Name: Visualisation directe de la Dorsale murin Cochlear Nucleus pour optogénétiques stimulation de la voie auditive (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Découvrez une technique chirurgicale pour accéder directement au noyau cochléaire dorsal chez la souris. Cette méthode permet la stimulation optogénétique et l'étude des réponses neuronales auditives.

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Financement: Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation Bertarelli (DJL), un MED-EL subvention (DJL) et les Instituts nationaux de la santé Subventions DC01089 (RCM).

NOTE: Toutes les procédures expérimentales sont effectuées en conformité avec le soin et l&#39;utilisation Comité pour les Animaux du Massachusetts Eye and Ear Infirmary et Harvard Medical School, qui suivent les lignes directrices de soins aux animaux nationaux, y compris la politique de santé publique service sur Humane soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire, le Guide ILAR, et la Loi sur la protection des animaux. Les procédures expérimentales énumérés ci-dessous l&#39;exposition détaillée de la DCN gauche. Utilisez des instruments stériles tout en effectuant la chirurgie de survie. 1. Craniotomie primaire et Dorsale Cochlear Nucleus exposition <ol><li> Anesthésie <ol><li> Anesthésier une souris, âgées de 8 à 12 semaines, pesant 18 à 24 g, de xylazine 20 mg / kg de kétamine et 100 mg / kg par une administration intrapéritonéale. Confirmez anesthésie appropriée par le taux de surveillance cardiaque, fréquence respiratoire, ainsi que pincement de l&#39;orteil réflexe de retrait. Lieu vétérinaire onguent sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Une fois correctement sous anesthésie, cheveux rasage recouvrant til cuir chevelu pour fournir un accès libre sur le site chirurgical. </li></ol></li><li> Positionnement chirurgical <ol><li> Placez la souris en toute sécurité dans un petit porte-stéréotaxique animal, maintenu en place par une pince de museau. </li><li> Assurez-vous que la pince de museau est assez lâche pour permettre une respiration adéquate, mais assez serré pour immobiliser complètement la tête de la souris. Si la tête de la souris est lâche, l&#39;animal est susceptible de tomber sur le support de tête pendant la partie craniotomie de la procédure. </li><li> Placez électrodes implant du tronc cérébral à la mode standard, ce qui permet un suivi de la fréquence cardiaque. La fréquence respiratoire doit être surveillée par la visualisation. Notez que la fréquence cardiaque normale et la fréquence respiratoire varient en fonction de l&#39;âge de la souris. </li><li> Un thermomètre est placé et euthermia est assurée par le placement sur une couverture chauffante homéotherme. </li></ol></li><li> incision de la peau et l&#39;exposition des os interpariétales et occipital du crâne <ol><li> Sous un Microscope, faire une incision verticale à travers la peau à partir de la ligne médiane, directement entre le pavillon de l&#39;oreille, et se étendant jusqu&#39;à la partie caudale de l&#39;occiput. Après incision médiane de la peau, la peau déplacer latéralement. Visualiser les muscles couvrant la gauche de la face postérieure du crâne. </li><li> Retirer muscle recouvrant la pariétale gauche, interpariétal, et les os occipital du crâne par désarticulation des attaches musculaires à leurs os respectifs avec un scalpel ou de l&#39;iris ciseaux. Observer un petit degré de saignement le long des bords de coupe de muscle. Réduire cette par une légère pression avec un applicateur coton-tige pour 10-15 sec. </li></ol></li><li> Recouvrant Craniotomie Cochlear Nucleus <ol><li> Identifier les lignes de suture pertinents, y compris des sutures sagittale et lambda lignes (Figure 1, panneau de gauche). </li><li> Utilisation de rongeurs, faire une craniotomie sur l&#39;os interpariétal, à gauche de la ligne médiane, ~ 2 mm caudale à la ligne lambda de suture. Cette région recouvre la DCN. </li><li> Following craniotomie, observer une mince couche de dure qui recouvre le cervelet. En utilisant une lame de scalpel, enlever la dure-mère. (Figure 1, panneau moyen). REMARQUE: Enlèvement de dure peut causer un faible degré de saignement. Ce processus d&#39;utilisation de la lame de scalpel pour enlever la dure-mère est destiné à réduire la quantité de perte de sang pendant l&#39;aspiration de cervelet, qui mettra en commun sur la surface du tronc cérébral et l&#39;identification obscur de la DCN. Le volume de sang total de souris est d&#39;environ 1,5 ml devraient pas dépasser&gt; à 15%. Si le saignement dépasse ce montant, la souris doit être muni d&#39;une supplémentation fluide. </li><li> Retirer sang coagulé recouvrant le cervelet avec la pointe du coton applicateur. Eventuellement, égoutter doucement solution saline en utilisant un point dentaires sur le cervelet pour effacer le sang loin sang. </li></ol></li><li> Cérébelleuse aspiration <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un 5 aspiration français, aspirer la partie latérale la plus du cervelet gauche recouvrant la DCN jusqu&#39;à ce que la DCN est visUAL (Figure 1, panneau de droite). Retirer environ 1/4 à 1/3 du cervelet gauche. Le principal point de repère à côté de la DCN est l&#39;ampoule du canal semi-circulaire supérieur. NOTE: L&#39;aspiration du cervelet est l&#39;étape clé du protocole. Réalisé aspiration du cervelet est effectué le plus de succès si elle se produit en une seule tentative et non avec de multiples passes de l&#39;aspiration car cela pourrait causer des saignements. Pour aider à