Name: Une approche pour lévaluation optogénétiques formation des connexions neuronales dans un système de co-culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Découvrez une méthode optogénétique pour évaluer la formation des connexions synaptiques entre neurones dérivés de cellules iPS humaines et neurones corticaux primaires. Ce système de co-culture accélère la maturation neuronale et permet d'étudier l'intégration fonctionnelle dans les réseaux existants.

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Nous remercions K. et S. Je Deisseroth pour les constructions lentiviraux ChR2 et Synapsin1-tdTomato respectivement, C. Chai pour le partage de l&#39;expertise et du protocole sur la génération iPSC, WY Leong pour le support technique, les membres du laboratoire Goh pour partager des réactifs et de l&#39;expertise. Ce travail a été soutenu par Abbott Nutrition et le Centre universitaire d&#39;excellence (ACE) de bourse de recherche de GlaxoSmithKline (GSK) pour ELG, par la National Research Foundation de Singapour en vertu de son programme de recherche concurrentiel (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) pour ELG et GJA, et par le (WCI) Programme Institut de classe mondiale de la National Research Foundation de Corée (NRF) financé par le ministère de l&#39;éducation, de la science et de la technologie de Corée (MEST) (NRF Nombre Grant: WCI 2009-003) pour GJA

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<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Stroh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+stem+cell+differentiation+in+the+setting+of+automated+optogenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation.</a> Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).</li>
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<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+and+long-term+self-renewal+of+primitive+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecule+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li>
<li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+Syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 160(2013).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Optogenetics fournit la précision temporelle et spatiale pour l&#39;activation de populations définies de neurones 13. Dans nos expériences, la totalité du champ de l&#39;objectif du microscope a été illuminée pendant 30 sec à seulement neurones corticaux photo-stimuler exprimant CHR2. Cela nous a permis de déterminer si les connexions synaptiques ont été formés entre les différentes populations de neurones dans le co-culture. Nos résultats ont révélé que la photostimulation augmente la fréquence de la CFP dans les neurones iPSC dérivés, ce qui démontre que ces neurones reçoivent entrée synaptique de neurones corticaux présynaptiques exprimant ChR2. Ceci, à son tour, a établi que les neurones iPSC dérivés intégrés avec succès dans des circuits avec les neurones corticaux. Il ya plusieurs étapes critiques pour la génération de ce système de co-culture. Il est important de se assurer que les cultures d&#39;astrocytes souris NPC dérivées sont en bonne santé, à la mort cellulaire minimal, avant de procéder à placaged&#39;autres types de cellules. Les neurones corticaux et PNJ humains attachent bien sur astrocytes sains et enregistrements électrophysiologiques dépendent fortement des conditions de culture. Les autres étapes clés de ce protocole sont les électroporation et le placage des neurones corticaux sur les cultures d&#39;astrocytes. Comme un grand nombre de cellules meurent après électroporation, il est important de se assurer qu&#39;au moins 6.000.000 neurones corticaux sont électroporation pour le placage sur des cultures d&#39;astrocytes dans des plaques à 24 puits. Nous avons observé que lorsque moins de 6 millions de cellules ont été soumises à une électroporation, le nombre de neurones qui survivent ne forme pas un réseau neuronal dense, qui a touché des enregistrements électrophysiologiques. Le nombre de neurones corticaux électroporation devrait aussi être compatible pour chaque expérience de co-culture à permettre une comparaison entre les différentes études. Pour toutes les mesures impliquant la digestion enzymatique, il est essentiel de ne pas laisser des cellules en solution digestif pendant trop longtemps car il peut conduire à la mort cellulaire. Cetteapproche peut être