Name: Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus Présence dans leau par la culture et de RT-qPCR. II. Total des cultivable Virus Assay (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Apprenez à mesurer les virus infectieux dans l'eau en utilisant la méthode EPA 1615 avec culture cellulaire sur lignée BGM. Cette approche standardisée permet d'évaluer les risques sanitaires liés aux virus entériques.

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Les auteurs remercient le Dr Mark Borchardt, du ministère américain de l’Agriculture, Marshfield, WI, pour avoir fourni le poliovirus Sabin de sérotype 3 utilisé dans cette étude ; Mary Jean See, Nancy Schable et Jenifer Jones de Dynamac Corporation pour la préparation des cultures de BGM ; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar et Larry Wymer pour leur contribution à l’évaluation globale de la méthode 1615 de l’EPA ; Gretchen Sullivan pour l’assistance technique ; et les propriétaires de puits privés locaux et les services publics pour nous avoir permis de prélever des échantillons d’eau. Bien que ce travail ait été examiné par l’EPA et approuvé pour publication, il ne reflète pas nécessairement la politique officielle de l’Agence. La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux ne constitue pas une approbation ou une recommandation d’utilisation.

NOTE: S&#39;il vous plaît voir la section des matériaux supplémentaires S1 pour une liste de définitions. Les procédures d&#39;AQ associés à USEPA Method 1615 sont décrites dans le matériel supplémentaire section S2. 1. Filtre procédure Elution <ol><li> On élue d&#39;abord <ol><li> Placer 500 ml de tampon extrait de bœuf 1,5%, pH 9,0, chauffée à la température ambiante dans un cylindre gradué. Ouvrez le filtre cartouche de logement et ajouter une quantité suffisante d&#39;extrait de boeuf pour couvrir le filtre electropositive complètement. Remettre le couvercle du boîtier de filtre et versez l&#39;extrait de boeuf restant dans un bêcher stérile. </li><li> Après 1 min de temps de contact, passer la solution d&#39;extrait de boeuf dans le boîtier ainsi que restant dans le bécher stérile lentement à travers le filtre à l&#39;aide d&#39;un récipient sous pression ou d&#39;une pompe péristaltique. Recueillir l&#39;éluat dans un 2 L bêcher en verre. </li></ol></li><li> Deuxième élution <ol><li> Répétez les étapes 1.1 en utilisant un supplément de 500 ml de tampon de 1,5% d&#39;extrait de boeuf, Mais augmenter le temps de contact à l&#39;étape 1.1.2 à 15 min. </li><li> Ajouter l&#39;extrait de boeuf de la seconde élution dans le bécher de 2 L contenant que de la première élution. Ajouter une barre d&#39;agitation stérile dans le bécher. </li></ol></li></ol> 2. floculation organique Concentration Procédure <ol><li> Stériliser une électrode de pH de type combinaison avec l&#39;hypochlorite de sodium à 0,525% pendant au moins 5 min. Rincer l&#39;électrode avec stérile dH 2 O puis déchlorer avec 0,05 M de thiosulfate de sodium. Calibrer le pH-mètre en utilisant un pH de 4 et 7 normes. </li><li> Placer le bécher contenant l&#39;éluat sur une plaque d&#39;agitation. Tournez sur la plaque et augmenter la vitesse d&#39;agitation jusqu&#39;à ce qu&#39;un vortex est formé. </li><li> Ajuster le pH de l&#39;éluat à 3,5 ± 0,1 par lente addition goutte à goutte de HCl 1,2 à l&#39;éluat. Ajouter HCl goutte à goutte, car plus rapide sera inactiver le virus. Pendant ce temps, l&#39;éluat devient trouble sous forme de précipité commence à se former. </li><li> Réduire le spe mélangeed à une agitation lente et puis continuer à surveiller et maintenir le pH de l&#39;éluat à 3,5 ± 0,1 à la température ambiante pendant 30 min. </li><li> Versez l&#39;extrait de boeuf suspension précipitée dans une ou plusieurs bouteilles de centrifugeuse et centrifuger pendant 15 min à 2500 xg à 4 ° C. Retirer les bouteilles de la