Name: Quantification de limmunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant LC-MS / MS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Découvrez la quantification du tacrolimus sur des taches de sang séché par LC-MS/MS pour le suivi thérapeutique des immunosuppresseurs. Cette méthode permet un prélèvement peu invasif et améliore l'observance des patients.

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Ce travail a été soutenu par le contrat de la Federal Drug Administration (FDA) des États-Unis HHSF223201310224C et la subvention 1U01FD004573-01 des National Institutes of Health/FDA des États-Unis.

Des échantillons de sang de-identifiés de personnes en bonne santé ont été de l&#39;Université de Colorado Hospital (Aurora, Colorado). L&#39;utilisation d&#39;échantillons sanguins bancaires dépersonnalisées pour les études de validation ainsi que pour la préparation des étalons et d&#39;échantillons de contrôle de qualité a été considéré comme «exonéré» par le Conseil Colorado multi-institutionnel de révision (COMIRB, Aurora, Colorado). 1. Préparation de références et Solutions <ol><li> Achat tacrolimus et l&#39;étalon interne D 2, 13 C-tacrolimus auprès des vendeurs figurant dans la liste des matériaux. <ol><li> Préparation des solutions mères dans du methanol pur à une concentration de 1 mg / ml pour le tacrolimus et une concentration de 10 ug / ml pour 13 D 2, C-tacrolimus. Assurez solutions de stockage de matériaux de référence basé sur trois pondérations indépendants. Aliquote solutions mères et conserver à -70 ° C ou moins. </li></ol></li><li> Préparer la solution pour précipiter les protéineset extraire le tacrolimus en utilisant du méthanol / 0,2 M ZnSO 4 dans l&#39;eau (7: 3, v: v). Cette solution contient également de l&#39;étalon interne D 2, C-13 tacrolimus à une concentration de 2,5 ng / ml et est utilisé pour l&#39;extraction de tous les échantillons à l&#39;exception de l&#39;extraction des échantillons à blanc (s&#39;il vous plaît voir 1.3.3). <ol><li> Préparer cette solution de protéines de précipitation fraîchement chaque jour d&#39;extraction et définir l&#39;expiration de la solution à 12 h. </li></ol></li><li> Préparation de la courbe d&#39;étalonnage et de contrôle de qualité (QC) échantillons <ol><li> Préparer des solutions mères de tacrolimus en effectuant des dilutions appropriées de la solution mère en utilisant du méthanol pur. </li><li> Pour préparer les étalons et les échantillons de contrôle de la qualité, spike 20 pi de solution stock diluée de manière appropriée dans le sang total EDTA, incuber à 37 ° C sous agitation dans un bain d&#39;eau douce pour permettre une distribution homogène de tacrolimus dans les composants cellulaires du sang pour 20 min et aliquote dans 1,5 ml polyperopylene tubes à fond conique et enfichable sur les couvercles. Assurez-vous que le volume relatif de solvant organique ne dépasse pas 5%. </li><li> Point 50 pi du sang total à pointes dans le milieu de chaque cercle sur les cartes de filtre à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Sécher les taches de sang sur les cartes de filtre à la température ambiante pendant 3 heures. </li><li> Préparer des normes d&#39;étalonnage de tacrolimus dans le sang total humain de l&#39;EDTA à des concentrations de tacrolimus de 1, 2,5, 5, 10, 25, et 50 ng / ml. Préparer un échantillon à blanc pour l&#39;extraction comme les normes d&#39;étalonnage avec la solution de protéines de précipitation contenant le standard interne D 2, 13 C-tacrolimus («échantillon zéro&quot;). </li><li> Préparer les échantillons de CQ en tout EDTA sang humain à des concentrations de 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Préparer un échantillon témoin. A la différence des échantillons QC qui sont extraits par précipitation contenant le standard interne D 2, C-13 tacrolimus, extraire cette solution échantillon à blanc avec la protéine de précipitations qui faitpas contenir de l&#39;étalon interne D 2, 13 C-tacrolimus (&quot;échantillon blanc&quot;). </li></ol></li><li> Collection d&#39;échantillons cliniques <ol><li> Recueillir taches de sang séché comme décrit dans 43,44. </li></ol></li></ol> 2. Extraction de Tacrolimus sang séché des