utilisée pour cribler la capacité des neurones à partir de fibroblastes dérivés spécifiques au patient pour former des contacts synaptiques avec d&#39;autres neurones. Les neurones issus de fibroblastes de patients atteints de troubles neurologiques du développement du syndrome de Rett (RTT) présentent des défauts de transmission synaptique: RTT neurones présentent une diminution significative de la fréquence et de l&#39;amplitude de la CFP par rapport aux neurones sains, probablement en raison de la connectivité synaptique moins 14. Notre système de co-culture permet l&#39;examen des effets des médicaments sur les neurones présentant des défauts de développement. Ceci peut être réalisé par addition de composés d&#39;intérêt au cours de l&#39;ensemencement de NPC humains malades ainsi que pendant une exposition continue à des composés pendant toute la durée de la différenciation neuronale. Bien que ce système de co-culture peut également être utilisé comme modèle pour le dépistage de drogues, une limitation de cette approche est que le processus d&#39;étudier les effets de chaque composé candidat peut être long et fastidieux quece ne est pas une méthode de criblage à haut débit. Après le traitement avec des composés candidats, les neurones iPSC dérivés doivent être patché individuellement afin de déterminer les effets de chaque composé sur les CSP. En outre, il ne existe actuellement pas beaucoup de fibroblastes disponibles et CSPi de patients. Par conséquent, il sera d&#39;un intérêt dans un avenir proche pour avoir plus de cellules de patients et aussi pour adapter ce protocole pour le criblage à haut débit. Par exemple, par marquage de neurones COPSi dérivés avec un indicateur d&#39;activité, tels que des capteurs génétiquement codés d&#39;ions ou de potentiel de membrane, il serait possible d&#39;augmenter le débit sensiblement côte-pas à pas de la procédure d&#39;électrophysiologie de temps. Comme l&#39;ensemble du processus de génération de ce système de co-culture, de la reprogrammation des fibroblastes d&#39;effectuer des enregistrements électrophysiologiques, nécessite plus de 90 jours, il est recommandé que soit les CSPi humaines ou PNJ être élargis, après la reprogrammation et les étapes de l&#39;induction neurale, respectivement,cryoconservés et de réduire le temps nécessaire pour les expériences futures. Dans nos expériences, nous avons exprimé dans les neurones corticaux ChR2 sous le promoteur de synapsin1. Parce que ce promoteur est pan-neuronal, nous étions sans doute photostimuler deux neurones corticaux excitateurs et inhibiteurs. Si le but est de futures expériences d&#39;interroger spécifiquement circuits excitateurs ou inhibiteurs soit, les promoteurs plus spécifiques peuvent être utilisés. Alternativement, les neurones corticaux peuvent être obtenus à partir transgénique (ou virus injecté les souris) où l&#39;expression ChR2 se adresse particulièrement aux sous-populations génétiquement définies de neurones. Par exemple, les tissus corticaux récolte d&#39;une souris qui a Cre recombinase exprimés en interneurones contenant parvalbumin-(interneurones PV) qui est croisé avec une souris avec floxé ChR2 donnera une situation où les seuls neurones corticaux exprimant ChR2 seront interneurones PV 15. L&#39;utilisation de ces interneurones exprimant CHR2 dans notre co-cusystème de lture permettra de déterminer si un neurone iPSC dérivés patchée est capable d&#39;intégrer dans un circuit avec interneurones PV. Basé sur une étude précédente 9, les neurones corticaux sont matures avec chevauchement dendrites après 14 jours in vitro. Ainsi, si photostimulation ne suscite pas une réponse d&#39;un neurone iPSC dérivés patchée, il doit indiquer que le neurone n&#39;a pas la capacité de faire des connexions synaptiques avec les neurones corticaux. Un neurone iPSC dérivés est capable de recevoir une entrée synaptique soit d&#39;autres neurones iPSC dérivés ou neurones corticaux. Si les enregistrements de patch clamp classique ont été utilisés, il ne serait pas possible de distinguer l&#39;entrée synaptique où vient. L&#39;avantage de notre système est que les réponses post-synaptiques depuis l&#39;entrée présynaptique corticale peuvent être évoqués de manière sélective et identifiés. Les procédures décrites ici fournissent une approche simple pour évaluer la capacité des neurones iPSC dérivés d&#39;intégrerdans un réseau neuronal définie.

