Name: Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Apprenez à produire du virus influenza A à haut titre dans des œufs de poulet embryonnés. Cette méthode économique permet d'obtenir des quantités importantes de virus pour la recherche virologique et le développement vaccinal.

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La présente étude a été financée par les subventions des NIH HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.) et l’American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

NOTE: Remarques générales: Effectuer toutes les procédures impliquant la manipulation de l&#39;œuf dans des conditions stériles, et la technique stérile doit être utilisé en conséquence. Pré-nettoyer tous les équipements avec 70% d&#39;éthanol avant utilisation. En général, l&#39;inoculation du virus de la grippe et la récolte doivent être effectués dans un laboratoire BSL-2. Toutefois, si ce protocole est utilisé pour propager beaucoup plus pathogène virus de la grippe (par exemple, les souches pandémiques et prépandémiques, souches qui présentent un danger pour la volaille et le bétail, les souches de la grippe aviaire hautement pathogène, le 1918 souche H1N1), les niveaux de biosécurité plus élevés et dans certains cas, des mesures de biosécurité et autorisations sont nécessaires. Le comité institutionnel de biosécurité locale devrait approuver toutes les recherches sur le virus de la grippe. 1. Préparation des oeufs pour l&#39;inoculation <ol><li> Obtenir des œufs aviaires (SPF) exempts d&#39;agents pathogènes fraîchement fécondé sériques d&#39;un fournisseur approprié. Typiquement, des œufs de poule sont utilisés. Les œufs doivent être noused immédiatement à l&#39;arrivée. </li><li> À l&#39;arrivée mettre les œufs dans un incubateur d&#39;œufs humidifié avec un tourneur automatique des oeufs pour faire tourner les oeufs régulièrement. Si un tourneur automatique des oeufs ne est pas disponible, faire pivoter manuellement oeufs au moins 2 à 3 fois par jour (assurez-vous de porter des gants et de garder tout aussi stérile que possible). </li><li> Incuber les œufs à 37 ° C et 55-60% d&#39;humidité pendant 10 à 11 jours. </li></ol> 2. mirage des oeufs <ol><li> Utilisez un candler d&#39;oeuf à examiner l&#39;œuf devant une lumière vive dans une pièce sombre pour vérifier les œufs de l&#39;infertilité par mirage après environ 7 ou 8 jours d&#39;incubation. <ol><li> Essuyez le candler d&#39;œuf avec 70% d&#39;éthanol. Changer de gants souvent et désinfecter avec 70% d&#39;éthanol afin de minimiser le risque de contamination par des agents pathogènes. </li><li> Retirer les oeufs dans l&#39;incubateur et les placer dans des boîtes d&#39;œufs vides. </li><li> Éteignez les lumières dans la salle. </li><li> Maintenez la grande fin de chaque oeuf un à la fois contre le candler. </li><li> Observez l&#39;œuf Détermineze si elle est fertile ou infertile. REMARQUE: les vaisseaux sanguins minces conduisant à un embryon en forme de haricot doit être clairement visible. Les œufs non fécondés apparaissent comme une tache de sang petite avec un jaune d&#39;œuf visible. </li></ol></li><li> Jeter les œufs qui sont fécondés, et retourner les oeufs viables à l&#39;incubateur. Ne laissez pas œufs à l&#39;extérieur de l&#39;incubateur pendant plus de 30 min. Si l&#39;état d&#39;un œuf ne peut être confirmée, marquer, et observer plus tard. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;inoculum Virus <ol><li> Diluer virus de la grippe disponibles à environ 10 mars au 10 avril pfu / ml dans du PBS stérile contenant 10 mM HEPES (pH 7,4). Étape critique: Diluer le stock de virus immédiatement avant l&#39;emploi et garder le virus dilué sur la glace tout le temps. </li></ol> 4. Virus de la grippe inoculation par voie allantoïdienne <ol><li> Le jour de l&#39;inoculation du virus (jours 10 ou 11), bougie à nouveau les oeufs et éliminer les embryons morts. Distinguer embryons vivants parla recherche de mouvement à l&#39;intérieur de l&#39;œuf. </li><li> Retirez trois oeufs de l&#39;incubateur, et d&#39;organiser les oeufs dans un support séparé avec le sac d&#39;air vers le haut. </li><li> Marquer l&#39;espace aérien des oeufs avec un marqueur permanent. </li><li> Laver la coquille dessus de l&#39;espace aérien avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Mettez les œufs avec l&#39;air l&#39;espace dans une boîte d&#39;œufs et dans une hotte de biosécurité (BSL-2). </li><li> Utiliser une aiguille de 18G stérile pour percer un petit trou dans la coquille sur le sac d&#39;air de chaque œuf. Veillez à ne pas insérer l&#39;aiguille trop profondément pour éviter poignarder l&#39;embryon ou