centrifugeuse et, soit aspirer ou décanter le surnageant lentement pour éviter la perte du précipité granulée. Jeter le surnageant. NOTE: Il peut y avoir des variations considérables entre les lots d&#39;extrait de boeuf dans la quantité et la qualité du précipité. Le précipité produit à partir de certains lots se dissoudra rapidement tandis que celle d&#39;autres beaucoup dissout avec difficulté. </li><li> Ajouter 30 ml de phosphate de sodium 0,15 M à la bouteille centrifugeuse contenant le précipité. <ol><li> Utilisez le phosphate de sodium 0,15 M, pH 9,0 pour précipités de boeuf extrait beaucoup qui se dissolvent dans les 5 min. Agiter pendant 10 minutes après le précipité est complètement dissous, puis passez immédiatement à l&#39;étape 2.7. </li><li> Utiliser le phosphate de sodium 0,15 M, pH 7,0 à 7,5 pour toutes les autres précipités. Agiter pendant 10-15 min pour dissoudre, ou précipités plus difficiles, les briser avec une spatule stérile, en tirant à plusieurs reprises la solution de haut en bas au cours de l&#39;agitation avec une pipette, en secouant le précipité à 160 rpm sur un agitateur orbital, ou par une combinaison de ces procédures. NOTE: Lorsque vous utilisez plus d&#39;une bouteille de centrifugeuse, combiner les précipités en utilisant moins de 30 ml de phosphate de sodium, puis utiliser la partie restante de 30 ml pour rincer les bouteilles après la combinaison des précipités dans une bouteille ou un bécher. </li><li> Si le précipité combiné est dans un fond bouteille de centrifugeuse plat, ajouter une barre d&#39;agitation à la bouteille. Passez à l&#39;étape 2.6.5. </li><li> Si le précipité combiné est dans une bouteille de centrifugeuse avec un fond conique, le transférer dans un petit récipient en verre et ajouter une barre d&#39;agitation dans le bécher. </li><li> Placez la bouteille ou bêcher sur un agitateur magnétique, et remuer jusqu&#39;à ce que le precipitate a complètement dissous. </li><li> Restériliser une électrode de pH du type à combinaison avec l&#39;hypochlorite de sodium à 0,525%, et déchlorer avec du thiosulfate de sodium 0,05 M comme décrit dans l&#39;étape 2.1. Calibrer le pH-mètre en utilisant un pH de 7 et 10 normes. Ajuster lentement le pH du précipité complètement dissous à 9,0 avec 1 M NaOH, puis on agite pendant 10 min. </li></ol></li><li> Retirez la barre d&#39;agitation et centrifuger le précipité dissous pendant 10 min à 4000-10000 xg et 4 ° C. </li><li> Versez délicatement le surnageant dans un récipient en verre sans perturber le culot. Ajouter une barre d&#39;agitation dans le bécher et jeter le culot. </li><li> Placer le bécher sur un agitateur magnétique, et agiter la solution. Ajouter 1,2 goutte HCl M sage d&#39;ajuster le pH à 7,0-7,5. </li><li> Filtre stérilise le surnageant par passage à travers un filtre de stérilisation contenant un pré-filtre, qui a été prétraitée avec 15 ml de 1,5% d&#39;extrait de bœuf, 0,05 M de glycine, pH 7,0 à 7,5. </li><li> Assay Volum Samplee (S) calculs: <ol><li> Utiliser l&#39;équation 1 pour calculer S pour tous les échantillons d&#39;essai, sauf le Lab Fortified Blank et le laboratoire Blanc réactif, <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> L&#39;équation 1 où D (Volume de l&#39;échantillon d&#39;origine de l&#39;eau titré) est de 500 L pour les eaux souterraines, TSV (Total Volume d&#39;échantillon) est le volume de l&#39;échantillon de terrain passé à travers le filtre à cartouche electropositive 5 pouces reçu par le laboratoire, et FCSV (Final concentré Volume échantillon) est le volume après filtration à l&#39;étape 2.10. Un exemple est présenté dans la section supplémentaire des matériaux S4.1. </li><li> Calculer S pour le Lab Fortified Blank (LFB, à savoir, un contrôle de la qualité positive en utilisant l&#39; eau de qualité réactif ensemencé) et le laboratoire Blanc réactif (LRB, à savoir, un contrôle de