l&#39;aspiration, régler le plan focal du microscope à la profondeur prévue de la NC, qui sera légèrement distale par rapport à la surface du cervelet. Réglage du plan focal du CN améliorer la visualisation et d&#39;assurer une image nette. </li><li> Après aspiration, le saignement, liquide céphalo-rachidien (LCR) accumulation, et le déplacement du cervelet sur la DCN sont attendus. Instiller 0,5 ml de solution saline stérile rapidement dans la craniotomie pour empêcher la coagulation du sang. Une combinaison de tamponnant doucement avec un point dentaire et aspiration peut alors êtreutilisé pour déblayer un chemin pour la visualisation directe de la DCN. Ne pas directement contact avec la surface de la DCN. </li></ol></li></ol> 2. microinjection à pression à médiation virale Gene Transfer and Recovery chirurgical <ol><li> Après la DCN est libre de sang recouvrant et le LCR et est clairement visible, assurez microinjections de pression dans la DCN en utilisant une seringue Hamilton de 10 ul sur une période de 2 min. </li><li> Introduire l&#39;aiguille avec un micromanipulateur jusqu&#39;au bout ne est plus visible sous la surface de la DCN. </li><li> Pour des performances optimales, utilisez une aiguille de calibre 33 ou 34 (utiliser une seringue étanche aux gaz avec l&#39;aiguille 34 gauge) avec un biseau peu profonde, comme 45 °, afin de minimiser traumatisme contondant et localiser le volume d&#39;injection dans le DCN, qui est un mince et la structure du tronc cérébral peu profondes (&lt;300 um d&#39;épaisseur). NOTE: D&#39;autres instruments de micro-injection peuvent être fondées utilisé. Idéalement, l&#39;instrument d&#39;injection doit être souple pour permettre une légère bend, si nécessaire pour cibler directement la DCN. En outre, comme la souris se déplace légèrement tout au long de la procédure en raison de la respiration, l&#39;instrument doit être suffisamment robuste pour supporter des quantités mineures de mouvement. </li></ol> 3. Récupération chirurgicale <ol><li> Immédiatement après l&#39;injection, re-rapprochant la peau et laissez la souris pour récupérer par la procédure de récupération standard. Restant tissu cicatriciel cervelet et remplira la cavité provoquée par l&#39;aspiration du cervelet. Surveiller constamment animaux jusqu&#39;à ce que la conscience suffisante est retrouvé à maintenir décubitus sternal. Surveiller le rythme cardiaque, fréquence respiratoire, ainsi que la capacité à nourrir. REMARQUE: Aucun animal qui a subi une intervention chirurgicale est retourné dans une cage avec les autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. </li><li> Si une souris commence à tourner en rond après l&#39;opération (&lt;5% des cas), généralement 2-4 heures après la fermeture de l&#39;incision de la peau, immédiatement sacrifier la souris, comme il aurait probablement un temps à se nourrir difficile. Tson effet secondaire est probablement due à l&#39;aspiration du cervelet. L&#39;animal doit être surveillé pour la douleur post-opératoire, et les stupéfiants appropriées devrait être accordée pour assurer le confort des animaux basée sur des normes institutionnelles. Les antibiotiques peuvent être nécessaires, si la preuve de l&#39;infection. </li></ol> 4. secondaire exposition Craniotomie et Cochlear Nucleus <ol><li> Après 2-4 semaines de cicatrisation et virus transfert génique à médiation par incubation, re-anesthésier une souris et répétez les étapes 1.1 à 1.5 temps d&#39;incubation optimal précédemment injectée varie en fonction du type de gène transféré. </li><li> Retirer le tissu de cicatrice sur le site de craniotomie par une combinaison de pinces, scalpel, et rongeurs. </li><li> Après la visualisation de la craniotomie, identifier une combinaison de cervelet et tissu cicatriciel recouvrant la DCN reste. Utilisez un 5 aspiration française pour aspirer cervelet recouvrant / tissu cicatriciel (similaire à l&#39;aspiration cérébelleuse précédente). </li><li> Après aspiration, attendre le saignement, CSF benforcer-up, et les bits restants du cervelet. Introduire rapidement une solution saline dans la craniotomie pour empêcher la coagulation du sang. Utilisez une combinaison de douceur dentaires tamponnant point et d&#39;aspiration pour dégager le chemin pour la visualisation directe de la DCN. </li><li> Observer la surface de la DCN. Effectuer des expériences de physiologie base optogénétique-DCN est maintenant accessible. Présentez un stimulus lumineux, par exemple avec une fibre optique (Figure 2), à conduire une expérience basée optogénétique. </li></ol> 5. histologie <ol><li> Après la conclusion d&#39;expériences, euthanasier la souris avec une surdose de kétamine. Perfuser la souris avec une solution saline normale suivie par 4% de paraformaldéhyde. </li><li> Extraire le tronc cérébral du crâne et de post-correctif pour 2 heures. Cryoprotect le tronc cérébral dans 30% de saccharose pendant 24-48 h. Section du tronc cérébral au moyen d&#39;un cryostat standard en utilisant 60 sections um. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Cet article décrit la technique de visualisation directe de la DCN dans le modèle murin pour la manipulation du système auditif central. L&#39;approche décrite de la visualisation directe offre des avantages significatifs par rapport à la principale alternative, qui sont des approches stéréotaxiques. Principalement, la visualisation directe de la DCN permet de confirmation immédiate du site du tronc cérébral, alors que les approches stéréotaxiques ne offrent pas la visualisation directe. Dans les expériences qui nécessi...