le jaune. </li><li> Dessinez le virus de la grippe diluée dans une seringue de 1 ml stérile et fixer une aiguille de 22G. </li><li> Avancer avec précaution la seringue avec une aiguille à un angle dans la cavité allantoïdienne 45 °. </li><li> Injecter 0,2 ml du virus dilué de la grippe. </li><li> Répéter l&#39;injection avec les deux autres oeufs, puis jeter la seringue et l&#39;aiguille. </li><li> Sceller le trou avec une goutte de colle à partir d&#39;un pistolet à colle (ou de la cire de paraffine fondue). Be Veillez à ce que la colle ne fuit pas à l&#39;intérieur de l&#39;œuf. </li><li> Placez les oeufs de nouveau dans l&#39;incubateur d&#39;œufs avec l&#39;espace d&#39;air pointé vers le haut. </li><li> Répétez les étapes 4.2 à 4.12 jusqu&#39;à ce que tous les oeufs ont été inoculés. </li></ol> 5. Temps d&#39;incubation <ol><li> Incuber les œufs infectés sans tourner à 37 ° C et ~ 60% d&#39;humidité. </li><li> Choisir le temps d&#39;incubation optimal en fonction du type de virus de la grippe. Incuber la grippe A pendant 48 h; incuber la grippe B et C pendant 72 heures. </li></ol> 6. Virus de la grippe récolte <ol><li> Après la période d&#39;incubation, les oeufs refroidir à 4 ° C pendant un minimum de 4 heures (ou O / N) pour tuer l&#39;embryon et la constriction des vaisseaux sanguins pour réduire le risque de contamination du fluide allantoïque infecté avec le sang. Pour ce faire, pour empêcher les globules rouges de l&#39;absorption du virus, ce qui réduit le rendement. Alternativement, les œufs de refroidissement pendant 30 min à -20 ° C; Mais cela augmente le risque de contamination par le sang. </li><li> Après les oeufs ont été suffisamment refroidi, transférer les oeufs à une hotte de biosécurité. Placez l&#39;oeuf dans un support solide avec le sac d&#39;air vers le haut. Nettoyer la surface de l&#39;œuf avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Utilisez des ciseaux stériles pour ouvrir la coquille dessus de la poche d&#39;air. Retirer la coquille autour de la poche d&#39;air tout en faisant attention de ne pas détruire la membrane chorioallantoïque. </li><li> Ouvrez la membrane chorioallantoïque avec des pinces stériles contondants. Déplacez doucement côté l&#39;embryon et le sac jaune avec une petite spatule ou une cuillère. Prenez soin de ne pas rompre le jaune. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un 1 ml pipette Eppendorf, recueillir soigneusement le fluide allantoïque. Si nécessaire, inclinez l&#39;œuf un peu sur le côté pour recueillir autant de liquide que possible. </li><li> Mélanger le liquide allantoïdien de tous les oeufs dans un tube en plastique conique de 50 ml. Garder les tubes sur la glace en tout temps pendant la récolte de virus. Un rendement d&#39;oeufs 5-10 ml d&#39;un fluide légèrement jaunâtre. </li><li> Spin le fluide allantoïque contenant le virus à 1000 g pendant 10 min à 46; C pour sédimenter les débris. Transférer le liquide clair dans un nouveau tube de 50 ml conservé dans la glace. Éliminer œufs dans un conteneur à déchets BSL-2. </li></ol> 7. Stockage <ol><li> Aliquoter immédiatement le fluide clarifié allantoïdien (par exemple, 50, 100 ou 500 ul aliquotes) et enclenchez-gel dans l&#39;azote liquide. Transfert stocks de virus congelés à -80 ° C congélateur pour le stockage à long terme. </li></ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States%2C+1976-2007%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+mortality+weekly+report%22%5BJournal%5D)">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li>
<li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li>
<li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus%3A+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li>
<li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+and+the+challenge+for+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immu%22%5BJournal%5D)">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li>
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<li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li>
<li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li>
<li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;influenza cause une grande charge mondiale de morbidité, et le travail se poursuit dans la compréhension de la pathogenèse des lésions pulmonaires 7. Pour la recherche facilitée dans cette maladie mortelle, diverses méthodes ont été développées pour propager le virus de la grippe 6. Ici, nous décrivons une technique pour produire des virus de la grippe dans les oeufs de poulet. L&#39;avantage de cette méthode est qu&#39;il est hautement reproductible et se traduit par de grandes quantités de ...