Au cours des dernières années, notre compréhension des neurones et la fonction de circuit neuronal ont été révolutionné par plusieurs outils optogénétiques qui contrôlent l&#39;excitabilité neuronale. Un tel outil est le canal de cations activé par la lumière, channelrhodopsin-2 (ChR2): neurones exprimant CHR2 potentiels d&#39;action de feu en réponse à une stimulation lumineuse 1-3. Parce que les neurones ne sont pas habituellement sensible à la lumière, cette capacité remarquable ouvre de nouvelles voies pour le contrôle précis temporelle et spatiale de l&#39;activité de populations génétiquement définies de neurones 4 et a des études de la fonction cérébrale grandement accéléré. ChR2 a été appliqué à les cellules souches à des fins différentes, de surveiller le développement neuronal 5 à réglementer l&#39;activité des réseaux de neurones 6. Ici, nous avons utilisé CHR2 pour augmenter l&#39;utilité d&#39;un système de co-culture neuronale. Systèmes de co-culture permettent l&#39;évaluation des interactions entre les différents types de cellules.Co-cultures de neurones et cellules gliales, les principaux types de système nerveux cellulaires, sont couramment utilisées pour étudier la signalisation entre ces différents types de cellules, ainsi que d&#39;évaluer l&#39;importance de cette signalisation pour les réactions physiologiques, la propagation des dommages et d&#39;examiner la mécanismes moléculaires qui sont potentiellement impliqués dans cette signalisation 7. Une étude antérieure a montré que iPSCs humains se différencient en neurones très rapidement en présence de culture contenant les neurones corticaux primaires de rat, les astrocytes, les oligodendrocytes, la microglie et 8. Dans ce protocole, nous démontrons une méthode qui utilise CHR2 dans un système de co-culture pour interroger des connexions synaptiques entre les neurones corticaux de rat et les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP). Nous décrivons les étapes pour disséquer et les tissus du cerveau de récolte 9 ainsi que de maintenir et de différencier les cellules progénitrices neurales de souris (PNJ) dans les astrocytes et les PNJ humains Into neurones pour créer le système de co-culture. Pour établir ce système de co-culture, nous avons utilisé la méthode de reprogrammation sans intégration décrit par Okita et al. 10 à générer des CSPi humaines. Ces CSPi ont ensuite été efficacement différenciées en PNJ dans des conditions définies chimiquement en utilisant des inhibiteurs de petites molécules comme décrit par Li et al. 11 Dans les co-cultures, les différentes populations de neurones peuvent être identifiés par l&#39;intermédiaire de détection de l&#39;expression ChR2 dans les neurones corticaux et le marquage des neurones iPSC dérivés via la protéine fluorescente, tandem dimère tomate (tdTomato). Combinant des enregistrements électrophysiologiques des neurones iPSC dérivés avec photostimulation optogenetic des neurones corticaux évaluation de la capacité de ces deux types de neurones pour former des circuits avec l&#39;autre permet. Plus précisément, photostimulation de ChR2 exprimant neurones corticaux évoquer les réponses synaptiques dans les neurones iPSC dérivés qui se sont formés des circuits synaptiquesavec le réseau de neurones corticaux photostimulée. Nous démontrons que l&#39;augmentation des courants postsynaptiques sont en effet détectés dans les neurones iPSC dérivés dans de telles conditions. Ce protocole permet l&#39;évaluation du circuit synaptique sous une variété de conditions expérimentales, y compris récapitulation des différents modèles de maladies neurologiques en utilisant CSPi dérivés à partir de fibroblastes de patients atteints de maladies.

