Name: Les avantages multiples de la protéine co-expression dans Escherichia coli (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Découvrez la co-expression de protéines dans Escherichia coli pour faciliter l'assemblage de complexes protéiques in vivo. Cette méthode efficace utilise des plasmides compatibles et surmonte les défis de solubilité des sous-unités libres.

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1. Isolement de E. coli co-transformants <ol><li> Préparer des cellules électro-compétentes du E. appropriée coli souche à transformer. Transfert à 1 ml de milieu LB (tryptone, extrait de levure, NaCl à 10, 5 et 10 g / l, respectivement) d&#39;une seule colonie de la souche de choix, et incuber à 37 ° C dans des conditions de secousse, 180 tours par minute. Diluer la pré-culture 1: 500 dans 25 ml de milieu LB frais et on incube la culture à 37 ° C. </li><li> Au journal phase (0,6 OD) centrifuger la suspension de cellules à 5000 g pendant 20 minutes), et remettre en suspension le culot dans 10%, v / v glacée eau-glycérol stérile dans la moitié du volume de la culture d&#39;origine. Répétez cette étape 4 fois, de réduire de moitié chaque fois le volume de la remise en suspension. Enfin, remettre le culot dans du glycérol / eau et diviser la suspension des cellules dans 50 aliquotes. Stocker les aliquots à -80 ° C jusqu&#39;à 6 mois. </li><li> Dissoudre le plasmide désiré dans l&#39;eau stérile supplémenté avec 0,5 mM d&#39;EDTA. Thaw sur ice une aliquote de cellules électro-compétentes et mélanger avec une quantité appropriée (2,5-5 ng) du vecteur. Verser le mélange dans une cuvette de 0,1 cm convient pour l&#39;électroporation, et appliquer 1,8 kV. </li><li> Transférer immédiatement les cellules électroporées dans 1 ml de milieu SOC (milieu LB complété avec 0,2% p / v de glucose, 10 mM de MgCl2, 2,5 mM de KCl), incuber pendant 1 h sous agitation, et enfin le transfert des aliquotes de 100 ul à des boîtes de Pétri contenant agar LB avec l&#39;antibiotique approprié. Incuber O / N à 37 ° C. </li><li> Purifier les transformants en stries des colonies isolées sur des boîtes de Pétri. </li><li> Préparer des cellules électro-compétentes des transformants primaires et répétez les étapes 1.1 à 1.5 pour transformer avec d&#39;autres plasmides. </li><li> Préparer des stocks de glycerol des co-transformants. Transfert d&#39;une seule colonie dans LB supplémenté avec les antibiotiques appropriés, incuber à 37 ° C sous agitation, et au journal phase (0,6 OD) centrifuger la suspension de cellules à 5000 g pendant 20 min. Resuspend le culot dans du milieu LB contenant les antibiotiques-support 15% v / v glycérol. Répartir en aliquotes et stocker à - 80 ° C. </li></ol> 2. Co-expression des sous-unités α et ε de E. coli DNA polymerase III <ol><li> Transfert avec une boucle stérile une petite quantité du stock de glycérol de souche appropriée (par exemple, TOP10 / pgood-ε243 et TOP10 / pgood-ε243-θ / pBADα1160, voir la figure 1) dans une boîte de Pétri contenant le milieu LB et des antibiotiques. Laissez le suspension de cellules sec sur la boîte de Pétri, et série les cellules gouttelettes. Incuber à 37 ° CO / N. </li><li> Transfert, en utilisant un cure-dents stérile, une colonie unique de 1 ml de milieu LB-antibiotiques. Incuber 8 h à 37 ° C. Diluer la pré-culture 1: 500 dans du milieu frais et on incube à 30 ° C pendant 15 heures. </li><li> Ajouter IPTG, l&#39;arabinose, ou l&#39;arabinose et IPTG, 1 mM chacun. Incuber à 30 ° C pendant 2,5 heures. Recueillir les cellules, et de stocker les granulés à -20 ° C. </li><li> Décongeler les pastilles sur de la glace et remettre en suspension dans du tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, 1 mM d&#39;EDTA, 2,5 mM de dithiothréitol, du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM (PMSF), pH 8). Homogénéiser doucement la suspension de cellules avec un potier de verre à froid. </li><li> Soniquer à 15 W pendant 15 secondes, suivie de 15 sec temps de refroidissement (4 cycles). </li><li> Centrifuger les extraits de protéines totales à 10 000 xg pendant 20 min, à 4 ° C pour récupérer la fraction soluble. </li><li> Analyse par SDS-PAGE (12,5% d&#39;acrylamide) des fractions aliquotes de chaque extrait protéique soluble. Dans ce but, transférer 20 pi de chaque extrait protéique soluble dans des tubes Eppendorf contenant 60 ul de H2O et 20 ul de tampon de chargement (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM de β-mercaptoéthanol, 10% (p / v) SDS, 50% (v / v) de glycerol, 0,25% (p / v) de bleu de bromophénol) et faire bouillir pendant 5 min. Charge 18 pi de chaque échantillon et effectuer la électrophorèse à 140 V pendant environ 1,5 h. </li></ol> 3. Co-expression de α sous-unité de Deinococradiodurans cus ADN