qualité négative en utilisant l&#39; eau de qualité réactif) en multipliant le FCSV de 0,3. </li></ol></li><li> Diviser le FCSV en three. des sous-échantillons <ol><li> Préparer des sous - échantillons 1 et 2 avec un volume égal à 1,04 fois le volume de dosage d&#39;échantillon. Congeler ces sous-échantillons au niveau ou en dessous de -70 ° C si elles ne peuvent pas être analysés en utilisant le test totale cultivable de virus (sous-échantillon 1, étape 4) ou traitées pour les tests moléculaires (non représentés) dans les 24 heures; autrement, maintenir à 4 ° C. </li><li> Congeler le volume restant (sous-échantillon 3) égale ou inférieure à -70 ° C. </li></ol></li><li> Calculer le volume de l&#39; inoculum en divisant le S par 10. </li></ol> 3. totale cultivable Virus Quantal Assay REMARQUE: Pour toutes les étapes ajoutent toujours des solutions avec soin pour éviter de perturber la monocouche cellulaire. <ol><li> Décanter ou supports de prélèvement à partir de récipients d&#39;essai contenant une monocouche de cellules BGM à 3-6 jours après le fractionnement, puis ajouter un volume de solution saline équilibrée égale aux médias enlevés. </li><li> Décanter ou aspirer la solution saline équilibrée de la te de culture cellulaireles navires st utilisés puis ensemencer les récipients d&#39;essai de culture cellulaire <ol><li> Inoculer 10 récipients d&#39;essai pour chaque échantillon d&#39;essai avec un volume de sous - échantillon 1 égal au volume de l&#39; inoculum ainsi que le total des virus cultivable quantiques contrôles de dosage (matériel supplémentaire section de S2.4). </li><li> Pour le LFB et le Lab Fortifié matrice de l&#39; échantillon (LFSM; ie, ensemencées échantillon de matrice d&#39;eau), préparer 5-, 25-, et des dilutions de 125 fois en utilisant souséchantillon 3 et phosphate de sodium 0,15 M, pH 7,0-7,5 comme diluant. Un exemple d&#39;un procédé pour la fabrication des dilutions en est donnée dans la section supplémentaire de matériaux S3. Inoculer 10 lavés culture cellulaire récipients d&#39;essai pour chaque série de dilution à l&#39; aide d&#39; un volume inoculum sur chaque récipient d&#39;essai en plus des navires inoculés avec sous - échantillon non dilué 1 à l&#39; étape 3.2.1. </li><li> Pour tout échantillon d&#39;essai de l&#39;étape 3.2.1 (autres que ceux inoculés à l&#39;étape 3.2.2) qui a CPE dans tous les 10 répétitions après 14 jours d&#39;incubation (voir l&#39;étape 3.3), prépare dilutions 5-, 25-, et 125- et 625-fold de sous - échantillon 3. Inoculer 10 lavé culture cellulaire récipients d&#39;essai pour chaque série de dilution à l&#39; aide d&#39; un volume inoculum sur chaque récipient d&#39;essai avec un nouvel ensemble de la quantal totale du virus cultivable contrôles de dosage (matériel supplémentaire section de S2.4). </li><li> Distribuer l&#39;inoculum sur la surface des monocouches de cellules par l&#39;inclinaison des récipients en arrière. Incuber les récipients d&#39;essai à la température ambiante pendant 80 à 120 minutes sur une plate-forme à bascule mécanique à 1-5 oscillations / min ou à bascule des vaisseaux toutes les 15-20 minutes pour permettre à tout virus présent à adsorber aux cellules. </li><li> Ajouter un milieu d&#39;entretien préchauffée, puis incuber les récipients d&#39;essai à 36,5 ± 1 ° C. </li></ol></li><li> Recherchez l&#39;apparition de CPE dans chaque récipient d&#39;essai à l&#39;aide d&#39;un microscope par jour pour les 3 premiers d, puis les examiner tous les 2-3 jours jusqu&#39;au jour 14. Transfert des récipients d&#39;essai qui montrent ≥75% CPE dans un congélateur ou fixé àen dessous de -70 ° C. Geler toutes les cultures restantes et le total des virus cultivable quantiques contrôles de dosage au niveau ou en dessous de -70 ° C après avoir examiné les navires le dernier jour. </li><li> Décongeler toutes les cultures et filtrer ≥15% du milieu