Le transfert de gènes médié par le virus pour inverser la perte auditive s’est largement concentré sur le système auditif périphérique. 1 En ciblant la cochlée, les chercheurs ont examiné une multitude de voies d’administration, y compris la mini-pompe osmotiqueinfusion 2, la Gelfoam®2 imbibée de complexe vectoriel-transgène ou l’éponge de gélatine3, la micro-injection directe4 ; de nombreux vecteurs de transfert de gènes, y compris les vecteurs viraux adéno-associés5,6, les vecteurs lentiviraux7 et les liposomes cationiques2 ; et la dissémination des vecteurs de transfert de gènes au-delà du tissu cible2. Plus récemment, le virus adéno-associé (AAV)-1 a été introduit dans la cochlée afin de traiter la surdité chez la souris due à la perte du transporteur vésiculaire du glutamate-3. 8 De plus, l’application de l’optogénétique dans le système auditif périphérique a récemment été décrite. 9
Peu d’études, cependant, ont examiné le transfert de gènes vers le système auditif central. Le noyau cochléaire dorsal (DCN) du tronc cérébral contient des neurones de second ordre de la voie auditive. Alors que les techniques de transfert de gènes dans le noyau cochléaire (CN) peuvent être utilisées pour une foule d’investigations, le transfert de gènes d’opsines, des protéines sensibles à la lumière, vers le DCN peut également être utilisé pour permettre des techniques expérimentales basées sur l’optogénétique. À la suite d’un transfert de gènes médié par le virus et l’administration d’une opsine, telle que la channelrhodopsine-2 (ChR2), les neurones de la DCN deviennent sensibles aux stimuli lumineux. Le transfert de gènes optogénétiques a déjà été tenté dans plusieurs régions du tronc cérébral, notamment le noyau rétrotrapézoïdal du rat, le locus coeruleus de la souris, le colliculus supérieur du singe et l’aire tegmentale ventrale de la souris. 10 à 14 ans
Récemment, des chercheurs ont examiné l’utilisation de l’optogénétique dans le DCN. 15,16 Le DCN est l’emplacement de la mise en place des implants auditifs du tronc cérébral chez l’homme, ce qui en fait une partie attrayante du système auditif à étudier pour les études translationnelles sur les neuroprothèses auditives. Cependant, étant donné l’emplacement de la DCN, l’exposition chirurgicale est difficile. La technique décrite dans le présent document fournit un protocole pour une exposition maximale de la DCN via une approche de fosse postérieure afin de permettre le transfert de gènes de vecteur viral et des expériences basées sur l’optogénétique dans un modèle murin. Des études antérieures ont utilisé la micro-injection stéréotaxique dans la DCN avec de la channelrhodopsine-2. 16 Les injections stéréotaxiques, cependant, sont potentiellement moins précises que les injections effectuées par visualisation directe, en particulier dans un noyau aussi petit et profond le long du tronc cérébral que le DCN. Les souris transgéniques exprimant des protéines spécifiques aux tissus dans le CN sont également une option attrayante et éviteraient le besoin de transfert de gènes. Notre protocole d’exposition à la DCN fonctionnerait également chez les souris transgéniques, car la DCN devrait être directement exposée pour une stimulation optique. Cette technique d’exposition chirurgicale à la DCN est adaptée des protocoles précédents impliquant des enregistrements du nerf auditif et du noyau cochléaire dans des modèles de souris et de rats. 15,17-20
L’objectif global du protocole est de fournir une exposition directe au CN pour permettre des techniques de transfert de gènes. Plus précisément, l’approche est compatible avec la chirurgie aiguë et la chirurgie de survie et la préparation peut être répétée chez le même animal pour des tests neurophysiologiques ultérieurs. L’exposition directe du protocole DCN a des implications pour l’expérimentation basée sur l’optogénétique et le transfert de gènes médié par des virus dans d’autres noyaux du tronc cérébral.