La grippe A continue d&#39;être une menace majeure pour la santé humaine. Ce est une maladie respiratoire potentiellement dévastatrice avec une grande charge mondiale causant jusqu&#39;à 500 000 décès dans le monde chaque année 1. Les virus grippaux sont dans la famille des Orthomyxoviridae et portent huit sens négatif ARN simple brin dans leur génome 1,2. La haute mutabilité (ce est à dire, &quot;dérive&quot; antigénique) du génome viral empêche immunité à long terme. En outre, la grippe est de plus en plus résistantes aux médicaments anti-viraux 3. La pandémie de grippe H1N1 2009 a mis en évidence toutes les questions difficiles associés à la maladie de la grippe (souche pandémique, la résistance anti-virale, la production de vaccins retardé). La formulation de vaccin est déterminé annuellement par l&#39;Organisation mondiale de la santé pour les souches de la grippe les plus susceptibles pathogènes (un pour chaque H1N1, H3N2 et la grippe B) 4. Parce que cette méthode est basée sur la souche de grippe annoncées, les souches pathogènes sont parfois mal identifiés et l&#39;efficacité du vaccin diminue considérablement. En outre, l&#39;apparition de nouvelles souches de la grippe peut contourner ces programmes de prévention en cas de pandémie provoquant la maladie 2. La création d&#39;un vaccin contre la grippe universelle a été difficile à atteindre 5. Par conséquent, la recherche doit se poursuivre dans la compréhension de la pathogenèse des lésions pulmonaires. Pour la recherche en laboratoire de l&#39;installation, plusieurs méthodes ont été développées pour l&#39;isolement du virus et la propagation 6. Virus de la grippe humaine peuvent être amplifiés dans une variété de substrats de cellules de mammifères. Cependant, générant virus de titre élevé en grandes quantités sont mieux atteints dans des oeufs embryonnés. Le protocole suivant décrit une technique pour la grippe A propagation du virus et le stockage de stocks de virus existants.

<table><tbody><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Cellgro&nbsp ;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr> œufs <tr><td>de poule fécondés sans agent pathogène sérique (FPS)&nbsp ;</td>Incubateur d’œufs humidifié <td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modèle 2100</td><td></td></tr><tr><td>retourneur d’œufs automatique</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modèle 3200</td><td></td></tr><tr><td>bougie à œufs</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modèle 3300&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>aiguille 18G</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>aiguille 20G / 22G</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol>99,5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>dilué à 70 % à l’aide d’un</td></tr><tr><td>pistolet à colle à eau "Ad tech Hi Temp Projet Pro"</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>Colle modèle 1105</td><td></td></tr><tr><td>« Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>Cellules MDCK</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>Globules rouges de dinde lavés en pool, 10 %</td> <td>Laboratoires biologiques</td><td>Lampire 724908</td><td></td></tr></tbody></table>