polymérase III et ε sous-unité de E. coli DNA polymerase III <ol><li> Préparer un pré-culture de l&#39;E. coli souche TOP10 / Dr pBAD-α / pgood-ε243 dans 1 ml de milieu LB-ampicilline tétracycline et incuber 8 h à 37 ° C. Diluer 1: 1000 dans un milieu frais et incuber O / N à 37 ° C. </li><li> Diluer 1: 100 dans 200 ml de milieu frais, incuber à 37 ° C pendant 3 heures, puis induire pendant 3 heures avec l&#39;arabinose et IPTG, 1 mM de chacun. Récolter les cellules, et de stocker le culot à -20 ° C. </li><li> Reprendre le culot dans 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Homogénéiser et perturber les cellules comme décrit dans 2.4 et 2.5. </li><li> Centrifuger immédiatement les cellules lysat à 10 000 g pendant 20 min. Jeter le culot. Filtrer le surnageant avec un entonnoir Büchner équipé avec trois couches de papier filtre. Appliquer une dépression douce. Pour éviter un excès de mousse, garder le vide erlenmeyer sur la glace lors de la filtration. </li><li> Déterminer la concentration en protéine selon Bradford 14. </li></ol> 4. Filtration sur gel Une Chromatographie <ol><li> Equilibrer un 16x70 chemise d&#39;eau (200) colonne de filtration sur gel avec 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1 mM d&#39;EDTA, pH 8. charge sur la colonne de l&#39;extrait protéique soluble. Pour une résolution optimale, utiliser une boucle échantillon de 1 ml. Effectuer la chromatographie à 0,6 ml / min. Maintenir la température de la colonne à 4 ° C tout au long. </li><li> Récupérer 0,9 ml des fractions et de les analyser par SDS-PAGE. Transférer 20 pl de chaque fraction en rapport avec des tubes Eppendorf contenant 60 ul de H2O et 20 ul de tampon de chargement (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM de β-mercaptoéthanol, 10% (p / v) de SDS, 50% ( v / v) de glycérol, 0,25% (p / v) bleu bromophénol) et faire bouillir pendant 5 min. Charge 18 pi de chaque échantillon et effectuer la électrophorèse à 140 V pendant environ 1,5 h. </li><li> Déterminer l&#39;exonucléase 3&#39;-5 et de l&#39;activité d&#39;ADN polymérase de chaque fraction dans 96 nousll microplaques. Doser l&#39;activité d&#39;exonucléase en utilisant la thymidine 5&#39;-monophosphate ester de p-nitrophényle (p NP-TMP) comme substrat 15. Estimer une activité de polymerase d&#39;ADN en utilisant le PPX (Pyrophosphatase, la purine nucléoside phosphorylase, la xanthine oxydase) enzyme couplé à essai 16 et de 2- (4-iodo-phényl) -3- (4-nitrophényl) de chlorure -5-phényl-2H-tétrazolium (INT) comme accepteur 16 d&#39;électrons. </li></ol> 5. Mutation analyse des populations co-exprimant le type sauvage ε sous-unité de E. coli ADN polymérase III et l&#39;mutagènes εD12A Variant <ol><li> Transférer une seule colonie de E. coli TOP10 contenant le pBAD-ε et les pGOOD1-εD12A 11 vecteurs à 1 ml de milieu LB-antibiotiques. Incuber O / N à 37 ° C. </li><li> Diluer la pré-culture 1: 250 dans des flacons contenant du milieu frais 3 (10 ml), ajouter les inducteurs appropriés (arabinose, de l&#39;IPTG, et de l&#39;arabinose ou de l&#39;IPTG 1 mM chacun) et incuber à 37 ° Cpendant 8 heures. Préparation de cultures parallèles non induit. </li><li> Recueillir des aliquotes de 1 ml, puis diluer 1: 500 dans de nouveaux flacons contenant du milieu frais (10 ml) supplémenté ou non avec les inducteurs appropriés. Incuber O / N à 37 ° C. </li><li> Répétez les étapes 5.2 et 5.3 et de recueillir des aliquotes de 1 ml. </li><li> Déterminer le nombre de générations est produit dans chaque culture. Transfert sur des plaques LB, 100 pi de dilutions en série appropriées d&#39;inoculum et de la culture. Incuber O / N à 37 ° C. Compter les colonies sur des plaques LB, et calculer le logarithme du nombre de cellules présentes dans l&#39;inoculum (log I) et dans la culture à la fin de la croissance (log C). Pour déterminer le nombre de générations, utiliser la formule: (log C - log I) /0.301. </li><li> Centrifuger à 5000 xg pendant 20 min et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM de NaCl. Pour perméabiliser les cellules, ajouter 2 à 3 gouttes de chloroforme et vortex pendant 20 s. </li><li> Déterminer la β-glucosidase de chaque aliquote dans une microplaque à 96 puits, en utilisant du p-nitrophényl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc) comme substrat. Ajouter à chaque puits 100 pi de cellules perméabilisées et 100 pi de substrat (16 mg / ml solution mère dans H 2 O). Prenez soin d&#39;éviter les bulles d&#39;air dans les puits. Lire l&#39;absorbance à 420 nm, en utilisant un lecteur de microplaques et le filtre approprié. </li></ol>

<ol><li>Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplifying+protein+expression+with+ligation-free%2C+traceless+and+tag-switching+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids.</a> Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).</li>