<table><tbody><tr><td>Kit de prolifération neuroculte (souris)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5702</td><td>Contient un milieu basal NSC et un supplément de prolifération NSC</td></tr><tr><td>Epi5 Kit de reprogrammation épisomale iPSC</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>MEM sans glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX supplément</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Human LIF</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9484</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>Compound E</td><td>Merck Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore</td><td>324856</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>Recherche Grade FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>Pour le milieu de différenciation des astrocytes</td></tr><tr><td>Défini FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>Pour le milieu neuronal primaire</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Pour le milieu neurone primaire</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>EMD Millipore</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>pour prélèvement de cerveaux</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro ; passoire à cellules m</td><td>BD Biosciences&nbsp ; &nbsp ;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 et micro ; m unité</td><td>de filtration Sartorius Stedim</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fluka</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>Pour les études électrophysiologiques</td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Pour les études électrophysiologiques</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>World precision instruments, Inc</td><td>1604323</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 15 ml</td><td>BD Biosciences&nbsp ;</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>tube à centrifuger de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 24 puits</td><td>Corning</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 6 puits</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flacons</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Verres de couverture</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit& nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>VPG1003</td><td>Pour l’électroporation des neurones corticaux primaires</td></tr><tr><td>Système de transfection néon&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>Pour l’électroporation de fibroblastes humains</td></tr><tr><td>Mini Analysis&nbsp ;</td><td>Synaptosoft</td><td>Mini Analysis v.6</td><td>Pour la mesure des</td></tr><tr><td>CSP Fibroblastes Humains Dermiques Normaux</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>Lampe à arc court au mercure</td><td>OSRAM</td><td>HBO 103 W/2</td><td></td></tr></tbody></table>

une approche pour l&#39;évaluation optogénétiques formation des connexions neuronales dans un système de co-culture

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Ici, nous décrivons un protocole pour générer une co-culture composée de 2 populations neuronales différentes. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont reprogrammées à partir de fibroblastes humains à l’aide de vecteurs épisomaux. Des colonies d’iPSC peuvent être observées 30 jours après le début de la reprogrammation des fibroblastes. Les colonies pluripotentes sont cueillies manuellement et cultivées dans un milieu d’induction neurale pour permettre la différenciation en cellules progénitrices neurales (NPC). Les iPSC se transforment rapidement en cellules neuroépithéliales en 1 semaine et conservent la capacité de s’auto-renouveler lorsqu’elles sont maintenues à une densité de culture élevée. Les NPC primaires de souris sont différenciés en astrocytes par exposition à un milieu contenant du sérum pendant 7 jours et forment une monocouche sur laquelle sont ajoutés des neurones corticaux embryonnaires de rat au jour 18 (E18) (transfectés avec de la channelrhodopsine-2 (ChR2)). Les NPC humains marqués avec la protéine fluorescente, le dimère tandem Tomato (tdTomato), sont ensuite ensemencés sur la culture d’astrocytes/neurones corticaux le lendemain et laissés se différencier pendant 28 à 35 jours. Nous démontrons que ce système forme des connexions synaptiques entre les neurones dérivés d’iPSC et les neurones corticaux, comme en témoigne une augmentation de la fréquence des courants synaptiques lors de la photostimulation des neurones corticaux. Ce système de co-culture fournit une nouvelle plate-forme pour évaluer la capacité des neurones dérivés d’iPSC à créer des connexions synaptiques avec d’autres populations neuronales.