échantillons ponctuels <ol><li> Visuellement inspecter la tache de sang séché pour assurer une qualité acceptable et le volume 45 échantillon. </li><li> Frappe du centre tache de sang sur la carte du filtre avec une perforation de 6 mm. Remarque: La qualité des poinçons peut être contrôlée par pesée. Un disque de filtre saturé de poing pèse en moyenne 5,02 mg ± 0,09 mg (gamme: 4.83- 5.14 mg, n = 12). </li><li> La place des disques dans 1,5 ml tubes en polypropylène à fond conique et couvercles encliquetables. </li><li> Ajouter 20-30 balles à chaque tube. </li><li> Ajouter 500 ul de la solution de précipitation de protéines (methanol: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, v: v à 2,5 ng / ml d&#39;étalon interne) dans chaque tube. Pour l&#39;extraction des échantillons blancs, utiliser la solution de précipitation des protéines sans l&#39;étalon interne. </li><li> Homogénéiser les disques dans le mélangeur de balle pendant 1 min (vitesse maximale, le réglage &quot;10&quot;). </li><li> Agiter les échantillons à température ambiante sur la multi-tubes vortex (vitesse maximale, le réglage &quot;10&quot;) pendant 10 min. </li><li> Centrifuger les échantillons à 16 000 x g et 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Transférer le surnageant dans des flacons de HPLC en verre équipé d&#39;un insert de 300 ul. Utilisez pré-fente joints en téflon. Remarque: Extrait échantillons peuvent être conservés à -20 ° C ou moins jusqu&#39;à l&#39;analyse LC-MS / MS. </li></ol> 3. LC-MS / MS Analysis <ol><li> Charge: 100 pi de surnageant de l&#39;extrait de l&#39;échantillon sur la colonne d&#39;extraction de la cartouche d&#39;C8 et laver avec un 7: 3 de l&#39;acide formique à 0,1% dans l&#39;eau: acétonitrile à un débit de 5 ml / min pendant 1 min. Les connexions de la soupape de commutation sont représentés sur la figure 2 et le gradient gérées par la pompe d&#39;extraction dans le tableau 1 </stRong&gt;. </li><li> Ci-après, activer la soupape de commutation résultant à l&#39;arrière-ras des analytes de la pré-colonne sur la colonne analytique. </li><li> Réglez la colonne thermostat à 65 ° C. </li><li> Éluer les analytes de la colonne analytique à l&#39;aide des débits et gradient indiquées dans le tableau 1. </li><li> Branchez la colonne analytique à un spectromètre de masse en tandem via la source d&#39;ionisation électrospray turbo. Régler les paramètres clés du spectromètre de masse selon le tableau 2. </li><li> Détecter les ions positifs ([M + Na] +) de dans le mode de réaction multiple (MRM). Utilisez les transitions d&#39;ions suivants pour la quantification: tacrolimus: m / z (masse / charge) = 826,6 → 616,2 et D 2, 13 C-tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2. Remarque: La durée totale est de 4,6 min. </li></ol> 4. Quantification <ol><li> Pour chaque terme, générer une courbe d&#39;étalonnage sur la base des calibrateurs préparés et 1.3.5inclure dans chaque série d&#39;analyses. <ol><li> Générer une courbe d&#39;étalonnage en portant les concentrations nominales par rapport facteur d&#39;analyte de réponse (Peak [Analyte] / Peak [étalon interne]) en utilisant le logiciel du spectromètre de masse. </li><li> Monter les calibrateurs en utilisant un ajustement quadratique en combinaison avec 1 / X pondération. </li></ol></li><li> Pour la quantité de tacrolimus dans les taches de sang séché intégrer le tacrolimus et de l&#39;étalon interne dans les chromatogrammes MRM extraites. Calculer le facteur de réponse pour le tacrolimus (Peak [Analyte] / Peak [étalon interne]) et comparer avec la courbe d&#39;étalonnage en utilisant le logiciel de spectrométrie de masse. </li></ol> 5. Les procédures de validation <ol><li> Limite inférieure de détection (LLOD) et la limite inférieure de quantification (LIQ). <ol><li> Considérons la plus faible concentration de tacrolimus avec un rapport de crête à bruit de 4: 1 comme limite inférieure de détection (LLOD). Définir la limite inférieure de quantification (LIQ) en tant quela plus faible concentration de la courbe d&#39;étalonnage avec une précision égale ou supérieure à ± 20% d&#39;écart de la concentration nominale et une précision égale ou supérieure à 20% (coefficient de