<table><tbody><tr><td>Support stéréotaxique</td><td>Stoelting</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>Couverture homéothermique</td><td>Harvard</td><td>507214</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel #11</td><td>Outils chirurgicaux fins</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris</td><td>Outils chirurgicaux fins</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>5 Aspiration française</td><td>Symétrie Surgical</td><td>2777914</td><td></td></tr><tr><td>Dental Points</td><td>Henry Schein</td><td>100-8170</td><td></td></tr><tr><td>Pinceur osseux</td><td>Outils chirurgicaux fins</td><td>16020-14</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro ; l Seringue</td><td>Hamilton Hamilton&nbsp ;</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>Calibre 34, aiguille</td><td>Hamilton&nbsp ;</td><td></td><td></td>207434</tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Outils Chirurgicaux Fins</td><td>16021-14</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation directe de la dorsale murin cochlear nucleus pour optogénétiques stimulation de la voie auditive

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Enquête sur l&#39;utilisation du transfert de gène à médiation virale pour arrêter ou inverser la perte auditive a largement été reléguée au système auditif périphérique. Peu d&#39;études ont examiné le transfert de gènes au système auditif central. Le noyau cochléaire dorsal (DCN) du tronc cérébral, qui contient des neurones de second ordre de la voie auditive, est un site potentiel de transfert de gènes. Dans ce protocole, une technique pour une exposition directe et maximale de la DCN murin par une approche de la fosse postérieure est démontrée. Cette approche permet une chirurgie aiguë ou la survie. Suite à la visualisation directe de la DCN, une multitude d&#39;expériences sont possibles, y compris l&#39;injection de opsins dans le noyau cochléaire et une stimulation ultérieure par une fibre optique couplée à un laser à lumière bleue. D&#39;autres expériences de neurophysiologie, telles que la stimulation électrique et tracés d&#39;injection de neurones sont également possibles. Le niveau de visualisation et la durée de la stimulation font réalisables cette approche applicable à un large éventail d&#39;expériences.