Ici, un protocole décrivant les multiples étapes de génération d&#39;une co-culture consistant en les astrocytes, des neurones corticaux humains et des neurones est illustré. CSPi humaines ont été obtenues par la reprogrammation des fibroblastes en utilisant épisomique des vecteurs 10 et précisées dans une lignée de neurones avec un cocktail d&#39;inhibiteurs de petites molécules, faisant 11 PNJ qui ont été maintenues à haute densité (figure 1A). Plusieurs étapes sont nécessaires pour générer la co-culture: la différenciation des PNJ de souris en astrocytes, le placage de neurones corticaux de rat exprimant ChR2, et l&#39;ensemencement de PNJ humains marqués avec tdTomato (figure 1B). Au jour 2 de la différenciation, la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) + astrocytes peuvent être facilement observés dans les cultures (figure 1C). Souris PNJ ont été autorisés à différencier pendant au moins une semaine avant l&#39;étalement des neurones corticaux exprimant ChR2 sur l&#39;astrocyte monocouche (figure 1D). Après 34 semaines de différenciation PNJ humain, les neurones tdTomato + ont été détectés dans les cultures (Figure 1E). Ce système de co-culture permet une détection cohérente des courants post-synaptiques de neurones iPSC dérivés individuels en réponse à une stimulation lumineuse (figure 2A). Quand ils sont stimulés par la lumière, des potentiels d&#39;action ont été générées dans les neurones corticaux exprimant CHR2 (figure 2B). iPSC dérivés neurones sont également excitables (figure 2C), montrant une action accrue tir potentiel que l&#39;amplitude des impulsions de courant de dépolarisation a été augmenté (figure 2D). Ainsi, ces cellules présentent des propriétés de neurones matures. En l&#39;absence de lumière, les neurones iPSC dérivés reçu entrées synaptiques spontanés (figure 2E). Ces courants intérieure post-synaptiques ont été principalement médiées par des récepteurs AMPA, parce courants à travers les récepteurs GABA serait vers l&#39;extérieur et récepteurs NMDA ne portent pas un courantt le potentiel de maintien de -70 mV. Au moins certains de ces entrées étaient de neurones corticaux présynaptiques exprimant ChR2, parce que la stimulation de lumière considérablement augmenté la fréquence des courants postsynaptiques (figure 2E). Le cours de temps de cette augmentation de l&#39;apport synaptique est illustré à la figure 2F: photostimulation des neurones corticaux a été soutenue tout au long du 30 sec à long flash de lumière. Bien que la fréquence des CSP a été élevé lors ChR2 exprimant neurones corticaux ont été photostimulée (figure 2G), leur amplitude n&#39;a pas été affectée (figure 2H). En résumé, ces résultats indiquent que les neurones COPSi dérivés présentaient des propriétés de neurones matures et pourraient former des connexions synaptiques avec les neurones corticaux présynaptiques. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> Figure 1: Représentation schématique pour la production de co-culturesystème. (A) Timeline pour reprogrammer des fibroblastes humains en CSPi et l&#39;induction neurale aux PNJ. (B) Échéancier de différenciation terminale des PNJ humaines en neurones matures sur neurones et astrocytes cultures corticales. (C) Souris PNJ différencier rapidement dans GFAP + astrocytes après deux jours in vitro. (D) Après une semaine, les neurones corticaux exprimant ChR2 ont été étalées sur GFAP + astrocytes. (E) À 4-5 semaines après la différenciation des PNJ humains, les enregistrements électrophysiologiques ont été réalisées sur tdTomato + neurones. Barres d&#39;échelle représentent 100 um. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> Figure 2: Analyse optogénétiques de la connectivité synaptique fonctionnelle. (A) iPSC-cellules dérivées marqués avec tdTomato (rouge) ont été co-cultivées avec des neurones corticaux exprimant le activé par la lumièrecanal, ChR2 (vert). Enregistrements de neurones iPSC dérivés révélé (CFP) réponses actuelles post-synaptiques, qui pourrait provenir soit les neurones corticaux ou d&#39;autres neurones iPSC dérivés. (B) Illumination (barre bleue) a évoqué une série de potentiels d&#39;action dans les neurones corticaux exprimant ChR2. ( cellules C) iPSC dérivés sont évoqués par injection de courant. (D) vs tir courbe de courant de cellules iPSC dérivés. (E) Photostimulation des neurones corticaux ChR2 exprimant (barre bleue) a augmenté la fréquence des guichets uniques dans les neurones iPSC dérivés . bien sûr (F) Temps de l&#39;augmentation de la fréquence produite par photostimulation CFP. Bleu barre indique moment de photostimulation. (G, H) Bien que la fréquence de la CFP a été augmenté de photostimulation (G), l&#39;amplitude de la CFP n&#39;a pas été affectée (H). * Indique p &lt;0,05 par rapport à contrôler avec le t-test de Student.

Un protocole de génération d’un système de co-culture composé de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), de neurones corticaux primaires et d’astrocytes est décrit. Ce système de co-culture permet de détecter la formation de contacts et de circuits synaptiques entre de nouveaux neurones dérivés d’iPSC et des neurones corticaux préexistants exprimant la channelrhodopsine-2.