variation). </li></ol></li><li> Intra- et précision inter-jour et précisions. <ol><li> Testez l&#39;exactitude et la précision à quatre niveaux de 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) et 40 ng / ml (QC4) concentration. </li><li> Préparer les échantillons QC de chaque jour de la validation dans le sang total EDTA humain, sèche sur les cartes de filtre, extraire et analyser comme décrit ci-dessus. </li><li> Déterminer la précision intra-jour et la précision avec 6 échantillons par niveau de concentration de QC. </li><li> Évaluer la précision inter-journée et une précision de plus de 20 jours. Mesurer chaque niveau QC avec 4 échantillons par jour. </li><li> Analyser les deux courbes d&#39;étalonnage avec des échantillons QC de chaque jour. </li><li> Calculer la précision intra-jour que le% de la concentration nominale (six échantillons par niveau de concentration, s&#39;il vous plaît voir 5.2.2). Calculer précision que le coefficient de variance (CV%). </li><li> Envisager la précision intra-day acceptable si elle tombe dans l&#39;acceptation limite de 85% à 115% de la concentration nominale. Considérez précision intra-day acceptable si elle est égale ou supérieure à un CV (coefficient de variation) de 15%. </li><li> Calculer la précision inter-jour et de précision que la moyenne pour chaque niveau de concentration QC analysé au cours des 20 jours de validation. </li><li> Envisager la précision moyenne inter-jour acceptable si elle tombe dans l&#39;acceptation limite de 85% à 115% de la concentration nominale. Considérons précision inter-jour acceptable si elle est égale ou supérieure à une CV (coefficient de variation) de 15%. </li></ol></li><li> Exclusion des interférences de la matrice. <ol><li> Pour l&#39;exclusion des interférences qui peuvent être causés par des signaux de la matrice, d&#39;analyser taches blanches séchées de sang (8 individus différents, de préférence 4 hommes et 4 femmes). </li><li> Inspecter visuellement chromatogrammes ioniques. Si pics dans le temps de rétentionfenêtre de tacrolimus sont détectés, d&#39;intégrer et de comparer leurs domaines sous la courbe avec celles des pics de tacrolimus dans les échantillons blancs enrichis avec le tacrolimus à la LLOQ. La zone de pics dans les échantillons blancs ne sont pas censés dépasser 15% de ceux de tacrolimus à la LLOQ. </li></ol></li><li> Ion suppression / amélioration d&#39;ions. <ol><li> Utiliser un protocole de perfusion post-colonne telle que décrite 45 pour évaluer l&#39;interférence potentielle de renforcement ion suppression / d&#39;ions provoquée par des composants de matrice de co-élution. </li><li> Infuser le tacrolimus à une concentration de 10 pg / ml dissous dans de l&#39;acide formique à 0,1%: methanol (30:70, v / v) post-colonne à un débit de 10 ul / min. <ol><li> Raccorder une pompe à seringue par l&#39;intermédiaire de la pièce en T entre la colonne analytique et de la source d&#39;électronébulisation le spectromètre de masse. </li><li> Surveiller l&#39;intensité du signal MS / MS des transitions MRM tacrolimus et son étalon interne (m / z = 826,6 → 616,2 et m / z = 829,6 → 619,2) après injection de extracTED échantillons blancs (n = 8 échantillons provenant d&#39;individus différents). Remarque: En l&#39;absence d&#39;amélioration ions suppression / ion du signal continu causé par perfusion des analytes ne devrait pas être affectée par l&#39;injection de la matrice de blanc, tandis que la suppression d&#39;ions provoque un plongeon du signal et de l&#39;ion amélioration un pic. </li></ol></li></ol></li><li> Reporter. <ol><li> Évaluer le potentiel de report en analysant extrait des échantillons blancs après les plus hauts calibrateurs (50 ng / ml, n = 6). </li><li> Inspecter visuellement chromatogrammes ioniques. Si des pics dans la fenêtre de temps de rétention de tacrolimus sont détectés, d&#39;intégrer et de comparer leurs domaines sous la courbe avec celles des pics de tacrolimus dans les échantillons blancs enrichis avec le tacrolimus à la LLOQ. La zone de pics dans les échantillons blancs ne sont pas censés dépasser 15% de ceux de tacrolimus à la LLOQ. </li></ol></li><li> Recouvrements d&#39;extraction. <ol><li> Déterminer les recouvrements en comparant