virus de la grippe propagation dans embryonnés de poulet oeufs

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

L&#39;infection grippale est associée à environ 36 000 morts et plus de 200 000 hospitalisations chaque année aux États-Unis. L&#39;émergence continue de nouvelles souches de virus de la grippe en raison de la mutation et de réassortiment complique le contrôle du virus et nécessite le développement permanent de nouveaux médicaments et vaccins. L&#39;étude de la grippe en laboratoire nécessite une méthode fiable et rentable pour la propagation du virus. Ici, un protocole complet est fourni pour la grippe A propagation des virus dans des œufs de poule fertiles, ce qui donne toujours des stocks viraux à titre élevé. En bref, le sérum (SPF) des œufs de poule fécondés exempts d&#39;agents pathogènes sont incubées à 37 ° C et 55-60% d&#39;humidité pendant 10 à 11 jours. Sur cette période, le développement de l&#39;embryon peut être facilement contrôlé en utilisant un candler d&#39;oeuf. Virus inoculation est effectuée par injection de stock de virus dans la cavité allantoïque en utilisant une aiguille. Après 2 jours d&#39;incubation à 37 ° C, les oeufs sontréfrigérés pendant au moins 4 heures à 4 ° C. La coquille d&#39;oeuf au-dessus de la poche d&#39;air et la membrane chorio-allantoïde sont ensuite ouvert avec précaution, et le fluide allantoïque contenant le virus est récolté. Le liquide est éliminé de débris par centrifugation, aliquoté et transféré à -80 ° C pour stockage à long terme. La grande quantité (5-10 ml de liquide par oeuf contenant virus) titre et de haute virus qui est habituellement obtenue avec ce protocole a fait l&#39;utilisation d&#39;œufs pour la préparation de virus notre méthode favorable, en particulier pour les études in vitro qui nécessitent de grandes quantités de virus où des dosages élevés de la même stock de virus sont nécessaires.

Plusieurs méthodes ont été développées pour titrer le virus de la grippe. Une considération lors du choix d&#39;une méthode appropriée est que certains déterminer particules totales, indépendamment de la viabilité (par exemple, le dosage de l&#39;hémagglutinine) alors que d&#39;autres sont basés sur l&#39;infectiosité, qui permettra d&#39;évaluer virions viables (par exemple, essai de plaque) 6. Ici, le titre viral de liquide allantoïdien recueilli à partir d&#39;œufs de poulet inoculés avec...

Les œufs de poule fertiles sont largement utilisés pour produire de grandes quantités de virus de la grippe A humaine, car ils constituent un système pratique et rentable pour prouver des rendements élevés de virus.