Une approche pour l&#39;évaluation optogénétiques formation des connexions neuronales dans un système de co-culture

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mettre en place un système de co-culture permettant d'évaluer la capacité des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines à former des connexions fonctionnelles selon une approche génique basée sur la photo-stimulation de neurones en culture via channel RUSIN two ou CR two. Ceci est réalisé en isolant d'abord des cellules progénitrices neuronales primaires de souris, ou NPCs, puis en les laissant se différencier en astrocytes. Ensuite, des neurones corticaux primaires de rat sont transfectés avec CH R two et mis en culture sur la couche d'astrocytes, qui sert de population neuronale existante.Ensuite, les NPCs humaines dérivées de cultures de cellules souches pluripotentes induites ou de cultures d'IPSC sont transduites avec un virus tomate 2D synapsine un, puis placées sur la culture de neurones astrocytaires et induites à se différencier, formant ainsi des connexions synaptiques. Les résultats montrent que les neurones dérivés d'IPSC établissent des connexions synaptiques avec les neurones corticaux de rat, comme en témoignent les enregistrements électrophysiologiques de courants postsynaptiques dans les neurones dérivés d'IPSC suite à la stimulation photo-génétique des neurones corticaux exprimant CHR deux. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, telles que les co-cultures associant uniquement des astrocytes à des neurones humains dérivés d'IPSC, est que le temps de maturation de ces neurones humains est plus court.Cela s'explique par le fait que la présence de neurones primaires peut accélérer la maturation de ces neurones humains. La procédure sera démontrée par Uni Chin, étudiante diplômante de mon laboratoire, et Y Su, du laboratoire de George Augustine. Après avoir prélevé les cerveaux de rats embryonnaires et isolé le tissu cortical selon le protocole indiqué, transférez les tissus corticaux dans une boîte contenant la solution de digestion préchauffée pour tissu cortical. Hachez les tissus corticaux aussi finement que possible avant de les incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l'incubation, transférez les tissus corticaux dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et dissociez les tissus à l’aide d’une pipette serologique jusqu’à l’obtention d’une solution homogène ne contenant aucun morceau de tissu.Faites passer la solution tissulaire à travers un tamis cellulaire de 70 microns afin de filtrer les éventuels caillots tissulaires résiduels. Répartissez trois millilitres de solution en aliquotes dans des tubes coniques de 15 millilitres.Ajouter 800 microlitres de BSA à 7,5 % dans un XPBS au fond de chaque tube, en formant une couche sous la couche de tissu. Centrifuger à 200 G pendant cinq minutes. Ensuite, éliminer le surnageant en aspirant à l’interface des deux couches. Éviter de perturber le culot de cellules au fond du tube.Après avoir utilisé un millilitre de milieu neuronal primaire pour remettre en suspension chaque palette cellulaire, regroupez-les tous dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Ensuite, utilisez un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire, puis centrifugez 6 millions de neurones corticaux de rat à 200 G pendant cinq minutes, et éliminez le surnageant.Au moins 6 millions de neurones corticaux sont nécessaires pour l'électroporation. Pour assurer la formation d'un réseau neuronal par les neurones survivants, ajoutez 100 microlitres de solution d'électroporation au culot cellulaire et resuspendez délicatement. Ensuite, mélangez 100 microlitres de la suspension cellulaire avec six microgrammes de plasmide CR deux et transférez le mélange dans un vétérinaire certifié.Sélectionnez et appliquez le programme approprié pour l'électroporation conformément aux instructions du fabricant. Après l'électroporation, ajoutez 500 microlitres de MEM au vet. Transférez les cellules dans 11,5 millilitres de milieu pour neurones primaires et resuspendez délicatement.Ensuite, ajouter 500 microlitres dans chaque puits d'une plaque de 24 puits contenant des astrocytes de souris. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 %CO2. Après avoir généré des cellules souches pluripotentes induites ou IPC, induire et maintenir les cellules en tant que culture de cellules progénitrices neuronales humaines ou NPC selon le protocole décrit dans le texte.Dans cet exemple, les CPN sont marquées à l’aide du vecteur lentiviral synapse dans un TD tomate le jour suivant l’ajout de neurones primaires à une culture d’astrocytes. Utilisez un XPBS pour laver une fois les CPN humaines, puis ajoutez la solution de détachement cellulaire et incubez pendant cinq minutes à 30 degrés Celsius. Assurez-vous que toutes les cellules se sont détachées.Ensuite, transférez-les dans un tube de 15 millilitres contenant deux fois le volume de D-M-E-M-F 12 et centrifugez à 200 ×g pendant cinq minutes. Éliminez le surnageant et utilisez le milieu de différenciation neuronal pour resuspendre délicatement le culot en cellules individuelles. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.Ensuite, aspirez soigneusement le milieu de la plaque de cultures de neurones corticaux et d'astrocytes. Les NPCs humaines à 5 000 cellules par centimètre carré par puits en milieu de différenciation neuronale. Incubez à 37 degrés Celsius et 5 %CO2, et remplacez le milieu tous les deux ou trois jours pendant au moins 28 jours.Pour confirmer si les CPI humaines se comportent comme des neurones matures, utilisez un microscope confocal équipé d'un objectif à immersion dans l'eau de 60 x pour localiser les cellules différenciées à partir des CPI humaines. En visualisant le TD tomate. Tirez une pipette d'enregistrement jusqu'à une résistance de quatre à six ohms et perfusez.Les cellules à température ambiante dans une solution externe constamment saturée avec 95 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Utilisez une solution interne pour remplir la micropipette d'enregistrement, réalisez une inclusion de cellule exprimant le TD tomate en mode cellule entière et enregistrez la génération de potentiels d'action en réponse à une injection de courant en mode pont de courant. Afin de confirmer que le potentiel d'action des cellules corticales exprimant CHR deux est déclenché de manière fiable par une stimulation lumineuse.Tout d'abord, localisez les cellules corticales exprimant CR deux en visualisant la GFP par éclairage lumineux à l’aide d’une lampe à arc au mercure, en utilisant un filtre d’excitation de 480 sur 40 nanomètres. Vérifiez qu’un potentiel d’action est fidèlement déclenché par enregistrement en mode « courant bloqué » en configuration tout-en-cellule. Pour effectuer une stimulation génétique, réalisez un « patch » sur une cellule positive pour le TD-tomate en mode tout-en-cellule et fixez le « clampage » de tension à moins 70 millivolts à l’aide de la lampe au mercure sur tout le champ et d’un filtre d’excitation de 480 sur 40.Stimuler tout le champ pendant 30 secondes. Enregistrer les courants postsynaptiques ou PSC d'une cellule patchée induits par la stimulation photoélectrique de neurones corticaux présynaptiques exprimant CHR2. Régler manuellement le seuil pour l'amplitude et la surface des courants à cinq picoampères ici et PICO respectivement, puis examiner attentivement ces événements afin d'éliminer toutes les traces non PSC.Comme le montre cette vidéo, plusieurs étapes sont nécessaires pour générer la co-culture de neurones dérivés de cellules progénitrices induites, de neurones corticaux primaires et d'astrocytes. Cette image montre qu'au deuxième jour de la différenciation des cellules progénitrices neurales de souris en astrocytes, des astrocytes positifs pour la protéine acide fibrillaire gliale, ou GFAP, peuvent être facilement observés. Les cellules progénitrices neurales de souris ont été laissées se différencier pendant au moins une semaine avant la mise en culture de neurones corticaux exprimant CR deux sur la monocouche d'astrocytes, et les deux types cellulaires sont identifiés dans cette co-culture par marquage immunofluorescent de la GFAP et de CHR deux.Après trois à quatre semaines de différenciation des NPCs humains, des neurones positifs pour le TD-tomate ont été détectés dans les cultures, comme illustré ici. Lorsqu'ils sont stimulés par la lumière, des potentiels d'action sont générés dans les neurones corticaux exprimant CHR deux IPSC. Les neurones dérivés sont également excitables, montrant une augmentation de l'activité électrique.Activation potentielle lorsque l'amplitude des impulsions de courant dépolarisant augmentait. En l'absence de lumière, les neurones issus des CPIS recevaient des entrées synaptiques spontanées. Ces courants post-synaptiques entrants étaient principalement médiés par des récepteurs AMPA.La stimulation lumineuse des neurones corticaux a été maintenue tout au long de la 32e longue impulsion lumineuse, tandis que la fréquence des PSC était augmentée. Lorsque les neurones corticaux exprimant CHR deux ont été stimulés par la lumière, leur amplitude n’a pas été modifiée. Après cette procédure, nous pouvons utiliser d'autres systèmes de co-culture avec différents types cellulaires spécifiques aux patients afin de répondre à d'autres questions, comme l'effet de composés pharmaceutiques candidats sur des maladies spécifiques d'intérêt.

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