les signaux des analytes après extraction de QC samples à tous les quatre niveaux de concentration (n = 6) par concentration avec ceux des vierges taches de sang séché dopés avec des quantités correspondantes de tacrolimus après l&#39;extraction. </li><li> Préparer quatre ensembles de cercles de qualité (taux de concentration: 2, 4, 20, 40 ng / ml). </li><li> Préparer 4 autres ensembles de «échantillons de test de récupération&quot; correspondant en repérant 50 pi de sang total EDTA vierge sur les cartes de papier filtre et le séchage pendant 2 heures. </li><li> Ci-après, à la fois pour le QC et «échantillons de test de récupération&quot; vierges, découper la tache de sang entier sur la carte du filtre avec des ciseaux et placez les disques résultant dans un tube en polypropylène à fond conique et le couvercle snap-on. </li><li> Extraire tous les échantillons. </li><li> Transférer les surnageants (400 pi) dans des flacons de HPLC de verre. </li><li> Ajouter la solution tacrolimus boursier pour les «échantillons de test de récupération extrait&quot; vierges pour atteindre des concentrations de 2, 4, 20 et 40 ng / ml (4 pi de 200, 400, 2000, 4000 ng ml tacrolimus Stock sol /utions à 400 ul de surnageant). </li><li> Après analyse LC-MS / MS, comparer les signaux dans les deux échantillons QC et échantillons d&#39;essai &quot;de récupération&quot; de la concentration correspondante (récupération =% des échantillons de signaux avant que les échantillons dopés extraction / signaux dopés après extraction x 100). </li></ol></li><li> L&#39;intégrité de dilution. <ol><li> Établir l&#39;intégrité de la dilution en utilisant des échantillons enrichis avec des analytes à 500, 250 et 100 ng / ml. </li><li> Après extraction, diluer les échantillons en utilisant une solution de protéine de précipitation (1:10, n = 3 par niveau de concentration). </li><li> Calculer écarts par rapport aux concentrations nominales. Examiner les résultats qui relèvent de 85% -115% de la valeur nominale acceptable. </li></ol></li><li> Stabilités. <ol><li> Enquêter stabilités en utilisant les échantillons QC à tous les quatre niveaux de concentration (n = 4 par concentration) ont analysé à différents points dans le temps et dans les différentes conditions d&#39;entreposage. </li><li> Comparer les résultats après stockage avec les valeurs nominales. Considérez résultats qui relèvent de 85% -115% de la valeur nominale acceptable. </li><li> Établir la stabilité de l&#39;échantillon pendant 1 semaine à la température ambiante, 1 semaine à 4 ° C, 1 mois à -20 ° C et 1 mois à -80 ° C. </li><li> Test de stabilité gel-dégel sur trois cycles (-20 ° C). Essai échantillon extrait et la stabilité de l&#39;échantillonneur automatique en plaçant des échantillons dans l&#39;échantillonneur automatique thermostaté réglé à 4 ° C. Injecter échantillons après 72 h. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que, comme mentionné ci-dessus, la notion de médicament thérapeutique et le suivi de l&#39;observance du tacrolimus sur la base de taches de sang séché est attrayant, il ya des défis analytiques qui vont au-delà de ceux qui sont habituellement associés à l&#39;analyse LC-MS / MS du tacrolimus dans EDTA veineuse échantillons de sang total. Ceux-ci comprennent, mais sans y être limités, le fait que la matrice est du sang total capillaire trempé dans la matière des linters de coton de la matière de carte de filtre uti...

Le tacrolimus est un puissant immonosuppressant 1-7 qui a une structure de macrolide 8 (figure 1). En raison de cis - isomérie trans des liaisons CN il forme deux rotamères en solution 9 qui peuvent être séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (HPLC) Tacrolimus est lipophile et soluble dans les alcools (methanol: 653 g / L, de l&#39;éthanol: 355 g / L), des hydrocarbures halogènes (chloroforme: 573 g / L) et de l&#39;éther. Il est peu soluble dans les hydrocarbures aliphatiques (hexane: 0,1 g / L et de l&#39;eau (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 La molécule ne contient pas de chromophore et son maximum d&#39;absorption UV est de 192 nm tacrolimus agit par l&#39;intermédiaire inhibition de la calcineurine. . Son mécanisme d&#39;action a été