Enregistrement Light-réponses évoquées dans les neurones post-synaptiques dans Dark-adaptés, Préparations rétine de la souris tranche en utilisant des techniques de patch clamp

L’objectif global de cette expérience est d’obtenir des enregistrements de la réponse à la lumière à partir de neurones rétiniens adaptés à l’obscurité. Ceci est accompli en prélevant d’abord un œil de souris. La deuxième étape consiste à isoler la rétine et à la couper pour des préparations de tranches.

Ensuite, la préparation rétinienne est montée et visualisée au microscope pour trouver une cellule cible pour les enregistrements par patch clamp. Après avoir établi une configuration de patch clamp pour l’ensemble de la cellule, un stimulus lumineux est appliqué à proximité de la cellule. Enfin, une réponse électrophysiologique simultanée peut être observée à l’aide d’un logiciel d’acquisition.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’imagerie KRC, est que la sensibilité d’enregistrement est élevée et que les cellules d’enregistrement peuvent être identifiées morphologiquement. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car travailler dans l’obscurité totale peut être difficile et désorientant pour ceux qui n’ont pas l’habitude de le faire. Pour commencer une gamme, les outils de dissection et les pipettes de transfert près du microscope de dissection.

La zone de travail sera bien organisée afin que chaque outil soit facilement accessible dans l’obscurité. Lorsque vous êtes prêt, Dawn utilise un viseur infrarouge pour effectuer la procédure dans l’obscurité. Après l’euthanasie, nucléez rapidement les yeux et placez-les dans un plat de solution froide de dissection, conservé dans une boîte sombre travaillant au microscope.

Transférez un œil dans un plat avec une solution de dissection froide. Boursouflé d’oxygène en permanence. Pour enlever la cornée et le cristallin, tenez le nerf optique à l’autre extrémité du globe oculaire pour l’empêcher de bouger et faites une incision sur le dessus de la cornée avec un couteau microchirurgical.

Prolongez la coupe à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux et retirez la cornée, en laissant un peu de sclérotique autour d’elle. Ensuite, saisissez l’objectif avec une pince fine et retirez-le lentement. Une fois l’œilleton fabriqué, versez doucement la solution de dissection froide et oxygénée dans l’œilleton à l’aide d’une petite pipette de transfert.

Travaillez rapidement pour maintenir la forme de la rétine et utilisez une légère pression pour identifier les côtés dorsal et ventral de la rétine. Utilisez des visionneuses infrarouges pour identifier la ligne traversant l’œilleton rétinien, passant près de la tête du nerf optique. Cette ligne passe principalement par la face ventrale du nerf optique et le côté, y compris le nerf optique, est le côté dorsal.

Selon l’expérience, faites une incision sur la face ventrale ou dorsale. Cela marque le côté inutile et constitue un marqueur utile pour aller de l’avant. Ensuite, retirez délicatement le vitré à l’aide d’une pince extra fine sans toucher la rétine.

Le vitré est principalement fixé au bas et au bord externe de l’œilleton. Comme le vitré peut être étroitement fixé à l’œilleton, procédez doucement à l’élimination du décollement de la rétine. Continuez à tirer jusqu’à ce qu’aucune tension ne se fasse sentir.

Une fois la rétine isolée, saisissez la sclérotique et décollez doucement la rétine. À l’aide de l’arrière de la pince, coupez la rétine et jetez la moitié inutile dans le même plat en plastique. Coupez le reste de la rétine en deux morceaux pour chaque morceau.

Coupez les bords pour faire une plaque rétinienne et coupez les bords pliés. Ensuite, utilisez une grande pipette de transfert pour transférer une plaque rétinienne sur une plaque de verre. Aspirez l’excès de solution à l’aide d’une petite pipette et utilisez un morceau de papier filtre pour aplatir la plaque.

Placez délicatement un morceau de la membrane filtrante sur le tissu à l’aide d’une petite pipette de transfert. Placez une goutte de solution de dissection sur la membrane filtrante. Attendez environ 15 secondes pendant que la solution se répand et colle le tissu rétinien à la membrane filtrante.

Une fois collés ensemble, versez plus de solution de dissection froide sous et autour du filtre jusqu’à ce que la membrane flotte. Ensuite, placez la membrane filtrante dans la chambre de tranchage et recouvrez d’une solution de dissection. En travaillant rapidement pour s’assurer que la membrane ne se dessèche pas, utilisez le hachoir pour couper le tissu rétinien en tranches.

