Enregistrement Light-réponses évoquées dans les neurones post-synaptiques dans Dark-adaptés, Préparations rétine de la souris tranche en utilisant des techniques de patch clamp

L'objectif général de cette expérience est d'obtenir des enregistrements de la réponse à la lumière de neurones rétiniens adaptés à l'obscurité. Cela est réalisé en premier lieu par la récupération d'un œil de souris. La deuxième étape consiste à isoler la rétine et à la découper pour préparer des tranches.

Ensuite, le prélèvement rétinien est monté et observé au microscope afin de repérer une cellule cible pour les enregistrements en configuration de patch clamp. Après avoir établi une configuration de patch clamp en mode cellule entière, un stimulus lumineux est appliqué à proximité de la cellule. Enfin, la réponse électrophysiologique simultanée peut être observée à l’aide d’un logiciel d’acquisition.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'imagerie KRC réside dans sa grande sensibilité d'enregistrement et dans la possibilité d'identifier morphologiquement les cellules enregistrées. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car travailler dans l'obscurité totale peut s'avérer difficile et désorientant pour ceux qui n'y sont pas habitués. Pour commencer une série, placer les outils de dissection et les pipettes de transfert à proximité du microscope stéréoscopique.

Le poste de travail sera bien organisé afin que chaque outil puisse être facilement accessible dans l'obscurité. Lorsque vous êtes prêt, utilisez un viseur infrarouge pour effectuer la procédure dans l'obscurité. Après l'euthanasie, énucléez rapidement les yeux et placez-les dans une boîte contenant une solution de dissection froide, en travaillant sous un microscope dans une boîte sombre.

Transférez un œil dans une boîte contenant une solution de dissection froide, continuellement saturée en oxygène. Pour retirer la cornée et le cristallin, maintenez le nerf optique à l'autre extrémité du globe oculaire afin d'éviter tout déplacement, puis effectuez une incision au sommet de la cornée à l'aide d'un couteau microchirurgical.

Étendez l'incision à l'aide d'une paire de ciseaux chirurgicaux et retirez la cornée, en laissant une partie de la sclère qui l'entoure. Ensuite, saisissez le cristallin avec une pince fine et retirez-le lentement. Une fois la cupule oculaire formée, versez délicatement une solution de dissection froide et oxygénée dans la cupule à l'aide d'une petite pipette de transfert.

Travaillez rapidement pour conserver la forme de la rétine et appliquez une pression douce pour identifier les côtés dorsal et ventral de la rétine. Utilisez des viseurs infrarouges pour repérer la ligne traversant la cupule oculaire rétinienne, en passant près de la tête du nerf optique. Cette ligne traverse principalement le côté ventral du nerf optique, et le côté comprenant le nerf optique correspond au côté dorsal.

En fonction de l'expérience, effectuez une incision sur le côté ventral ou dorsal. Cela indique le côté inutile et constitue un repère utile pour la suite. Ensuite, retirez délicatement le vitré à l'aide de pinces extra-fines sans toucher la rétine.

Le vitré est principalement attaché à la partie inférieure et au bord externe de la cupule oculaire. Comme le vitré pourrait être solidement fixé à la cupule oculaire, procédez délicatement pour éviter un décollement rétinien. Continuez à tirer jusqu'à ce qu'aucune tension ne soit ressentie.

Une fois la rétine isolée, saisissez la sclérotique et détachez délicatement la rétine. À l'aide de l'extrémité opposée de la pince, taillez la rétine et jetez la moitié inutile dans le même plat en plastique. Coupez la rétine restante en deux morceaux, chacun en deux parties.

Couper les bords pour former une tranche de rétine et rogner les bords repliés. Ensuite, utiliser une pipette de transfert de grande taille pour déposer une tranche de rétine sur une plaque de verre. Aspirer la solution excédentaire à l’aide d’une petite pipette et utiliser un morceau de papier filtre pour aplatir la tranche.

Placez délicatement un morceau de membrane filtrante sur le tissu à l’aide d’une petite pipette de transfert. Déposez une goutte de solution de dissection sur la membrane filtrante. Attendez environ 15 secondes pendant que la solution s’étend et fait adhérer le tissu rétinien à la membrane filtrante.

Une fois collés ensemble, versez davantage de solution de dissection froide dessous et autour du filtre jusqu'à ce que la membrane flotte. Ensuite, placez la membrane filtrante dans la chambre de découpe et recouvrez-la de solution de dissection. En travaillant rapidement afin de garantir que la membrane ne s'assèche pas, utilisez le hachoir pour découper le tissu rétinien en tranches.