examiné dans les références 10,11. Il est actuellement utilisé dans plus de 80% des patients transplantés organes solides aux Etats-Unis 12. L&#39;indice thérapeutique du tacrolimus est considered soit 13 étroite. En outre, la corrélation entre les doses de tacrolimus et les concentrations sanguines est pauvre et la pharmacocinétique est variable 14,15. Suivi des concentrations thérapeutiques pour guider tacrolimus dosage chez les patients transplantés est donc pratique clinique générale 16-20. L&#39;objectif est de maintenir les concentrations sanguines de tacrolimus dans une plage thérapeutique pré-défini. Les concentrations sanguines de tacrolimus en dessous de la gamme thérapeutique peut entraîner une augmentation de l&#39;activité des réactions d&#39;allo-immunes chroniques ou aiguës, tandis que des concentrations supérieures à la fenêtre thérapeutique augmentent le risque de sur-immunosuppression, le cancer et la toxicité, tels que la néphrotoxicité, la neurotoxicité, l&#39;hypertension et le diabète. Haute pharmacocinétique variabilité intra-individuelle de tacrolimus peut être préjudiciable à la fois organe de greffe et de la survie des patients 21,22. Bien variabilité inter-individuelle de la pharmacocinétique du tacrolimus est principalement causée par des polymorphismes de CYP3A5, pour des raisons intra-individuellela variabilité comprennent, mais ne sont pas limités à des interactions médicament-médicament, la maladie-médicaments et de la nourriture-médicaments 14,15. Aussi le manque d&#39;adhésion à la thérapeutique régime de médicament immunosuppresseur est un facteur et une raison majeure de perte du greffon 23,24. Ces considérations suggèrent que la maison fréquente médicament thérapeutique et le suivi de l&#39;observance des concentrations de tacrolimus sur sang total peut être bénéfique pour assurer que les patients ont une exposition de tacrolimus dans la fenêtre thérapeutique souhaité en tout temps. Cependant, la logistique et le coût de la surveillance plus fréquente de drogue thérapeutique comme il est de pratique clinique actuelle 15 est prohibitif. Une des raisons est que le patient doit voir un préleveur d&#39;avoir l&#39;échantillon de sang veineux nécessaire dessinée. Taches de sang séché ont récemment émergé comme un concept attrayant 25-28. Après un doigt simple coller le patient recueille une goutte de sang sur une carte de papier filtre spécial et la tache de sang a DRied, il peut être envoyé à un laboratoire central pour l&#39;analyse de tacrolimus et de tout autre immunosuppresseur que le patient peut actuellement être pris. Ceci est devenu possible grâce à la mise au point de dosages LC-MS / MS hautement sensibles et spécifiques pour la quantification de tacrolimus et d&#39;autres immunosuppresseurs dans de très petits volumes de sang tels que des taches de sang séché (typiquement 20 ul de sang) 25,29-43. Un autre avantage est que, les stratégies de collecte minimalement invasives faibles volumes d&#39;échantillon tels que des taches de sang séché facilitent grandement suivi thérapeutique et des études pharmacocinétiques chez les petits enfants 28. Tacrolimus est généralement mesurée en toute EDTA sang veineux 15. Les raisons sont que le tacrolimus distribue principalement dans les cellules de sang et que des études cliniques ont signalé des meilleure corrélation entre les concentrations résiduelles de tacrolimus dans le sang que dans le plasma à des événements cliniques 15,18. En comparaison, l&#39;analyse de tacrolimus en taches de sang séché est basée sur sang capillaire qui est mélangée avec la matrice de papier-filtre. Cela pose des défis en termes de solubilisation de tacrolimus et les interférences potentielles avec l&#39;analyse LC-MS / MS. Ici, nous présentons un test établi et validé sur la base de l&#39;homogénéisation de la tache de sang séché en utilisant un mélangeur de balle en combinaison avec un débit élevé échantillon de colonne ligne nettoyer procédure et l&#39;analyse LC-MS / MS. En date d&#39;aujourd&#39;hui, ce test a été utilisé avec succès pour la quantification de plus de cinq mille tacrolimus séchée échantillons de taches de sang pour le suivi de l&#39;observance dans les essais cliniques.