<li>Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+landscape+of+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli.</a> Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).</li>
<li>Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression+systems%3A+a+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression systems: a comparison.</a> Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+expression+of+the+PBAD+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).</li>
<li>Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+and+homogeneous+regulation+of+the+Escherichia+coliaraBAD+promoter+by+use+of+a+lactose+transporter+of+relaxed+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).</li>
<li>Tabita, F. R., Small, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+assembly+of+active+cyanobacterial+ribulose-1%2C5-bisphosphate+carboxylase%2Foxygenase+in+Escherichia+coli+containing+stoichiometric+amounts+of+large+and+small+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).</li>
<li>Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cyanobacterial+and+higher+plant+ribulose+bisphosphate+carboxylase+subunits+into+functional+homologous+and+heterologous+enzyme+molecules+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli.</a> EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).</li>
<li>Amann, E., Brosius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG+vectors+for+regulated+high-level+expression+of+cloned+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli.</a> Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).</li>
<li>Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+for+co-expression+of+an+unrestricted+number+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins.</a> Nucleic Acids Res. 35 (6), e43(2007).</li>
<li>Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGOODs%3A+new+plasmids+for+the+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).</li>
<li>Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+regulation%2C+modulation%2C+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+PBAD+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).</li>
<li>McHenry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replicases+from+a+bacterial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA replicases from a bacterial perspective.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Hamdan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolysis+of+the+5%E2%80%99-p-nitrophenyl+ester+of+TMP+by+the+proofreading+exonuclease+%28%CE%B5%29+subunit+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III.</a> Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).</li>
<li>Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+enzyme-coupled+assay+of+phosphate-+or+pyrophosphate-releasing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes.</a> BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).</li>
<li>DeRose, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+the+catalytic+domain+of+the+proofreading+%CE%B5+subunit+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+based+on+NMR+structural+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data.</a> Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).</li>
<li>Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proofreading+exonuclease+subunit+%CE%B5+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+is+tethered+to+the+polymerase+subunit+%CE%B1+via+a+flexible+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).</li>
<li>Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+proofreading+subunit+controls+the+assembly+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+catalytic+core%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).</li>
<li>Schaaper, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+selection%2C+proofreading%2C+and+mismatch+repair+during+DNA+replication+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).</li>
<li>Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+novel+traits+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of novel traits in microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).</li>
<li>Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+DNA+activates+the+cryptic+bgl+operon+in+E.+coli+K12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12.</a> Nature. 293, 625-629 (1981).</li>
<li>Schaeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+system+for+the+utilization+of+%CE%B2-glucosides+in+Escherichia+coli.+I.+Active+transport+and+utilization+of+%CE%B2-glucosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides.</a> J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).</li>
