur d'onde de détection de 280 nanomètres.Ensuite, effectuez un étalonnage radial à 3000 tr/min en cochant l'option d'étalonnage radial avant le premier balayage et les options de balayage. Spécifiez la collecte de données en faible résolution et exécutez un seul balayage. Une fois le balayage terminé, décochez l'option.Configurer une méthode d'équilibre de sédimentation à exécuter à la première vitesse précédemment calculée à 20 degrés Celsius et recueillir un balayage toutes les 30 minutes pour chaque cellule. Spécifier la collecte de données à faible résolution après au moins 18 heures. Surveiller l'avancement de l'équilibre en ouvrant les fichiers de données dans une analyse hétérogène et en sélectionnant la fonction d'ajustement une fois l'équilibre atteint.Effectuez une seule numérisation à haute résolution une fois la numérisation terminée. Répétez les étapes précédentes pour la vitesse suivante lorsque le temps nécessaire pour atteindre l'équilibre à chaque vitesse est connu. Configurez la méthode d'équilibre de sédimentation Numérisation afin d'inclure toutes les vitesses précédemment calculées et de recueillir une numérisation après le temps d'équilibration pour chaque vitesse.Dans ce cas, indiquez la collecte de données à haute résolution dans chaque cellule pour détailler la distribution radiale du détergent C 14 sultan dans mes cellules, ainsi que du tampon phosphate de sodium 50 molaire. À pH 7,3, on observe une très faible courbe exponentielle pouvant être ajustée à un modèle linéaire. La pente de ce profil dépend de la concentration en oxyde de deutérium, et la concentration produisant une pente nulle a été déterminée à 32,3 %. La même expérience a été répétée à pH 5,5 et pH 3 pour obtenir respectivement des concentrations correspondantes en oxyde de deutérium de 30,3 % et 41 %.À un pH de 7,3, on a observé que la petite protéine hydrophobe et le détergent formaient des pentamères avec un logarithme apparent de la constante d'affinité de 21,05. La constante d'association n'a pas changé à pH 5,5, mais elle a été significativement réduite à pH 3. Ceci est conforme aux rapports antérieurs montrant une diminution de la conductance à pH plus bas, avec un pK d'environ 4,5.Une fois maîtrisée l'assemblage des cellules à l'équilibre, la préparation et le montage de l'expérience peuvent être effectués en une heure si les manipulations sont correctement réalisées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer une expérience d'équilibre de sédimentation afin de déterminer la taille oligomérique de votre protéine membranaire, ainsi que de comparer sa stabilité sous différentes conditions expérimentales.

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conformation des protéines et la dynamique sont essentielles pour comprendre la relation entre la structure et la fonction des protéines. l'échange d'hydrogène couplé à haute résolution spectrométrie de masse est une méthode polyvalente pour étudier la dynamique conformationnelle des protéines ainsi que la caractérisation de la protéine-ligand et des interactions protéine-protéine, y compris les interfaces de contact et des effets allostériques.

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