Partielle cérébelleuse aspiration démontre avoir accès à noyau cochléaire Après la peau et le muscle recouvrant le crâne, les sites d&#39;intérêt sont éliminés de la surface du crâne, comme les lignes de suture coronale et lamda, démontrer la localisation approximative de la craniotomie. Après craniotomie avec rongeurs, le cervelet est visualisée. Une aspiration soigneuse de la petite partie du cervelet montre la visualisation de la NC, qui peut alors être injecté (figure 1)...

L’objectif de ce protocole est de décrire une approche chirurgicale pour fournir un accès direct au noyau cochléaire dorsal dans un modèle murin.

Visualisation directe de la Dorsale murin Cochlear Nucleus pour optogénétiques stimulation de la voie auditive

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

L'objectif général de cette procédure est d'accéder chirurgicalement au noyau cochléaire chez un modèle murin afin de permettre des expériences basées sur l'optogénétique. Cela est réalisé en préparant d'abord la souris pour une craniotomie et en rétractant latéralement les tissus mous cutanés et musculaires recouvrant le cuir chevelu. Dans un deuxième temps, une craniotomie est réalisée sur l'os interpariétal gauche, à environ deux millimètres en direction céphalique par rapport à la suture lambda.Cette région recouvre le noyau cochléaire. Ensuite, à l’aide d’un tube d’aspiration de cinq Français, aspirez la portion la plus latérale du cervelet gauche recouvrant le NCD. Le résultat montre une vue dégagée du NCD.Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes d'assistance telles que la guidance stéréotaxique sont d'obtenir une visualisation directe du noyau cochléaire et de placer un stimulateur neurologique, comme une source lumineuse ou un réseau d'électrodes, sur la surface du tronc cérébral. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions essentielles dans les domaines de l'optogénétique et de l'audition. Aucune prothèse, telle qu'un transfert génique, ne permet actuellement de stimuler le tronc cérébral auditif par la lumière avec une résolution spatiale et temporelle suffisante.Après avoir anesthésié une souris au kéta­mine et à la xylazine par administration intrapéritonéale, vérifiez le réflexe de retrait à la pression sur l'orteil et surveillez sa fréquence cardiaque et sa fréquence respiratoire afin de confirmer une anesthésie adéquate. Appliquez ensuite une pommade vétérinaire sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement. Puis, rasez les poils recouvrant le cuir chevelu afin de permettre un accès dégagé au site chirurgical.Ensuite, placer la souris dans un support stéréotaxique pour petit animal. Régler la pince du museau de manière qu'elle soit suffisamment lâche pour permettre une respiration adéquate, mais assez serrée pour immobiliser complètement la tête de la souris. Sous un microscope, pratiquer une incision verticale à travers la peau, en partant de la ligne médiane située directement entre les pavillons auriculaires et en allant jusqu'à la partie occipitale inférieure.Ensuite, déplacez la peau latéralement. Retirez les muscles recouvrant les os pariétaux gauche, interpariétaux et occipital du crâne à l’aide d’un scalpel ou de ciseaux à iris. Pendant ce temps, minimisez les saignements en appliquant une pression douce avec un applicateur à embout cotonneux pendant 10 à 15 secondes.Ensuite, identifiez les lignes des sutures sagittale et lambdoïde. À l'aide d'une paire de forets Ron, pratiquez une craniotomie sur l'os pariétal gauche, à environ deux millimètres de la ligne de la suture lambdoïde.Cette région se situe au-dessus du noyau cérébelleux profond après craniotomie. Une fine couche de dure-mère recouvrant le cervelet doit être observée attentivement ; retirez-la à l’aide d’une lame de scalpel. Éliminez le sang coagulé à l’aide de bouts de coton ou laissez doucement goutter du sérum physiologique sur le cervelet pour déloger le sang.Ensuite, utilisez un tube d'aspiration de calibre 5 français pour aspirer la partie latérale de la moitié gauche du cervelet, recouvrant le noyau cérébelleux dorsal afin de faciliter l'intervention. Pendant l'aspiration, réglez le plan focal du microscope à la profondeur attendue du