de chaque récipient d&#39;essai CPE positif à travers un filtre de stérilisation de 0,2 um. Si le volume spécifié ne peut pas être passé à travers le filtre en raison de l&#39;obstruction, centrifuger le milieu pendant 10 min à 1,500-18,000 xg et 4 ° C avant la filtration. </li><li> Effectuer un second passage de tous les 1 er récipients d&#39;essai de passage à l&#39; aide de récipients d&#39;essai BGM lavés. <ol><li> Inoculer les nouveaux récipients d&#39;essai avec un volume d&#39;inoculation qui représente 10% du milieu décongelé de tous les récipients d&#39;essai négatifs et du milieu filtré à partir de navires positifs. </li><li> Répétez les étapes 3.2.4-3.4.3, mais geler tout navire d&#39;essai qui était négatif sur le 1 er passage et positif sur la 2 e comme décrit à l&#39; étape 3.3. Effectuer une 3 ème passeâge comme décrit pour le 2 ème passage en utilisant uniquement les contrôles de dosage négatifs et des cultures cellulaires qui étaient négatifs au cours du 1 er passage et positif dans le 2 ème passage. </li></ol></li><li> Identifier les récipients d&#39;essai individuels que le virus positif quand ils montrent CPE à la fois le 1 er et 2 ème passages ou, dans le cas où CPE ne se produit pas jusqu&#39;à ce que le 2 ème passage, tant dans les 2 ème et 3 ème passages. </li><li> Utilisez Calculatrice de nombre le plus probable de l&#39; USEPA avec les paramètres par défaut du programme définis comme indiqué dans le tableau S2 pour calculer les titres de virus de tous les échantillons de test. <ol><li> Entrez le nombre de virus positifs récipients d&#39;essai de répétition de l&#39; étape 3.6 pour chaque échantillon d&#39;essai dans la calculatrice pour déterminer la valeur / ml MPN (M ml) et la partie supérieure (CL Uml) et (CL LML) 95% limites de confiance / valeurs ml inférieures . </li><li> Obtenir la / valeur L MPN (M L) de l&#39;échantillon d&#39;essai correspondant en utilisant l&#39; équation 2. <img alt="équation 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> équation 2 M mL est la valeur / ml MPN à l&#39; étape 3.7, S est le dosage Volume d&#39;échantillon, et D est le volume de l&#39; échantillon d&#39;eau d&#39; origine titré. </li><li> Calculer la confiance limite supérieure / L en substituant la valeur CL Uml pour la valeur M mL. Calculer la limite inférieure de confiance / L en substituant la valeur CL LML pour la valeur M mL. Un exemple de calcul est indiquée dans la section complémentaire des matériaux S4.2. </li><li> Rapport des valeurs M ml de 0 comme ≤ 1 / D. Par exemple, ≤ 0,002 NPP / L (≤ 1/500 L) pour les échantillons d&#39;eau souterraine. </li><li> Calculer les valeurs limites de confiance NPP et 95% pour chaque Lab Fortifié Blank et Lab ReAgent Blank en multipliant d&#39; abord les valeurs / ml obtenues dans la calculatrice par S, puis en divisant le résultat par 0,3. </li></ol></li></ol>

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<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

USEPA Method 1615 a été développé pour une utilisation pendant le troisième cycle de suivi de la surveillance des contaminants non réglementée règlement (UCMR3) 17 et conçu principalement pour la mesure de survenue du virus dans les eaux souterraines. Il partage un certain nombre d&#39;étapes communes avec la méthode de collecte de renseignements Règle (ICR), 15,18 , mais a deux différences mineures. Les deux utilisent des essais quantiques pour mesurer le virus qui produisent des CPE sur des monocouches de cellules BGM avec quantification étant basée sur nombre le plus probable (NPP) calculs. Procédé 1,615 permet l&#39;utilisation d&#39;un filtre électropositif plus récente pour concentrer le virus à partir de différentes matrices de l&#39;eau et réduit le nombre de culture cellulaire récipient d&#39;essai par dilution de 20 à 10. Les deux modifications mineures de réduire le coût global