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

L'objectif général de cette procédure est de produire de grandes quantités d'un virus de la grippe à haut titre, dans un système rentable. Cela est réalisé en premier lieu en obtenant des œufs de poule frais fécondés, exempts d'agents pathogènes sériques. Dans la deuxième étape, les œufs sont infectés par le virus de la grippe via la racine allantoïque.Pendant 48 heures, le liquide Alan Toic, contenant le virus, est ensuite récolté et le virus est congelé rapidement dans de l'azote liquide. En fin de compte, des dosages de plaques et d'hémagglutinine peuvent être réalisés pour déterminer l'influence du titre viral du liquide Alan Toic recueilli. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de récolte sont très sensibles et nécessitent une manipulation soigneuse des œufs ainsi qu'une bonne connaissance de leur anatomie.Avant de commencer la procédure, obtenez des œufs de caille fécondés et exempts d'agents pathogènes, auprès d'un fournisseur approprié. Dès leur arrivée, placez les œufs dans une incubateur à œufs humidifié équipé d'un retournement automatique, afin de faire tourner régulièrement les œufs à 37 degrés Celsius et à une humidité de 55 à 60 % pendant 10 à 11 jours. Après sept à huit jours d'incubation, portez des gants désinfectés à l'éthanol à 70 %.Essuyez un candélabreur à œufs avec de l'éthanol et transférez les œufs de l'incubateur vers les alvéoles vides des boîtes à œufs. Ensuite, éteignez les lumières et tenez l'extrémité large des œufs, un par un, contre le candélabreur. Si un œuf est fécondé, de fins vaisseaux sanguins menant à un embryon en forme de haricot doivent être clairement visibles.Si l'œuf est non fécondé, une petite tache de sang avec un jaune d'œuf visible sera observée. Jetez alors les œufs non fécondés et remettez l'œuf viable dans l'incubateur. Si l'état d'un œuf ne peut être confirmé, marquez-le pour une observation ultérieure au jour 10 ou 11 après la fécondation et, immédiatement avant utilisation, diluez un stock de virus de la grippe A à une concentration de 1 × 10³ à 10⁴ PFU par millilitre dans du PBS stérile supplémenté en hippies, puis placez-le sur de la glace.Ensuite, candidez de nouveau chaque œuf et éliminez tous les embryons morts et immobiles. Puis, retirez trois œufs de l'incubateur et disposez-les dans un support séparé. Avec les poches d'air vers le haut, marquez la poche d'air des œufs à l'aide d'un marqueur indélébile.Ensuite, lavez la zone située au-dessus de l'espace aérien avec de l'éthanol à 70 % et transférez les œufs, l'espace aérien vers le haut, dans un plateau à œufs placé à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique de niveau 2. Utilisez maintenant une aiguille stérile de calibre 18 pour percer un petit trou dans la coquille au-dessus de la poche d'air de chaque œuf, en prenant soin de ne pas insérer l'aiguille trop profondément afin d'éviter de blesser l'embryon ou le jaune.Ensuite, aspirez le virus de la grippe dilué dans une seringue stérile d'un millilitre. Fixez une aiguille de calibre 22 et insérez soigneusement l'aiguille à un angle de 45 degrés dans la cavité allantoïque du premier œuf. Injectez 0,2 millilitre du virus dilué dans l'œuf, puis, après avoir injecté les deux autres œufs, jetez la seringue et l'aiguille, et scellez chaque trou avec une goutte de colle provenant d'un pistolet à colle.S'assurer que la colle ne coule pas à l'intérieur de l'œuf, puis replacer les œufs dans l'incubateur. Une fois que tous les œufs ont été inoculés, incuber les œufs infectés à 37 degrés Celsius et à 60 % d'humidité, sans les retourner, pendant le temps d'incubation optimal. Selon le type de virus de la grippe.À la fin de la période d'incubation, refroidir les œufs pendant au moins quatre heures à quatre degrés Celsius afin de tuer l'embryon et de contracter les vaisseaux sanguins. Une fois que les œufs sont suffisamment refroidis, les transférer dans une hotte de sécurité biologique et les placer dans un support rigide, puis nettoyer les surfaces des œufs avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, utilisez des ciseaux stériles pour ouvrir la coquille au-dessus du sac d'air du premier œuf. Retirez la coquille autour du sac d'air, en prenant soin de ne pas endommager la membrane chorioallantoïdienne.Ensuite, utilisez des pinces stériles à extrémité plate pour ouvrir la membrane chorio-allantoïdienne et déplacez délicatement l'embryon et la vésicule vitelline à l'aide d'une petite spatule ou d'une cuillère, en prenant soin de ne pas rompre le vitellus. Puis, à l’aide d’une pipette Pasteur de un millilitre, prélève soigneusement le liquide allantoïdien en inclinant l’œuf sur le côté afin de recueillir autant de liquide que nécessaire. Chaque œuf doit fournir entre cinq et dix millilitres d’un liquide légèrement jaunâtre au moment de la récolte.Rassembler le liquide toïque d'Alan dans des tubes coniques en plastique de 50 millilitres sur de la glace. Une fois tout le liquide recueilli, centrifuger le virus et transférer le liquide clair dans un nouveau tube de 50 millilitres placé sur de la glice. Enfin, jeter les œufs dans un contenant de déchets BSL-2 et passer immédiatement au liquide toïque clarifié LAN.Ensuite, faites une congélation rapide en plongeant le virus dans l'azote liquide, puis placez les tiges congelées dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour le stockage à long terme, l'infection par le virus de la grippe provoque un effet cytopathique entraînant la formation de zones circulaires de cellules lacunaires, ou plaques, sur une monocouche cellulaire. Dans cette expérience, les plaques ont été mises en évidence par coloration des cellules au violet de crésyl, et 65 plaques ont été comptées dans le puits ayant reçu une dilution du virus de un fois 10 à la puissance moins 12, car 500 microlitres du stock viral dilué ont été cultivés sur les cellules.Dans cette expérience, le titre final était de 1,3 fois 10 à la puissance 14 PFU par millilitre. Le test d'hémagglutination est une méthode de titrage du virus de la grippe fondée sur la capacité du virus à s'attacher à la surface des globules rouges. Comme observé, la suspension virale agglutine les globules rouges, empêchant ceux-ci de se déposer hors de la suspension.Un résultat clairement négatif a été observé avec une dilution de deux à la puissance moins dix du virus dans 50 microlitres. Par conséquent, le titre final est de 2,1 × 10⁴ HAU par millilitre. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la propagation du virus de la grippe par inoculation d'œufs de poule et de la récolte du liquide allantoïque contenant le virus.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Sauvetage des virus grippaux A partir de l'ADN plasmidique est une technique de base et essentiels expérimentale qui permet aux chercheurs de la grippe pour générer des virus recombinants pour étudier les multiples aspects de la biologie du virus de la grippe, et pour être utilisés comme vecteurs potentiels ou de vaccins.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Une infection concomitante par le virus grippal A est l'un des facteurs impliqués dans l'induction de la maladie invasive à pneumocoques pendant...