<table><tbody><tr><td>Tacrolimus</td><td>U.S. Pharmacopeial Convention</td><td>1642802</td><td></td></tr><tr><td>D2,13C-Tacrolimus</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td></td><td></td>F370002</tr><tr><td>Cellules rouges</td><td>Hôpital de l’Université du Colorado</td><td>W20091305500 V</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Hôpital</td><td>de l’Université du Colorado</td><td>W2017130556300Q</td><td></td></tr><tr><td>Acétone CHROMASOLV, HPLC, &ge ; 99,9 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439126-4 L</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol 99,9 %, HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2632-4</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol Optima LC/MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Eau Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de zinc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td></td></tr><tr><td>0,5 &ndash ; 10 &ndash ; pipette l, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>tube Eppendorf 1,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10 &ndash ; 100 & micro ; l pipette, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008651</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu ; l pointes de pipette avec filtre, stériles</td><td>Neptune</td><td>BT 10XLS3</td><td></td></tr><tr><td>100 &ndash ; 1 000 & micro ; pipette, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; l pointes de pipette avec filtre, stériles</td><td>Neptune</td><td>BT 100</td><td></td></tr><tr><td>1 000 &mu ; l pointes de pipette avec filtre, stériles</td><td>Multimax</td><td>2940</td><td></td></tr><tr><td>2 &ndash ; 20 & micro ; pipette VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>tube Eppendorf de 2 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>20 &ndash ; 200 & micro ; pipette, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu ; l pointes de pipette avec filtre, stériles</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-20</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; l pointes de pipette avec filtre</td><td>Multimax</td><td>2938T</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; l pointes de pipette avec filtre, stériles</td><td>Multimax</td><td>2936J</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu ; l inserts pour flacons HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>ARO-9973-13</td><td></td></tr><tr><td>Balance PR2002</td><td>Mettler Toledo</td><td>1117050723</td><td></td></tr><tr><td>Balances AX205 Delta Range</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119343379</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender Homogénéisateur</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Biofuge Fresco</td><td>Heraeus</td><td>290395</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes jetables</td><td>PDI</td><td>Q55172</td><td></td></tr><tr><td>Verres en verre, 4 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>Flacons en verre, 20 ml</td><td>Gants Thermo Fisher Scientific</td><td>B7800-20</td><td></td></tr><tr><td>, gants en nitrile</td><td>de marque Titan Flacons</td> HPLC <td>44-100S</td><td></td></tr><tr><td>, 9 mm, 2 ml, transparent</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 9921-13</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles pour flacons HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 8952-13-B</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille, 18 G 1,5</td><td>Precision Glide</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Rack pour tubes Eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-448-11</td><td></td></tr><tr><td>Rack pour flacons HPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-541-29</td><td></td></tr><tr><td>Perles d’acier 0,9 &ndash ; 2 mm</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de rangement pour congélateurs / réfrigérateurs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Vortex multitubes standard</td><td>VWR Scientific Products</td><td>658816-115</td><td></td></tr><tr><td>Papier Whatman, 903 Protein Saver US 100/PK</td><td>GE Whatman&nbsp ;</td><td>2016-05</td><td></td></tr><tr><td>Échantillonneur</td><td>automatique CTC PAL&nbsp ;</td><td>ami. HTCABIx1</td><td></td></tr><tr><td>Pompe binaire, Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G1312B</td><td></td></tr><tr><td>Pompe binaire, Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Micro dégazeur sous vide, Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G13798</td><td></td></tr><tr><td>Four à colonne,&nbsp ; Agilent 1290 avec 2 positions&nbsp ;</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1216C</td><td></td></tr><tr><td>Compartiment de colonne thermostaté avec vanne de commutation 6 ports intégrée</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Cartouche pré-colonne HPLC, Zorbax XDB C8 (5 &micro ; m taille des particules), 4,6 & middot ; Colonne</td> analytique HPLC <td>Phenomenex</td><td>820950-926</td><td></td>de 12,5 mm</tr><tr><td>, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 & micro ; m taille des particules), 4,6 & middot ; 150 mm</td><td>Phenomenex</td><td>993967-906</td><td></td></tr><tr>Spectromètre <td></td><td></td><td></td><td>de masse tandem</td></tr><tr><td>API5000 MS/MS avec source TurboIonspray</td><td>AB Sciex</td><td>4364257</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de spectrométrie de masse</td><td>AB Sciex</td><td>Analyst 1.5.1</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification de l&#39;immunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant lc-ms / ms

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Le tacrolimus inhibiteur de la calcineurine est la pierre angulaire de la plupart des protocoles de traitement immunosuppresseur après une transplantation d&#39;organe solide aux États-Unis. Tacrolimus est un médicament étroite indice thérapeutique et en tant que telle exige suivi thérapeutique et ajustement de la dose en fonction de l&#39;ensemble de son concentrations résiduelles dans le sang. Pour faciliter la maison médicament thérapeutique et le suivi de l&#39;adhésion, la collecte des taches de sang séché est un concept attrayant. Après un bâton de doigt, le patient perçoit une goutte de sang sur un papier filtre à la maison. Après que le sang est séché, il est envoyé au laboratoire d&#39;analyse où le tacrolimus est quantifiée par liquide à haute performance chromatographie-spectrométrie de masse tandem (HPLC-MS / MS) en combinaison avec une étape protéines de précipitation manuel simple et l&#39;extraction de la colonne en ligne. Pour l&#39;analyse de tacrolimus, un disque de 6 mm est poinçonnée du centre saturée de la tache de sang. La tache de sang est homogénéisé à l&#39;aide d&#39;une balle d&#39;un mélangeure puis protéines sont précipitées avec du méthanol / 0,2 M ZnSO 4 contenant le standard interne D 2, 13 C-tacrolimus. Après agitation au vortex et centrifugation, 100 ul de surnageant sont injectés dans une colonne d&#39;extraction en ligne et on les lave avec 5 ml / min de 0,1 acide formique / acétonitrile (7: 3, v: v) pendant 1 min. Ci-après, la soupape de commutation est activé et les analytes sont contre-rinçage sur la colonne analytique (et séparé en utilisant un gradient d&#39;acide formique / acétonitrile 0,1%). Le tacrolimus est quantifiée en mode positif de réaction multiples (MRM) en utilisant un spectromètre de masse en tandem. Le dosage est linéaire de 1 à 50 ng / ml. La variabilité inter-essai (3,6% -6,1%) et la précision (91,7% -101,6%) selon l&#39;évaluation de plus de 20 jours répondent aux critères d&#39;acceptation. Récupération d&#39;extraction moyenne est de 95,5%. Il n&#39;y a pas de report, les interférences de matrice et les effets de matrice pertinente. Tacrolimus est stable dans des taches de sang séchées à température ambiante et à 4 ° C pendant 1 semaine. Les échantillons extraits dans leéchantillonneur automatique sont stables à 4 ° C pendant au moins 72 heures.