<li>Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+selection+for+mutators+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Direct selection for mutators in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).</li>
<li>Dunker, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unfoldomics+decade%3A+an+update+of+intrinsically+disordered+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins.</a> BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).</li>
<li>Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminal+domain+of+DnaQ+contains+the+polymerase+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site.</a> J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).</li>
<li>Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+functional+domains+of+the+%CE%B5+subunit+of+DNA+polymerase+III%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III.</a> Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).</li>
<li>Kim, D. R., McHenry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assembly+of+overproduced+DNA+polymerase+III.+Overproduction%2C+purification%2C+and+characterization+of+the+%CE%B1%2C+%CE%B1-%CE%B5%2C+and+%CE%B1-%CE%B5-%CE%B8+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits.</a> J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).</li>
<li>Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+to+the+%CE%B2-sliding+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp.</a> Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).</li>
<li>Greener, A., Callahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XL1-red%3A+highly+efficient+random+mutagenesis+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain.</a> Strategies. 7, 32-34 (1994).</li>
<li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li>
<li>Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+maturation+of+an+NADP-dependent+%5BNiFe%5D-hydrogenase%3A+a+key+enzyme+in+biofuel+production%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production.</a> PloS One. 5 (5), (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les protéines peuvent être intrinsèquement désordonnée, avec des régions dont la structure tertiaire ne est pas restreinte à un nombre limité de conformations 25. Ces protéines désordonnées sont généralement sujettes à l&#39;agrégation 25, et de leur isolement et la caractérisation pourraient représenter une tâche difficile. La sous-unité ε de E. coli DNA polymerase III possède deux domaines distincts 26,27, à savoir: i) le domaine N-ter, portant la &#39;activité 3&#39;-5&#39; e...

L&#39;introduction des technologies de surexpression soit stimulé les études biochimiques du faible nombre de copies enzymes et la production industrielle de protéines pharmacologiquement actives (par exemple, l&#39;insuline). Depuis l&#39;avènement de ces technologies, des progrès significatifs ont été réalisés pour augmenter le rendement et la qualité des protéines recombinantes. En outre, 1,2 procaryotes et eucaryotes 3 ​​systèmes de surexpression ont été développés au cours des années, offrant des alternatives utiles à la &quot;cheval de travail&quot; de la biotechnologie de la protéine, ce est à dire, Escherichia coli. En particulier, la disponibilité des plates-formes alternatives à E. coli conduit à la production de peptides ou de protéines portant des modifications post-traductionnelles de recombinaison. Toutefois, il convient de mentionner que E. coli représente encore l&#39;organisme de choix pour la production de protéines recombinantes. Cela est dû à plusieurs facteurs, parmi lesquels peuvent être les plus pertinentsconsidéré: i) la disponibilité d&#39;un certain nombre de systèmes de surexpression (vecteurs d&#39;expression et souches) pour E. coli 1,2; ii) fois le court de production, et des rendements élevés de la biomasse, de E. coli dans une variété de médias riche et synthétique; iii) la manipulation facile, soit à la substance biochimique et génétique au niveau de ce micro-organisme; iv) l&#39;isolement de souches capables de produire des protéines toxiques 4; v) la construction de souches présentant induction homogène au niveau de la population 5,6. En outre, il a été récemment montré que des systèmes d&#39;expression appropriés pour la production dans E. coli de protéines modifications post-traductionnelles peut être conçu et construit deux. À l&#39;heure actuelle, surexpression de la protéine est principalement utilisé pour obtenir des protéines monomères ou homo-oligomères, dont hypersynthése peut être réalisée avec un seul gène cloné dans un plasmide approprié. Toutefois, l&#39;attention a récemment étéversée à la construction de E. systèmes protéines co-expression coli, contestant la production, in vivo, de complexes hétéro-oligomères 2. Fait intéressant, les premières expériences