Une approche pour l'évaluation optogénétiques formation des connexions neuronales dans un système de co-culture

L’objectif général de l’expérience suivante est d’établir un système de co-culture pour évaluer la capacité des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme à former des connexions fonctionnelles en utilisant une approche génique basée sur la photostimulation des neurones cultivés via le canal RUSIN deux ou CR deux. Ceci est réalisé en isolant d’abord les cellules progénitrices neurales primaires de souris ou NPC, et en leur permettant de se différencier en astrocytes. Ensuite, les neurones corticaux primaires du rat sont transfectés avec CH R deux et plaqués sur la couche astrocytaire, qui sert de population neuronale existante.

Ensuite, les NPC humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites ou de cultures IPSC sont transduits avec synapsin un virus de tomate 2D, puis assis sur la culture de neurones astrocytaires et induits à se différencier, formant ensuite des connexions synaptiques. Les résultats montrent que les neurones dérivés d’IPSC forment des connexions synaptiques avec les neurones corticaux de rat sur la base d’enregistrements électrophysiologiques de courants postsynaptiques dans les neurones dérivés d’IPSC lors de la photostimulation génique des deux neurones corticaux exprimant CHR. Le principal avantage de cette matière par rapport aux existantes comme celles qui ne co-cultivent que des astrocytes avec des neurones humains dérivés de l’IPSC est que le temps de maturation de ces neurones humains est plus court.

C’est parce que la présence de neurones primaires peut accélérer la maturation de ces neurones humains démontrant la procédure sera Uni Chin, un étudiant diplômé de mon laboratoire et poursuivant Y du laboratoire de George Augustine Après avoir récolté des cerveaux de rats embryonnaires et isolé le tissu cortical selon le protocole de texte, transférez les tissus corticaux dans une boîte contenant la solution de digestion du tissu cortical préchauffé. Émincez les tissus corticaux aussi finement que possible avant de les laisser incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, transférez les tissus corticaux dans un tube à centrifuger de 50 millilitres, dissociez les tissus à l’aide d’une pipette sérologique jusqu’à ce qu’une solution homogène sans morceaux de tissu soit produite.

Passez la solution tissulaire à travers une passoire cellulaire de 70 microns pour filtrer les amas de tissus restants. Aliquote trois millilitres de solution dans 15 millilitres. Tubes à centrifuger.

Ajoutez 800 microlitres de BSA à 7,5 % dans un XPBS au fond de chaque tube, en formant une couche sous la centrifugeuse de la couche tissulaire à 200 G pendant cinq minutes. Retirez ensuite le surnageant par aspiration à partir de l’interface des deux couches. Évitez de déranger la pastille de selp au fond du tube.

Après avoir utilisé un millilitre de milieu neuronal primaire pour remettre en suspension chaque palette cellulaire, combinez-les toutes dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, utilisez un hémocytomètre pour déterminer la centrifugeuse de densité cellulaire. 6 millions de neurones corticaux de rat à 200 G pendant cinq minutes, et retirer le surnageant.

Au moins 6 millions de neurones corticaux sont nécessaires à l’électroporation. Pour assurer la formation d’un réseau neuronal par les neurones survivants, ajoutez 100 microlitres de solution d’électroporation à la pastille cellulaire et remettez doucement en suspension. Combinez ensuite 100 microlitres de suspension cellulaire avec six microgrammes de plasmide CR deux et transférez-le dans un vétérinaire certifié.

Sélectionnez et appliquez le programme d’électroporation approprié selon les instructions du fabricant. Après l’électroporation, ajoutez 500 microlitres de MEM au vétérinaire. Transférez les cellules dans 11,5 millilitres de neurone primaire, milieu et suspendez-les doucement.

Ajoutez ensuite 500 microlitres dans chaque puits d’une plaque de 24 puits contenant des astrocytes de souris. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Après avoir généré des cellules souches pluripotentes induites ou IPC, induisez et maintenez les cellules en tant que cellule progénitrice neurale humaine ou culture NPC selon le protocole de texte.

Dans cet exemple, les NPC sont marqués à l’aide du vecteur lentiviral synapse dans une tomate TD le lendemain de l’ajout de neurones primaires à une culture d’astrocytes. Utilisez un XPBS pour laver les PNJ humains une fois, puis ajoutez une solution de détachement cellulaire et incubez pendant cinq minutes à 30 degrés Celsius. Assurez-vous que toutes les cellules se sont détachées.

