Une approche pour l'évaluation optogénétiques formation des connexions neuronales dans un système de co-culture

L'objectif général de l'expérience suivante est de mettre en place un système de co-culture permettant d'évaluer la capacité des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines à former des connexions fonctionnelles selon une approche génique basée sur la photo-stimulation de neurones en culture via channel RUSIN two ou CR two. Ceci est réalisé en isolant d'abord des cellules progénitrices neuronales primaires de souris, ou NPCs, puis en les laissant se différencier en astrocytes. Ensuite, des neurones corticaux primaires de rat sont transfectés avec CH R two et mis en culture sur la couche d'astrocytes, qui sert de population neuronale existante.

Ensuite, les NPCs humaines dérivées de cultures de cellules souches pluripotentes induites ou de cultures d'IPSC sont transduites avec un virus tomate 2D synapsine un, puis placées sur la culture de neurones astrocytaires et induites à se différencier, formant ainsi des connexions synaptiques. Les résultats montrent que les neurones dérivés d'IPSC établissent des connexions synaptiques avec les neurones corticaux de rat, comme en témoignent les enregistrements électrophysiologiques de courants postsynaptiques dans les neurones dérivés d'IPSC suite à la stimulation photo-génétique des neurones corticaux exprimant CHR deux. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, telles que les co-cultures associant uniquement des astrocytes à des neurones humains dérivés d'IPSC, est que le temps de maturation de ces neurones humains est plus court.

Cela s'explique par le fait que la présence de neurones primaires peut accélérer la maturation de ces neurones humains. La procédure sera démontrée par Uni Chin, étudiante diplômante de mon laboratoire, et Y Su, du laboratoire de George Augustine. Après avoir prélevé les cerveaux de rats embryonnaires et isolé le tissu cortical selon le protocole indiqué, transférez les tissus corticaux dans une boîte contenant la solution de digestion préchauffée pour tissu cortical. Hachez les tissus corticaux aussi finement que possible avant de les incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l'incubation, transférez les tissus corticaux dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et dissociez les tissus à l’aide d’une pipette serologique jusqu’à l’obtention d’une solution homogène ne contenant aucun morceau de tissu.

Faites passer la solution tissulaire à travers un tamis cellulaire de 70 microns afin de filtrer les éventuels caillots tissulaires résiduels. Répartissez trois millilitres de solution en aliquotes dans des tubes coniques de 15 millilitres.

Ajouter 800 microlitres de BSA à 7,5 % dans un XPBS au fond de chaque tube, en formant une couche sous la couche de tissu. Centrifuger à 200 G pendant cinq minutes. Ensuite, éliminer le surnageant en aspirant à l’interface des deux couches. Éviter de perturber le culot de cellules au fond du tube.

Après avoir utilisé un millilitre de milieu neuronal primaire pour remettre en suspension chaque palette cellulaire, regroupez-les tous dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Ensuite, utilisez un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire, puis centrifugez 6 millions de neurones corticaux de rat à 200 G pendant cinq minutes, et éliminez le surnageant.

Au moins 6 millions de neurones corticaux sont nécessaires pour l'électroporation. Pour assurer la formation d'un réseau neuronal par les neurones survivants, ajoutez 100 microlitres de solution d'électroporation au culot cellulaire et resuspendez délicatement. Ensuite, mélangez 100 microlitres de la suspension cellulaire avec six microgrammes de plasmide CR deux et transférez le mélange dans un vétérinaire certifié.

Sélectionnez et appliquez le programme approprié pour l'électroporation conformément aux instructions du fabricant. Après l'électroporation, ajoutez 500 microlitres de MEM au vet. Transférez les cellules dans 11,5 millilitres de milieu pour neurones primaires et resuspendez délicatement.

Ensuite, ajouter 500 microlitres dans chaque puits d'une plaque de 24 puits contenant des astrocytes de souris. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 %CO2. Après avoir généré des cellules souches pluripotentes induites ou IPC, induire et maintenir les cellules en tant que culture de cellules progénitrices neuronales humaines ou NPC selon le protocole décrit dans le texte.

Dans cet exemple, les CPN sont marquées à l’aide du vecteur lentiviral synapse dans un TD tomate le jour suivant l’ajout de neurones primaires à une culture d’astrocytes. Utilisez un XPBS pour laver une fois les CPN humaines, puis ajoutez la solution de détachement cellulaire et incubez pendant cinq minutes à 30 degrés Celsius. Assurez-vous que toutes les cellules se sont détachées.