Chromatogrammes d&#39;ions représentatifs d&#39;un échantillon témoin, un échantillon enrichi à la limite inférieure de quantification et un échantillon de patient sont présentés dans la figure 3. Courbes d&#39;étalonnage La limite inférieure de détection était de 0,5 ng / ml et la limite inférieure de quantification était de 1,0 ng / ml. Cinquante ng / ml a été choisi comme étalon le plus élevé que des concentrations plus élevées sont peu suscep...

Nous décrivons ici un test de chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) à haute performance pour quantifier l’immunosuppresseur tacrolimus dans des taches de sang séché à l’aide d’une simple étape manuelle de précipitation des protéines et d’une extraction en colonne en ligne.

Quantification de l&#39;immunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de quantifier le tacrolimus dans des taches de sang séché. Le principal avantage de cette technique par rapport à la quantification du tacrolimus dans les échantillons de sang après une prise de sang IV est que les patients peuvent prélever eux-mêmes des échantillons, des stratégies de prélèvement d’échantillons peu invasives à faible volume telles que des taches de sang séché facilitent également la surveillance thérapeutique des médicaments et les études pharmacocinétiques chez les jeunes enfants. Après une simple piqûre au doigt, le patient recueille une goutte de sang sur une carte spéciale en papier filtre, et une fois la tache de sang séchée, elle peut être envoyée par la poste à un laboratoire central pour l’analyse du tacrolimus et de tout autre immunosuppresseur que le patient peut prendre.La quantification des médicaments sur les taches de sang séché est devenue possible grâce à la mise au point de dosages LCM SM S très sensibles et spécifiques pour la quantification du tacrolimus et d’autres immunosuppresseurs dans de très petits volumes sanguins tels que les taches de sang séché. Tout d’abord, préparez des solutions mères dans du méthanol pur à une concentration d’un milligramme par millilitre pour le tacrolimus et à une concentration de 10 microgrammes par millilitre. Pour deux solutions mères aliquotes de 13 °C et les stocker à moins 70 °C ou moins chaque jour d’extraction, préparer un rapport de sept à trois de méthanol et de sulfate de zinc de 0,2 molaire dans l’eau pour précipiter les protéines et extraire le tacrolimus.La solution mère étalon interne est enrichie dans la solution de précipitation. Réglez la date d’expiration de la solution à 12 heures. Ensuite, préparer des solutions mères de tacrolimus en effectuant une dilution appropriée de la solution mère à l’aide de méthanol pur pour préparer des calibrateurs et des échantillons de contrôle de la qualité.Injectez 20 microlitres de la solution mère correctement diluée dans l’EDT. Un sang entier incubé à 37 degrés Celsius sous une légère agitation dans un bain-marie pendant 20 minutes pour permettre une distribution homogène du tacrolimus dans les composants sanguins cellulaires. Pour préparer une plus grande quantité d’étalonneurs et d’échantillons de contrôle de la qualité, ajoutez 2000 microlitres de la solution mère correctement diluée dans l’EDT.Un sang entier incubé à 37 degrés Celsius sous une légère agitation dans un bain-marie pendant 20 minutes pour permettre une distribution homogène du tacrolimus dans les composants sanguins cellulaires. Ensuite, aliquote les échantillons dans des tubes en polypropylène de 1,5 millilitre à fond conique et couvercles encliquetables. Repérez 50 microlitres de sang total enrichi au milieu de chaque cercle sur des cartes filtrantes à l’aide d’une pipette après avoir séché les taches de sang à température ambiante pendant trois heures, préparez des étalons de tacrolimus dans du sang total EDTA humain à des concentrations de tacrolimus de 2,5, 5, 10, 25 et 50 nanogrammes par millilitre.Préparez un échantillon blanc pour l’extraction comme les étalons d’étalonnage avec la solution de précipitation des protéines, ne contenant pas l’étalon interne D deux 13 C