Ensuite, transférez-les dans un tube de 15 millilitres contenant deux fois la quantité de D-M-E-M-F 12 et centrifugez-les à 200 G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et utilisez un milieu de différenciation neuronale pour remettre doucement la pastille en suspension dans des cellules uniques. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.

Ensuite, aspirez soigneusement le milieu de la plaque de cultures de neurones corticaux astrocytaires. Les NPC humains à 5 000 cellules par centimètre carré par puits dans la différenciation neuronale. Douleur moyenne. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2, et remplacer le milieu tous les deux ou trois jours pendant au moins 28 jours.

Pour confirmer si les CPI humaines se comportent comme des neurones matures, utilisez un microscope confocal équipé d’une lentille d’immersion dans l’eau 60x pour trouver des cellules différenciées des CPI humaines. En visualisant la tomate TD. Tirez une pipette d’enregistrement jusqu’à une résistance de quatre à six ohms perfusible.

Les cellules à température ambiante dans une solution externe bouillonnaient constamment avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Utilisez une solution interne pour remplir le patch de micro-pipette d’enregistrement d’une cellule positive de tomate TD en mode cellule entière et enregistrez le déclenchement du potentiel d’action en réponse à l’injection de courant dans la pince ampoule. Confirmer que le potentiel d’action des cellules corticales exprimant CHR two est évoqué de manière fiable par la stimulation lumineuse.

Tout d’abord, trouver des cellules corticales exprimant CR deux en visualisant la GFP à travers un éclairage lumineux avec une lampe à arc au mercure, et en utilisant une longueur d’onde de filtre d’excitation de 480 sur 40 nanomètres. Vérifiez qu’un potentiel d’action est évoqué de manière fiable via l’enregistrement de la pince de courant en mode cellule entière. Pour effectuer une stimulation génique, patchez une cellule TD positive à la tomate en mode cellule entière et réglez la pince de tension à moins 70 millivolts avec la lampe au mercure de champ entier et un filtre d’excitation 480 sur 40.

Stimulez l’ensemble du champ pendant 30 secondes. Enregistrer les courants postsynaptiques ou PSC d’une cellule patchée induits par la photostimulation de CHR deux exprimant les neurones corticaux présynaptiques. Définissez le seuil d’amplitude et de zone de courants à cinq ampères Pico ici et PICO inspecte manuellement ces événements pour éliminer toutes les traces non PSC.

Comme le montre cette vidéo, plusieurs étapes sont nécessaires pour générer la co-culture de neurones dérivés des IPC, des neurones corticaux primaires et des astrocytes. Cette image montre qu’au deuxième jour de la différenciation des NPC de souris en astrocytes, la protéine acide fibrillaire gliale ou les astrocytes GFAP positifs peuvent être facilement observés. Les NPC de souris ont été autorisés à se différencier pendant au moins une semaine avant de plaquer les neurones corticaux, exprimant CR deux sur la monocouche astrocytaire, et les deux sont identifiés dans cette co-culture par coloration immunofluorescente de GFAP et CHR deux.

Après trois à quatre semaines de différenciation humaine des NPC, des neurones positifs pour la tomate TD ont été détectés dans les cultures, comme indiqué ici. Lorsqu’ils étaient stimulés par la lumière, des potentiels d’action étaient générés dans les neurones corticaux exprimant CHR deux IPSC. Les neurones dérivés sont également excitables, montrant une action accrue.

L’activation potentielle à mesure que l’amplitude des impulsions de courant dépolarisantes augmentait. En l’absence de lumière, les neurones dérivés de l’IPSC ont reçu des entrées synaptiques spontanées. Ces courants post-synaptiques entrants étaient principalement médiés par les récepteurs AMPA.

La photostimulation des neurones corticaux a été maintenue tout au long du 32e long flash lumineux alors que la fréquence des CSP était élevée. Lorsque deux neurones corticaux exprimant CHR ont été photostimulés, leur amplitude n’a pas été affectée. Suite à cette procédure, nous pouvons utiliser d’autres systèmes de co-culture avec différents types de cellules spécifiques au patient afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’effet des composés médicamenteux candidats sur des maladies d’intérêt spécifiques.