de la méthode. La réduction du nombre de répétitions réduit le travail, mais aboutit à une limite de détection légèrement inférieure. Bien que les eaux souterraines sont censés avoir des concentrations plus faibles du virus que dans les eaux de surface, 19,20 equantité de e de l&#39;échantillon analysé est cinq fois supérieure à celle de l&#39;eau de surface, ce qui compense en partie les différences. L&#39;utilisation de moins de répétitions sera suffisant pour la plupart des eaux de surface, mais certains nécessitent une dilution échantillon. Méthode 1615 comporte plusieurs étapes critiques et les limites. extraits de bœuf varient d&#39;un lot à. Chaque lot doit être testé pour l&#39;efficacité de l&#39;élution du virus et la capacité de concentration de virus à travers les étapes de concentration secondaires comme décrit est matériel supplémentaire section S2.3. La méthode utilise des formules précises pour calculer la quantité d&#39;échantillon pour inoculer sur des cultures de cellules BGM et de déterminer les titres de virus. Des résultats inexacts seront générés si ces formules ne sont pas rigoureusement suivies. asepsie adéquate doit être utilisée pour le maintien des cultures de cellules. BGM non infectées contrôles de culture de cellules qui montrent la détresse pendant la période d&#39;incubation de 14 jours indiquent probablement des problèmes avec le maintien de la culture cellulaire. Un grand soin doit aussi être taken pendant le pipetage étapes avec inoculation et moyenne plus de flacons de culture cellulaire afin d&#39;éviter la contamination croisée. Les contrôles de qualité décrits dans la section supplémentaire matériaux S2 doivent être suivies rigoureusement. Section S2 fournit également des conseils de dépannage pour des problèmes de qualité. Le principal mécanisme d&#39;adsorption de virus à électropositifs filtres est une interaction de charge liée à la force de la charge positive sur le filtre et la force de charge négative du virus de lié à son point isoélectrique et le pH de l&#39;eau à l&#39;essai 21. L&#39;élution de filtres est également affectée par la force de ces interactions. Car ils varient selon les types de virus et même parmi des souches au sein du même type, l&#39;élution à partir des filtres ne sont pas uniformes. Cela signifie que tout résultat peut sous-estimer le niveau réel du virus présent dans les eaux environnementales. L&#39;utilisation de la lignée cellulaire BGM unique sous-estime également apparition de virus. La gammedes virus entériques qui peut produire des CPE dans cette lignée cellulaire est limitée principalement aux poliovirus et entérovirus B sérotypes d&#39;espèces ainsi que des réovirus 14,15,22. D&#39;autres types de virus infectieux ne seront pas détectés. Recouvrements de poliovirus provenant des eaux souterraines et de qualité réactif rencontré les USEPA Method 1615 les critères d&#39;acceptation de la performance tant pour l&#39; évaluation du rendement (PE, à savoir, des échantillons d&#39;eau ensemencés de qualité réactif avec des titres inconnus à un analyste qui sont utilisés pour évaluer la performance de l&#39;analyste avant le début d&#39;une étude) et des échantillons (LFB matériaux supplémentaires Tableau S1). La reprise de 58% des eaux souterraines en utilisant la procédure de culture est similaire à celle rapportée par d&#39; autres en utilisant l&#39; eau du robinet 23,24. La récupération moyenne à partir des échantillons de LFB 111% avec un coefficient de variation (CV) de 100% a également rencontré les critères d&#39;acceptation des performances de la méthode, même si elles sont plus élevées que celle observée pour les échantillons de PE DURing l&#39;ICR. ICR récupération moyenne interlaboratoires était de 56% avec un coefficient de variation (CV) de 92%, tandis que les recouvrements intralaboratoires moyennes variaient de 36 à 85% (CV 