tacrolimus. Ensuite, préparez des échantillons de contrôle de la qualité dans du sang total humain EDTA à des concentrations de 0, 2, 4, 20 et 40 nanogrammes par millilitre. Préparez également un échantillon vierge Après avoir prélevé les taches de sang séché, inspectez visuellement chacune d’elles pour vous assurer que la qualité et le volume de l’échantillon sont acceptables.Ensuite, perforez le centre de la tache de sang sur la carte filtrante avec une perforatrice de six millimètres. Placez les disques dans des tubes en polypropylène de 1,5 millilitre à fond conique et enclenchez les couvercles. Ajoutez 20 à 30 balles dans chaque tube.Ensuite, ajoutez 500 microlitres de la solution de précipitation des protéines dans chaque tube. Homogénéisez les disques dans un mélangeur à balles pendant une minute à vitesse maximale. Une fois terminé, agitez les échantillons à température ambiante sur un vortex multitube à vitesse maximale pendant 10 minutes.Ensuite, centrifugez les échantillons à 16 000 GS et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après centrifugation, transférez le SNAT dans des flacons HPLC en verre équipés d’un insert de 300 microlitres. À ce stade, chargez 100 microlitres du supernat de l’échantillon extrait sur la colonne d’extraction à huit cartouches C avec un rapport de sept à trois de 0,1 % d’acide formique dans l’eau et de nitrile acide à un débit de cinq millilitres par minute.Pendant une minute, activez la vanne de commutation, ce qui entraîne le rinçage à contre-courant des analytes du pré-étalonnage sur la colonne analytique. Réglez ensuite le thermostat de la colonne à 65 degrés Celsius. Éluer les analytes de la colonne analytique à l’aide des débits et du gradient indiqués ici.Connectez la colonne analytique à un spectromètre de masse en tandem via la source d’ionisation par électronébulisation turbo. Ajustez les paramètres clés du spectromètre de masse selon le tableau suivant. Ensuite, détectez les ions positifs dans le mode de réaction multiple.Pour quantifier la présence de tacrolimus dans les taches de sang séché, comparez-la à la courbe d’étalonnage à l’aide du logiciel de spectrométrie de masse : chromatogrammes ioniques représentatifs d’un échantillon vierge. Un échantillon enrichi à la limite inférieure de la quantification et un échantillon de patient sont présentés ici. Une courbe d’étalonnage typique est illustrée ici.Le coefficient de corrélation moyen est de 0,9994. L’exactitude et les résultats de précision sont présentés en détail ici. Aucune indication de suppression ou d’augmentation significative des ions n’a été observée, ni aucun transfert pertinent entraînant un dépassement des pics.15 % du signal à la limite inférieure de quantification a été détecté. L’intégrité de la dilution a été étudiée en analysant des échantillons préparés à des concentrations supérieures à l’étalon le plus élevé et dilués dans une solution de précipitation de protéines après l’extraction pour atteindre les concentrations cibles. Toutes les dilutions testées répondaient aux critères d’acceptation.Aucune perte n’a été observée après une semaine d’entreposage à température ambiante, après une semaine d’entreposage à quatre degrés Celsius et après un mois d’entreposage à moins 20 degrés Celsius. De plus, aucune perte n’a été observée après un mois d’entreposage à moins 80 degrés Celsius après trois cycles de congélation et de décongélation, et après 72 heures d’échantillonnage extrait dans l’échantillonneur automatique à quatre degrés Celsius. Une fois maîtrisés, 20 échantillons peuvent être extraits en moins d’une heure.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la clé d’une quantification fiable est la qualité de la tache de sang séché et que le disque est perforé à partir d’une zone complètement saturée du papier filtre. Les techniques et le dosage présentés dans cette vidéo fournissent une plate-forme technologique pour quantifier d’autres immunosuppresseurs et médicaments dans des taches de sang séché.

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