de protéines co-expression adressé à l&#39;Assemblée inter-espèces de grands et de petits sous-unités de carboxylase cyanobactéries ribulose-1,5-bisphosphate / oxygénase 7,8, et l&#39;association des formes tronquées et pleine longueur du VIH-1 transcriptase inverse neuf. Ces études pionnières ont démontré que la protéine co-expression représente une alternative puissante et traditionnelles dans la reconstitution in vitro. En outre, la protéine co-expression dans E. coli a été utilisée pour produire différentes protéines portant des modifications post-traductionnelles 2, pour obtenir des protéines contenant des acides aminés non naturels 2, et d&#39;augmenter le rendement des protéines membranaires surexprimés 2. En outre, le potentiel de la protéine co-expression en tant qu&#39;outil de conférer à E. coli concurrencence dans la sécrétion de protéines est sous enquête active 2. Deux principales stratégies de protéines co-expression dans E. coli peut être poursuivi: i) l&#39;utilisation d&#39;un seul plasmide d&#39;accueillir les différents gènes pour être surexprimé; ii) l&#39;utilisation de plusieurs plasmides dans des cellules individuelles pour co-exprimer les protéines cibles. Dans le premier cas, les critères pour le choix du plasmide ne diffèrent pas de ceux des expériences traditionnelles protéines de surexpression simples, bien que particulier des plasmides contenant des éléments promoteur / opérateur en tandem ont été construits pour la co-expression 10. Cette première approche est donc très simple. Toutefois, il convient de mentionner que l&#39;utilisation d&#39;un seul plasmide de co-exprimer des protéines différentes se heurte à deux difficultés majeures: i) la masse moléculaire du vecteur augmente avec le nombre de gènes hébergés, ce qui limite le nombre de protéines co-exprimées; ii) lorsque plusieurs gènes sont clones sous le contrôle d&#39;un promoteur unique, la polarité peut dimienvoyer l&#39;expression des gènes à partir du promoteur distal. L&#39;utilisation de plasmides double ou multiple unique dans E. cellules coli doit accomplir la compatibilité des vecteurs de choix, donc imposer des contraintes aux combinaisons admissibles de plasmides. Toutefois, cette deuxième stratégie de co-expression comporte l&#39;avantage de contenir la masse moléculaire de vecteurs, et limite la polarité. Nous avons récemment construit un système de co-expression de protéines conçu pour faciliter le mouvement alternatif de gènes entre les plasmides co-expression 11. En particulier, nous avons construit la série de vecteurs de pgood, les éléments pertinents qui sont: i) une origine de p15A de réplication, pour assurer la compatibilité des plasmides pgood avec les vecteurs commerciaux contenant l&#39;origine ColE1 (par exemple, la série pBAD 12); ii) une cassette de résistance à la tetracycline; iii) la présence du lac -derived éléments de régulation, ce est à dire, le promoteur-opérateur (O 1) En couple et la LACI </em&gt; q gène. Utiliser un couple pBAD-pgood appropriée, nous avons pu surexpriment le noyau catalytique de E. coli DNA polymerase III, composé de trois sous-unités différentes, ce est-α (la polymerase, ε (3&#39;-5&#39;-3 &#39;5)&#39; exonucléase) et θ (ε stabilisant) 13. En particulier, nous avons démontré que la co-expression du complexe de αεθ était strictement dépendante de l&#39;ajout de la E. coli milieu de culture à la fois de l&#39;IPTG et arabinose, le déclenchement et la surexpression de pgood pBAD, respectivement (figure 1A). Dans le présent rapport, nous illustrons comment des protéines co-expression peut résoudre efficacement les difficultés liées à la faible solubilité d&#39;une protéine sous-unité complexe. En outre, nous montrons comment dans des tests de complémentation de protéines in vivo peut être effectuée, et nous rapportons enfin sur l&#39;utilisation de protéines co-expression de régler la fréquence de mutation dans E. coli. Dans ce but, nous avons utilisé les couples pgood-PBAD appropriés pour illustrer des exemples pertinents de chaque étude de cas.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>PNP-gluc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7006</td><td></td></tr><tr><td>pNP-TMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0251</td><td></td></tr><tr><td>Tétracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95039</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fluka</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acrylamide 30 %</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td>Pour l’électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>Perphorate d’ammonium</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td>Pour l’électrophorèse</td></tr><tr><td>sur gel Glycine</td><td>BioRad</td><td>161-0718</td><td>Pour