58-131%; données non publiées de la base de données ICR PE). recouvrements plus élevés ont été observés dans cette étude pour une faible semences échantillons LFB que pour les échantillons de semences plus élevées (122 contre 42%). Au moment où l&#39;ICR était prévu, il était prévu que les échantillons PE recevant de faibles valeurs de semences auraient récupération moindre que ceux qui reçoivent des graines élevées. Semblable à celle observée ici pour les échantillons LFB, la récupération du poliovirus pour les échantillons ICR PE étaient 71% (CV 100%), 54% (CV 69%), et 44% (CV 71%) pour les valeurs de semences ≤300 MPN, 300- 1500 MPN, et&gt; 1500 MPN, respectivement. Il existe de nombreuses méthodes pour mesurer le virus infectieux dans des échantillons d&#39;eau 25. Cette méthode est significative par rapport à d&#39;autres méthodes dans le degré de normalisation. La normalisation inclut non seulement des contrôles de qualité et de performance,mais utilise également les volumes et les formules définies pour garantir que tous les laboratoires d&#39;analyse effectuent le procédé de façon identique. Sans normalisation, il est difficile de comparer les résultats entre les laboratoires, et donc la normalisation est essentielle lors de la conduite des études à grande échelle dans plusieurs laboratoires d&#39;analyse. La normalisation intégré dans ce procédé pourrait être étendu à l&#39;avenir pour inclure des types de virus et d&#39;autres lignées cellulaires. La recherche est en cours pour fournir des données pour l&#39;inclusion de l&#39;adénovirus dans la méthode.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Les virus entériques sont un groupe diversifié de virus qui infectent le système intestinal humain et qui sont transmis par la voie fécale-orale. Ces virus pénètrent dans les eaux de surface et souterraines par l&#39; usine de traitement des eaux usées et des effluents de fosses septiques, fosses septiques mal conçus ou brisées, des conduites d&#39;égout brisées, les débordements d&#39;égouts unitaires, et d&#39; autres sources ponctuelles et non ponctuelles 1-4. Les infections humaines et les maladies de virus d&#39;origine hydrique se produisent par la consommation d&#39;eau contaminée ou insuffisamment désinfectée ou par contact avec l&#39;eau de loisirs. symptômes de la maladie peuvent impliquer légère à gastro-entérite sévère; conjonctivite; fièvre; détresse respiratoire supérieure; la main, la fièvre aphteuse; myocardite; la méningite aseptique; encéphalite; paralysie; sepsis 5-8, et la mort 9,10. USEPA Méthode 1615 prévoit une procédure pour mesurer des particules de virus entériques infectieuses dans les eaux environnementales et de boire. Ces eaux peuvent contenirmélange de virions infectieux et non infectieux, mais seules les particules infectieuses constituent un danger potentiel pour la santé. Particules virales infectieuses perdent infectivité au fil du temps dans les eaux environnementales et de boire de la perte d&#39;intégrité protéine de capside, des dommages aux acides nucléiques due au rayonnement UV des rayons du soleil, et les dommages dus à des désinfectants qui peuvent être présents 11-13. La procédure de virus cultivable total fourni dans la méthode est basée sur la production d&#39;effets cytopathiques (CPE) dans la lignée cellulaire Buffalo rein de singe vert (BGM). Cette lignée cellulaire a été choisie en raison de son utilisation très répandue dans le domaine de la virologie environnementale 14,15, même si la gamme de types de virus infectieux détectés sont limitées principalement à certains entérovirus 15. Le but de cet article est de décrire les procédures de méthode 1615 pour l&#39;élution des filtres à cartouche electropositive cinq pouces, concentration secondaire, et la mesure des virus cultivables totaux. Une évaluation de laméthode globale est décrite dans Cashdollar et al. 16.