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Cette vidéo présente une technique permettant de générer des variants d’échappement d’anticorps monoclonaux neutralisants du virus de la grippe. Une suspension virale neutralisée par anticorps est injectée dans des œufs de poule embryonnés pour propager les variants d’échappement de manière sélective. Il en résulte une population virale principalement composée de variants d’échappement, confirmée par un test d’hémagglutination.

Génération de variants d’échappement du virus de la grippe contre les anticorps neutralisants

La vidéo présente une méthode pour créer des virus grippaux recombinants adaptés au froid. Il s’agit de transfecter des cellules humaines avec des plasmides bidirectionnels, suivi d’une incubation à basse température pour produire des virus adaptés à la production de vaccins, caractérisés par une réplication réduite dans des conditions plus chaudes.

Génération de virus grippaux vivants atténués recombinants pour les vaccins

Virus de la maladie de Newcastle (NDV) a été largement étudiée au cours des dernières années afin de développer de nouveaux vecteurs pour la vaccination et le traitement, entre autres. Ces études ont été possibles grâce à des techniques de sauvetage virus recombinant à partir d'ADNc, comme celles que nous décrivons ici.

Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d&#39;ADNc

Des modèles systémiques et localisés d’infection par le virus de la grippe A humaine sont présentés. À l’aide d’un modèle d’infection systémique, le poisson-zèbre peut être utilisé pour dépister les médicaments antiviraux. À l’aide d’un modèle d’infection localisée, le poisson-zèbre peut être utilisé pour caractériser les réponses des cellules immunitaires de l’hôte.

Utilisation de modèles Zebrafish de grippe humaine A Infections au virus pour le dépistage médicaments antiviraux et Caractériser hôte réponses immunitaires cellulaires

Ici, nous avons fourni une méthode pour atteindre la transfection stable des parasites de poulet Eimeria par nucléozoites nucléozoites ou merozoites de deuxième génération. Les parasites eimeriens génétiquement modifiés exprimant des gènes antigéniques hétérologues pourraient être utilisés comme vecteurs de vaccination.

Nucléofection et propagation in vivo des parasites de poulet Eimeria

L’objectif global de cet article est de décrire comment effectuer une injection intracellulaire ovo de matériaux exogènes dans des embryons de poulet. Cette approche est très utile pour étudier la biologie du développement des embryons de poulet.

À Ovo Injection intravasculaire dans des embryons de poulet

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production, la purification et la quantification du virus recombinant à haut titre de la maladie de Newcastle. Ce protocole donne systématiquement &gt; 6 × 109 unités formant de la plaque / mL, fournissant des quantités de virus appropriées pour les études animales in vivo . Des tests de contrôle de la qualité supplémentaires pour assurer la sécurité in vivo sont décrits.

Production du virus recombinant de la maladie de Newcastle à haut titre à partir du liquide allantoïque

Cette méthode présente l’embryon de poulet comme un modèle in vivo simple et rentable pour faire revivre l’agent pathogène bactérien L. monocytogenes à partir d’un état viable mais non cultivable (VBNC) et avec des utilisations potentielles dans la compréhension des mécanismes de dormance bactérienne.

L’embryon de poulet comme modèle in vivo pour faire revivre des agents pathogènes viables mais non cultivables

Apprenez à produire du virus influenza A à haut titre dans des œufs de poulet embryonnés. Cette méthode économique permet d'obtenir des quantités importantes de virus pour la recherche virologique et le développement vaccinal.

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

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