noyau cochléaire afin d'améliorer la visualisation et d'obtenir une image nette. Retirez environ un quart à un tiers du cervelet gauche.Le repère principal adjacent au noyau cérébelleux profond (DCN) est l'AM du canal semi-circulaire supérieur. Après l'aspiration, tout saignement supplémentaire, accumulation de liquide céphalorachidien et déplacement du cervelet au niveau du DCN apparaîtront ; instillez rapidement du sérum physiologique dans la trépanation afin d'empêcher la coagulation sanguine. Utilisez une combinaison de tamponnement doux à l’aide d’un applicateur dentaire et d’aspiration pour dégager un passage permettant une visualisation directe du DCN.Une fois que le noyau cérébelleux profond (DCN) est clairement visible et dégagé du sang et du LCS superficiels, effectuez une microinjection sous pression du vecteur à l’aide d’une seringue Hamilton étanche aux gaz de cinq microlitres. Utilisez une aiguille de calibre 34 munie d’un biseau peu prononcé afin de minimiser les traumatismes contondants et de localiser le volume d’injection au sein du DCN. Introduisez ensuite lentement l’aiguille à l’aide d’un micromanipulateur jusqu’à ce que la pointe ne soit plus visible sous la surface du DCN.Commencez l'injection de 1,5 microlitre du vecteur. Une fois cette étape terminée, retirez lentement l'aiguille, recousez ensuite la peau et laissez la souris se remettre selon la procédure de récupération standard. Après deux à quatre semaines de cicatrisation et d'incubation de la transfert génique médié par le virus, ré-anesthésiez la souris ayant reçu l'injection du vecteur, puis retirez le tissu cicatriciel recouvrant le site de la craniotomie.Ensuite, identifier une combinaison de tissu cérébelleux résiduel et de tissu cicatriciel recouvrant le noyau cochléaire dorsal. Utiliser une aspiration de cinq French pour aspirer le tissu cérébelleux et le tissu cicatriciel sus-jacents. Après l'aspiration.Appliquez rapidement du sérum physiologique dans la craniotomie. Pour prévenir l'accumulation de sang, utilisez une combinaison de tamponnement doux avec une pointe dentaire et d'aspiration afin de dégager la zone pour une visualisation directe du noyau cochléaire dorsal (DCN). Le DCN est désormais accessible pour les expériences de physiologie basées sur l'optogénétique ; ce qui est illustré ici est le positionnement d'une fibre laser directement sur la surface du DCN, ce qui permet la stimulation optique des neurones du DCN exprimant l'opsine. Une série d'impulsions lumineuses bleues appliquée à la surface du DCN infecté induit une réponse auditive du tronc cérébral induite optiquement.À l’aide d’un micromanipulateur, une fibre optique couplée à un laser à lumière bleue est placée directement sur la surface du noyau cochléaire et activée. Ici, nous pouvons identifier une lumière bleue pulsée à la surface du noyau cochléaire. Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que la stimulation électrique du noyau, peuvent être réalisées, ce qui nous permet de comparer directement non seulement les réponses neuronales induites acoustiquement, mais aussi celles induites électriquement, avec celles provoquées par la stimulation optique.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer et d'effectuer la craniotomie et l'aspiration cérébelleuse dans le but ultime de visualiser directement et d'accéder au noyau cochléaire.

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Neurones adultes-né du bulbe olfactif peut être contrôlé à l'aide optogenetically Channelrhodopsin2 exprimant l'injection lentiviral dans le flux migratoire et rostrale photostimulation chronique avec une miniature implanté à LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Source : Kozin, E. D., et.al. Visualisation directe du noyau cochléaire dorsal murin pour la stimulation optogénétique de la voie auditive. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo démontre le transfert de gènes médié par le virus dans le noyau cochléaire dorsal (DCN) de souris pour permettre la stimulation auditive induite par la lumière. Un vecteur viral codant pour l’opsine, un canal ionique sensible à la lumière, est injecté dans le DCN à la suite d’une craniotomie et d’une aspiration cérébelleuse...

