Visualisation directe de la Dorsale murin Cochlear Nucleus pour optogénétiques stimulation de la voie auditive

L’objectif global de cette procédure est d’accéder chirurgicalement au noyau cochléaire dans un modèle murin pour permettre des expériences basées sur l’optogénétique. Ceci est réalisé en préparant d’abord la souris pour la craniotomie et en rétractant la peau, les tissus mous et les muscles recouvrant le cuir chevelu latéralement. Dans un deuxième temps, une craniotomie est pratiquée sur l’os inter-pariétal gauche, à environ deux millimètres de la ligne de suture lambda.

Cette région recouvre le noyau cochléaire. Ensuite, à l’aide d’un tube d’aspiration à cinq français, aspirez la partie la plus latérale du cervelet gauche recouvrant le DCN. Le résultat montre une vue dégagée du DCN.

Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes d’assistance telles que le guidage stéréotaxique sont à la fois d’obtenir une visualisation directe du noyau cochléaire et de placer un simulateur neurologique tel qu’une source lumineuse ou un réseau d’électrodes sur la surface du tronc cérébral. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’optogénétique et de l’audition. Aucune prothèse, telle que le transfert de gènes, ne permet au tronc cérébral auditif d’être stimulé par la lumière avec une résolution faciale et temporelle suffisante.

Après avoir anesthésié une souris avec de la kétamine et de la xylazine par administration intrapéritonéale, vérifiez le réflexe de retrait du pincement de l’orteil et surveillez sa fréquence cardiaque et sa fréquence respiratoire pour confirmer une anesthésie appropriée. Appliquez ensuite une pommade vétérinaire sur les deux yeux pour éviter la sécheresse. Ensuite, rasez les cheveux recouvrant le cuir chevelu pour fournir un accès sans obstruction au site chirurgical.

Après cela, placez la souris dans un petit support stéréotaxique pour animaux. Ajustez la pince du museau de manière à ce qu’elle soit suffisamment lâche pour permettre une respiration adéquate, mais suffisamment serrée pour immobiliser complètement la tête de la souris. Au microscope, faites une incision verticale à travers la peau, en commençant par la ligne médiane directement entre le pavillon et en s’étendant jusqu’à la partie dorlotée de l’occiput.

Déplacez ensuite la peau latéralement. Retirez les muscles recouvrant les os pariétaux gauches, interpariétaux et occipitaux du crâne avec un scalpel ou des ciseaux à iris. Pendant ce temps, minimisez les saignements en appliquant une légère pression avec un applicateur à embout de coton pendant 10 à 15 secondes.

Ensuite, identifiez les lignes de sutures sagittales et lambda. À l’aide d’une paire de bijoux Ron. Faites une craniotomie sur l’os inter-pariétal gauche d’environ deux millimètres pour dorloter la ligne de suture lambda.

Cette région recouvre la DCN suite à une craniotomie. Une fine couche de dure-mère qui recouvre le cervelet doit être observée, retirez-la soigneusement à l’aide d’une lame de scalpel. Retirez le sang coagulé à l’aide d’embouts en coton ou versez doucement une solution saline sur le cervelet pour éliminer le sang.

Ensuite, utilisez un tube d’aspiration à cinq français pour aspirer la partie la plus latérale du cervelet gauche, en recouvrant le DCN pour aider. En aspiration, réglez le plan focal du microscope à la profondeur attendue du noyau cochléaire pour améliorer la visualisation et assurer une image nette. Retirez environ un quart à un tiers du cervelet gauche.

Le principal point de repère adjacent à la DCN est l’AM du canal semi-circulaire supérieur. Après l’aspiration, d’autres saignements, une accumulation de liquide céphalo-rachidien et un déplacement du cervelet sur le DCN apparaîtront pour instiller rapidement une solution saline dans la craniotomie afin d’empêcher la coagulation sanguine. Utilisez une combinaison de tamponnage doux avec une pointe dentaire et d’aspiration pour dégager un chemin pour une visualisation directe du DCN.

Une fois que le DCN est clairement visible et exempt de sang et de LCR sus-jacents, effectuez une micro-injection sous pression du vecteur avec une seringue Hamilton étanche au gaz de cinq microlitres. Utilisez une aiguille de calibre 34 avec un biseau peu profond pour minimiser les traumatismes contondants et localiser le volume d’injection dans le DCN. Ensuite, introduisez lentement l’aiguille à l’aide d’un micro-manipulateur jusqu’à ce que la pointe ne soit plus visible sous la surface du DCN.

Commencez à injecter 1,5 microlitre du vecteur. Une fois cela terminé, retirez lentement l’aiguille, puis rapprochez la peau et laissez la souris récupérer selon la procédure de récupération standard. Après deux à quatre semaines de cicatrisation et d’incubation par transfert de gènes médiée par le virus, anesthésie à nouveau la souris injectée dans le vecteur, puis retire le tissu cicatriciel sur le site de la craniotomie.

Après cela, identifiez une combinaison de tissu cervelet et cicatriciel restant recouvrant le DCN. Utilisez une aspiration à cinq français pour aspirer le cervelet et le tissu cicatriciel sus-jacents. Après l’aspiration.

Appliquez rapidement une solution saline dans la craniotomie. Pour éviter l’ululation du sang, utilisez une combinaison de tamponnage doux de points dentaires et d’aspiration pour dégager le chemin pour une visualisation directe du DCN. Le DCN est maintenant accessible pour les expériences de physiologie basées sur l’optogénétique montrées ici est le placement d’une fibre laser directement sur la surface du DCN, ce qui permet une stimulation optique du DCNA infecté par l’opsine La série d’impulsions de lumière bleue à la surface du DCN infecté entraîne une réponse auditive du tronc cérébral pilotée optiquement.

À l’aide d’un micromanipulateur, une fibre optique couplée à un laser à lumière bleue est placée directement sur la surface du noyau cochléaire et allumée. Ici, nous pouvons identifier une lumière bleue pulsée à la surface du noyau cochléaire. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la simulation électrique du noyau peuvent être effectuées, ce qui nous permet de comparer directement non seulement les réponses neuronales évoquées acoustiquement, mais aussi électriquement évoquées avec celles évoquées par la simulation optique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation et de la réalisation de la craniotomie et de l’aspiration cérébelleuse dans le but ultime de visualiser directement et d’accéder au noyau cochléaire.