Ensuite, transférez-les dans un tube de 15 millilitres contenant deux fois le volume de D-M-E-M-F 12 et centrifugez à 200 ×g pendant cinq minutes. Éliminez le surnageant et utilisez le milieu de différenciation neuronal pour resuspendre délicatement le culot en cellules individuelles. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.

Ensuite, aspirez soigneusement le milieu de la plaque de cultures de neurones corticaux et d'astrocytes. Les NPCs humaines à 5 000 cellules par centimètre carré par puits en milieu de différenciation neuronale. Incubez à 37 degrés Celsius et 5 %CO2, et remplacez le milieu tous les deux ou trois jours pendant au moins 28 jours.

Pour confirmer si les CPI humaines se comportent comme des neurones matures, utilisez un microscope confocal équipé d'un objectif à immersion dans l'eau de 60 x pour localiser les cellules différenciées à partir des CPI humaines. En visualisant le TD tomate. Tirez une pipette d'enregistrement jusqu'à une résistance de quatre à six ohms et perfusez.

Les cellules à température ambiante dans une solution externe constamment saturée avec 95 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Utilisez une solution interne pour remplir la micropipette d'enregistrement, réalisez une inclusion de cellule exprimant le TD tomate en mode cellule entière et enregistrez la génération de potentiels d'action en réponse à une injection de courant en mode pont de courant. Afin de confirmer que le potentiel d'action des cellules corticales exprimant CHR deux est déclenché de manière fiable par une stimulation lumineuse.

Tout d'abord, localisez les cellules corticales exprimant CR deux en visualisant la GFP par éclairage lumineux à l’aide d’une lampe à arc au mercure, en utilisant un filtre d’excitation de 480 sur 40 nanomètres. Vérifiez qu’un potentiel d’action est fidèlement déclenché par enregistrement en mode « courant bloqué » en configuration tout-en-cellule. Pour effectuer une stimulation génétique, réalisez un « patch » sur une cellule positive pour le TD-tomate en mode tout-en-cellule et fixez le « clampage » de tension à moins 70 millivolts à l’aide de la lampe au mercure sur tout le champ et d’un filtre d’excitation de 480 sur 40.

Stimuler tout le champ pendant 30 secondes. Enregistrer les courants postsynaptiques ou PSC d'une cellule patchée induits par la stimulation photoélectrique de neurones corticaux présynaptiques exprimant CHR2. Régler manuellement le seuil pour l'amplitude et la surface des courants à cinq picoampères ici et PICO respectivement, puis examiner attentivement ces événements afin d'éliminer toutes les traces non PSC.

Comme le montre cette vidéo, plusieurs étapes sont nécessaires pour générer la co-culture de neurones dérivés de cellules progénitrices induites, de neurones corticaux primaires et d'astrocytes. Cette image montre qu'au deuxième jour de la différenciation des cellules progénitrices neurales de souris en astrocytes, des astrocytes positifs pour la protéine acide fibrillaire gliale, ou GFAP, peuvent être facilement observés. Les cellules progénitrices neurales de souris ont été laissées se différencier pendant au moins une semaine avant la mise en culture de neurones corticaux exprimant CR deux sur la monocouche d'astrocytes, et les deux types cellulaires sont identifiés dans cette co-culture par marquage immunofluorescent de la GFAP et de CHR deux.

Après trois à quatre semaines de différenciation des NPCs humains, des neurones positifs pour le TD-tomate ont été détectés dans les cultures, comme illustré ici. Lorsqu'ils sont stimulés par la lumière, des potentiels d'action sont générés dans les neurones corticaux exprimant CHR deux IPSC. Les neurones dérivés sont également excitables, montrant une augmentation de l'activité électrique.

Activation potentielle lorsque l'amplitude des impulsions de courant dépolarisant augmentait. En l'absence de lumière, les neurones issus des CPIS recevaient des entrées synaptiques spontanées. Ces courants post-synaptiques entrants étaient principalement médiés par des récepteurs AMPA.

La stimulation lumineuse des neurones corticaux a été maintenue tout au long de la 32e longue impulsion lumineuse, tandis que la fréquence des PSC était augmentée. Lorsque les neurones corticaux exprimant CHR deux ont été stimulés par la lumière, leur amplitude n’a pas été modifiée. Après cette procédure, nous pouvons utiliser d'autres systèmes de co-culture avec différents types cellulaires spécifiques aux patients afin de répondre à d'autres questions, comme l'effet de composés pharmaceutiques candidats sur des maladies spécifiques d'intérêt.