le gel électrophorèse</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td>Pour électrophorèse</td></tr><tr><td>sur gel TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td>Pour électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>161-0719</td><td>Pour électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>Cuvettes 0,1 cm</td><td>BioRad</td><td>1652089</td><td>Pour électrophorèse</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5415R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Allegra 21R</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Appareil de chromatographie GradiFrac</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II électroporation</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques 550</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean 3 cellules</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentation</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur 3000</td><td>Misonix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em&gt; escherichia coli</em

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Nous rapportons ici que l’expression de complexes protéiques in vivo chez Escherichia coli peut être plus pratique que les expériences traditionnelles de reconstitution in vitro. En particulier, nous montrons que la faible solubilité de la sous-unité ε de l’ADN polymérase III d’Escherichia coli (avec une activité exonucléase 3'-5') est fortement améliorée lorsque la même protéine est co-exprimée avec les sous-unités α et θ (présentant respectivement l’activité de l’ADN polymérase et la stabilisation ε). Nous montrons également que la co-expression protéique chez E. coli peut être utilisée pour tester efficacement la capacité des sous-unités de différentes espèces bactériennes à s’associer dans un complexe protéique fonctionnel. Nous montrons en effet que la sous-unité α de l’ADN polymérase III de Deinococcus radiodurans peut être co-exprimée in vivo avec la sous-unité ε d’E. coli. De plus, nous rapportons l’utilisation de la co-expression des protéines pour moduler la fréquence des mutations chez E. coli. En exprimant la sous-unité ε de type sauvage sous le contrôle du promoteur araBAD (inductible par l’arabinose), et en co-exprimant le variant D12A mutagène de la même protéine, sous le contrôle du promoteur lac (inductible par l’isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), nous avons pu modifier la fréquence de mutation d’E. coli en utilisant des concentrations appropriées des inducteurs arabinose et IPTG. Enfin, nous discutons des avancées récentes et des défis futurs de la co-expression des protéines chez E. coli.

La sous-unité ε de E. coli l&#39;ADN polymérase III se compose de 243 acides aminés et dispose d&#39;une faible solubilité 17,18, à moins que les résidus 187 à 243 sont supprimés 17. Cependant, nous avons précédemment montré 11 que la co-expression de α-métrages, ε, et sous-unités θ donne soluble ADN polymérase III noyau catalytique (figure 1). En particulier, en utilisant le système pBAD-pgood co-expression, nous avons démontré que: i) la surexpression de sous-...

La co-expression des protéines est une alternative puissante à la reconstitution in vitro de complexes protéiques, et est d’une aide pour réaliser des tests biochimiques et génétiques in vivo. Ici, nous rapportons l’utilisation de la co-expression protéique chez Escherichia coli pour obtenir des complexes protéiques et pour ajuster la fréquence de mutation des cellules.

Les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de coexprimer différentes protéines dans E. coli et d'évaluer leur assemblage in vivo. Cette approche est réalisée à l'aide de deux plasmides compatibles, pBAD et pGOOD, utilisés pour la cotransformation d'E. coli TOP10. Dans un deuxième temps, la souche cotransformée est cultivée à 30 degrés Celsius, puis induite afin de surexprimer les protéines.Ensuite, les protéines solubles sont extraites et soumises à une filtration sur gel afin de tester l'association des protéines surexprimées. Les résultats montrent que la coexpression chez E. coli constitue un outil efficace pour la production de complexes protéiques assemblés in vivo, et permet de contourner commodément la faible solubilité des sous-unités libres. La coexpression est un outil puissant en biochimie, permettant la surexpression dans une même cellule de différentes protéines allant en sens inverse.On peut constater que la surexpression de gènes uniques a été essentielle pour l'étude des protéines du nombre Lopi. Toutefois, lorsque le défi consistait à étudier des complexes protéiques, il fallait surexprimer, isoler et reconstituer in vitro des protéines individuelles uniques.

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