Placez une lamelle en plastique avec des rails de graisse dans la chambre de tranchage. Transférez une tranche rétinienne sur les rails de graisse et faites pivoter la tranche de 90 degrés pour que la section transversale soit visible. Appuyez sur la membrane filtrante sur la lamelle de recouvrement avant de recouvrir les côtés du papier filtre de graisse.

Une fois les tranches immobilisées sur une lamelle en plastique, transférez-les dans un plat en plastique de 33 millimètres. Immergez la préparation dans une solution de dissection de charbon et conservez chaque plat dans une boîte sombre qui est oxygénée en continu. Pour les enregistrements par patch clamp.

Amorcez les tubes de profusion avec des visées moyennes et laissez passer toutes les bulles du tube. Après avoir fabriqué des pipettes d’enregistrement avec une polaire en verre, remplissez la pointe avec la solution de pipette. Ensuite, utilisez une micro-pipette pour remplir environ un tiers de la pipette une fois remplie, rangez chaque pipette dans une boîte à pipette humide.

Ensuite, allumez l’équipement pour les enregistrements de l’usine de patchs, y compris l’amplificateur de l’ordinateur, la caméra CCD et le microscope fonctionnant dans des conditions sombres. Placez une préparation de coupe rétinienne sur la platine du microscope à l’aide d’une visionneuse infrarouge. Une fois qu’il est immobilisé, commencez la perfusion continue.

Réglez la température de perfusion sur 33 à 37 degrés Celsius. Visualisez la surface de la tranche à l’aide d’une caméra CCD. Concentrez-vous sur l’emplacement cible.

Une fois les types de cellules cibles résidents, sélectionnez une cellule d’apparence saine pour un enregistrement de patch clat. Une fois qu’une cellule saine est identifiée, placez une pipette d’enregistrement dans un porte-pipette et avancez la pipette jusqu’à la préparation de la tranche. Lorsqu’il est proche de la préparation de la tranche, trouvez l’extrémité de la pipette à l’aide d’un microscope.

Une fois que la pointe de la pipette est visible au microscope, déplacez la pointe vers le bas vers la cellule cible. Ensuite, réglez l’amplificateur et ajustez la pipette sur pika amp. Cinq volts par ampli Nana.

Démarrez une impulsion électrique continue d’environ cinq millivolts et d’environ 10 hertz et vérifiez la résistance de la pipette. Une résistance idéale se situe entre cinq et 12 méga ohms. Pour la plupart des neurones rétiniens.

Lorsque vous êtes prêt, utilisez un embout buccal ou une seringue pour souffler la solution interne jusqu’à ce que la pointe de la pipette soit à la surface de la cellule cible. Lorsque la pression positive fait une petite fossette à la surface de la cellule, avancez légèrement l’extrémité et arrêtez de souffler. Si la résistance de la pipette augmente continuellement, laissez-la et surveillez la résistance jusqu’à ce qu’elle atteigne plus d’un giga ohm.

Si la résistance n’augmente pas spontanément, appliquez doucement une pression négative jusqu’à ce qu’elle devienne un giga joint. Une fois l’étanchéité giga obtenue, modifiez le potentiel de maintien à moins 70 millivolts, puis appliquez par intermittence une pression négative pour rompre la membrane à l’intérieur de la pointe de la pipette. Lorsque la configuration de l’ensemble de la cellule est réalisée, la résistance de la pipette peut être comprise entre 500 mégaohms et un giga ohm, et le courant capacitif est observable.

Enregistrez la relation IV de moins 80 à 40 millivolts. Différents types de canaux voltage-dépendants seront activés en fonction du type de cellule. Enfin, enregistrez les courants ou tensions synaptiques évoqués par la lumière.

Cette préparation de coupe vue à 10 x montre à la fois les photorécepteurs et les cellules ganglionnaires sans détachement du papier filtre. Lorsque cette préparation est observée avec un objectif 60x, chaque couche cellulaire est clairement observée. La lumière a évoqué des potentiels postsynaptiques excitateurs des neurones rétiniens en réponse à une lumière de pas.

L’amplitude de crête et le temps de décroissance varient en fonction du type et du sous-type de cellule. Le type cellulaire et son sous-type morphologique ont été révélés par marquage au soufre après des enregistrements physiologiques après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux scientifiques dans le domaine de la recherche sur la rétine pour étudier les fonctions de la signalisation visuelle naturelle, ainsi que les contributions des mécanismes synaptiques.