Transfert de gènes médié par un virus dans le noyau cochléaire dorsal de souris pour une stimulation auditive induite par la lumière

Cette vidéo montre le processus de préparation de tranches de cerveau en forme de coin en laboratoire. À l'aide d'un vibratome, une tranche en forme de coin du cerveau d'une souris est fabriquée avec une épaisseur variable. Cette tranche contient la racine nerveuse auditive positionnée à l’extrémité la plus épaisse, tandis que les neurones liés à l’audition sont situés à l’extrémité la plus mince.

Préparation de tranches de cerveau en coin pour visualiser les neurones auditifs

Cette vidéo présente un protocole pour stimuler la racine nerveuse auditive et enregistrer les courants postsynaptiques dans les neurones olivocochléaires médians dans des tranches de coin cérébral de souris.

Stimulation des racines nerveuses auditives et enregistrements de courant postsynaptique dans une tranche de coin cérébral de souris

Nous décrivons une méthode pour caractériser la topographie fonctionnelle et les propriétés synaptiques des circuits du cerveau antérieur en utilisant une approche optogénétique pour photostimuler les populations neuronales in vitro.

Photostimulation par balayage laser de circuits du cerveau antérieur ciblés optogénétiquement

L’optogénétique est devenue un outil puissant pour les expériences de neurosciences comportementales. Ce protocole offre un guide étape par étape pour la conception et l’installation de systèmes laser, et fournit un protocole complet pour la réalisation de stimulations optogénétiques in vivo multiples et simultanées compatibles avec la plupart des paradigmes de tests comportementaux de rongeurs.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

Nous décrivons ici notre stratégie pour obtenir des enregistrements unitaires stables et bien isolés à partir d’interneurones inhibiteurs identifiés dans le cortex de souris anesthésié. Les neurones exprimant ChR2 sont identifiés par leur réponse à la lumière bleue. La méthode utilise un équipement d’enregistrement extracellulaire standard et constitue une alternative peu coûteuse à l’imagerie calcique ou au patching guidé visuellement.

Un guide pour In vivo Simple unité d'enregistrement de Optogenetically identifié corticale inhibitrice Interneurones

Les implants cochléaires (IC) de permettre l'audition par la stimulation électrique directe du nerf auditif. Cependant, la mauvaise fréquence et la résolution d'intensité limite la qualité de l'audience avec les IC. Nous décrivons ici la stimulation optogenetic du nerf auditif chez la souris comme une stratégie alternative pour la recherche et le développement auditif futurs IC.

Stimulation optogenetic du nerf auditif

L’intégration de diverses entrées synaptiques aux neurones est mieux mesurée dans une préparation qui préserve tous les noyaux pré-synaptiques pour le timing naturel et la plasticité du circuit, mais les tranches de cerveau coupent généralement de nombreuses connexions. Nous avons développé une tranche de cerveau modifiée pour imiter l’activité du circuit in vivo tout en maintenant la capacité d’expérimentation in vitro.

Préparation in vitro en tranches compensées pour imiter la connectivité du circuit neuronal In Vivo

Le présent protocole décrit comment utiliser l’optogénétique sans fil combinée à la vidéographie à grande vitesse dans une seule tâche de portée à la saisie de pastilles pour caractériser les circuits neuronaux impliqués dans la performance du comportement moteur qualifié chez les souris en mouvement libre.

In vivo Contrôle optogénétique sans fil du comportement moteur qualifié

Ici, nous présentons deux protocoles d’enregistrement par micro-électrocorticographie à haute densité (μEcoG) chez le rat et la souris, y compris les méthodes chirurgicales, d’implantation et d’enregistrement. Les enregistrements μECoG sont effectués en combinaison avec l’enregistrement de polytrodes laminaires dans le cortex auditif du rat ou avec la manipulation optogénétique de l’activité neuronale dans le cortex somatosensoriel de la souris.

Études multi-échelles du traitement cortical par intégration de polytrodes laminaires et d’optogénétique avec micro-électrocorticographie chez les rongeurs

Découvrez une technique chirurgicale pour accéder directement au noyau cochléaire dorsal chez la souris. Cette méthode permet la stimulation optogénétique et l'étude des réponses neuronales auditives.

Visualisation directe de la Dorsale murin Cochlear Nucleus pour optogénétiques stimulation de la voie auditive

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