Placer une lame en plastique munie de rails de graisse dans la chambre de découpe. Transférer une coupe rétinienne sur les rails de graisse et faire pivoter la coupe de 90 degrés afin que la section transversale soit visible. Appuyer la membrane filtrante contre la lame avant de recouvrir les côtés du papier filtre avec de la graisse.

Une fois les tranches immobilisées sur une lame en plastique, transférez-la dans une boîte plastique de 33 millimètres. Immergez la préparation dans une solution de dissection au charbon et conservez chaque boîte dans une boîte sombre continuellement oxygénée. Pour les enregistrements en enregistrement par électrode à patch.

Préparez les tubes de perfusion en les remplissant de milieu AIMs et laissez passer toutes les bulles présentes dans les tubulures. Après avoir fabriqué les pipettes d’enregistrement à l’aide d’un puller à verre, remplissez la pointe avec la solution de pipette. Ensuite, utilisez un fill-fil pipette pour remplir environ le tiers de la pipette ; une fois remplie, rangez chaque pipette dans une boîte à pipettes humide.

Ensuite, allumez l'équipement nécessaire aux enregistrements sur plantes en configuration de patch, y compris l'amplificateur, la caméra CCD et le microscope fonctionnant en conditions sombres. Placez une préparation de coupe rétinienne sur la platine du microscope à l'aide d'un viseur infrarouge. Une fois immobilisée, commencez une perfusion continue.

Régler la température de perfusion à 33 à 37 degrés Celsius. Observer la surface de la tranche à l'aide d'une caméra CCD. Mettre au point l'emplacement cible.

Lorsque les types cellulaires cibles sont localisés, sélectionnez une cellule en bon état pour un enregistrement en configuration patch clamp. Une fois qu'une cellule saine a été identifiée, placez une pipette d'enregistrement dans un support de pipette et avancez la pipette vers la préparation de tranché. Lorsqu'elle est proche de la préparation de tranché, localisez la pointe de la pipette à l'aide d'un microscope.

Une fois que la pointe de pipette est visible au microscope, abaissez-la vers la cellule cible. Ensuite, réglez l'amplificateur et ajustez la pipette au pika amp. Cinq volts par nanoampère.

Appliquez une impulsion électrique continue d'environ cinq millivolts et d'environ 10 hertz, puis vérifiez la résistance de la pipette. Une résistance idéale se situe entre cinq et douze mégohms. Pour la plupart des neurones rétiniens.

Lorsque vous êtes prêt, utilisez un embout buccal ou une seringue pour expulser la solution interne jusqu'à ce que l'extrémité de la pipette se trouve à la surface de la cellule cible. Lorsque la pression positive crée un petit affaissement à la surface de la cellule, avancez légèrement l'extrémité et cessez d'expulser. Si la résistance de la pipette augmente continuellement, laissez-la en place et surveillez la résistance jusqu'à ce qu'elle dépasse un gigaohm.

Si la résistance n'augmente pas spontanément, appliquez doucement une pression négative jusqu'à l'obtention d'un scellement gigaohmique. Une fois le scellement gigaohmique obtenu, modifiez le potentiel de maintien à moins 70 millivolts, puis appliquez de manière intermittente une pression négative afin de rompre la membrane à l'intérieur de l'extrémité de la pipette. Lorsque la configuration en cellule entière est établie, la résistance de la pipette peut varier entre 500 mégohms et un gigaohm, et le courant capacitif devient observable.

Enregistrez la relation intensité-tension entre moins 80 et 40 millivolts. Différents types de canaux activés par le voltage seront recrutés selon le type cellulaire. Enfin, enregistrez les courants ou tensions synaptiques induits par la lumière.

Cette préparation de coupe observée à 10 x montre à la fois les photorécepteurs et les cellules ganglionnaires, sans détachement du papier filtre. Lorsque cette préparation est observée avec un objectif de 60 x, chaque couche cellulaire est clairement visible. Des potentiels postsynaptiques excitateurs induits par la lumière, provenant des neurones rétiniens, ont été déclenchés en réponse à un stimulus lumineux en palier.

L'amplitude maximale et la durée de décroissance varient selon le type et le sous-type cellulaire. Le type cellulaire et son sous-type morphologique ont été révélés par marquage au soufre après les enregistrements physiologiques, une fois le développement terminé. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur la rétine pour étudier les fonctions de la signalisation visuelle naturelle, ainsi que les contributions des mécanismes synaptiques.