<table><tbody><tr><td>Extrait de bœuf, poudre desséchée</td><td>BD Bacto</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>Tubes cryogéniques</td><td>Thermo Fisher</td><td>3775/945373</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s solution saline équilibrée</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Plate-forme basculante mécanique</td><td>Daigger</td><td>EF4907G</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-285-729</td><td></td></tr><tr><td>Filtre de stérilisation avec préfiltre</td><td>VWR</td><td>28143-295</td><td></td></tr><tr><td>Filtre de seringue de stérilisation</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Étalons</td> <td>de pHSigma-Aldrich</td><td>33643, 33646, 33648</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1018 ou M4642</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium, 7,5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycotique</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, EDTA,</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

méthode epa 1615. mesure des entérovirus et norovirus présence dans l&#39;eau par la culture et de rt-qpcr. ii. total des cultivable virus assay

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Une méthode normalisée est requise lorsque les études nationales sur la présence de virus dans l’environnement et les eaux potables utilisent plusieurs laboratoires d’analyse. La méthode 1615 de l’Environmental Protection Agency (EPA) des États-Unis a été élaborée dans le but de fournir une telle norme pour mesurer les entérovirus et les norovirus dans ces eaux. Le virus est concentré à partir de l’eau à l’aide d’un filtre électropositif, élué de la surface du filtre avec de l’extrait de bœuf, puis concentré davantage par floculation organique. Nous présentons ici le protocole de la méthode 1615 pour l’élution par filtre, la concentration secondaire et la mesure du nombre total de virus cultivables. Une partie de l’éluat concentré de chaque échantillon est inoculée dans dix flacons répétés de cellules rénales de singe vert Buffalo. Le nombre de fioles présentant des effets cytopathiques est utilisé pour quantifier le nombre le plus probable (NPP) d’unités infectieuses par litre. La méthode utilise un certain nombre de contrôles de la qualité pour améliorer la qualité des données et réduire les variations entre les laboratoires et les laboratoires entiers. Les laboratoires doivent répondre à des normes de performance définies. La méthode 1615 a été évaluée en examinant la récupération du virus à partir d’eaux souterraines et de réactifs ensemencées avec le poliovirus Sabin de type 3. Le taux moyen de guérison du poliovirus avec l’essai cultivable total était de 111 % dans l’eau de qualité réactif et de 58 % dans les eaux souterraines.

Le virus a été concentré à partir de l&#39;eau souterraine de source de trois usines de traitement de l&#39;eau potable et un privé bien en utilisant des filtres électropositifs. Deux ensembles d&#39;échantillons, constitués d&#39;un échantillon de champ et le contrôle LFSM, ont été prélevés dans les usines de traitement des occasions distinctes, et un ensemble de l&#39;échantillon a été prélevé sur le bien privé. La récupération globale du virus a été déterminée en utilisant des échantillons LFSM de deux des plantes et le bien privé (deux échantillons provenant d&#39;une usine et un échantillon provenant d&#39;un autre ont été exclues du calcul parce que la valeur MPN de la semence utilisée pour chaque échantillon n&#39;a pas pu être déterminée avec précision en raison aux résultats de CPE anormaux chez les flacons réplicats). La récupération du poliovirus moyenne à partir d&#39; échantillons d&#39;eau souterraine en moyenne 58% , avec un coefficient de variation de 79% (figure 2) 16. Aucun virus cultivable n&#39;a été détectée dans aucun des échantillons en double au sol non ensemencées sur le terrain de l&#39;eau. la performance de la méthode a également été mesurée en utilisant LFB sDes exemples modifiés en utilisant deux niveaux de semences différentes. Un «faible» de 300 titre NPP de poliovirus a été utilisé pour évaluer la performance à des niveaux inférieurs à la 500 niveau MPN LFB &quot;standard&quot; utilisé dans USEPA Method 1615. Un «haut» titre de 1000 NPP de poliovirus a été utilisé pour tester les performances au niveau du contrôle LFSM. Ces contrôles effectués de manière similaire avec une récupération moyenne de 111% et un coefficient de variation de 100% (figure 2). Tous les LRB échantillons étaient négatifs et tous les échantillons LFB effectuées dans l&#39;intervalle d&#39;acceptation (matériel supplémentaire Tableau S1). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> Figure 1. Filtre Elution. Un schéma d&#39;utilisation d&#39; un récipient sous pression pour le filtre de la cartouche d&#39; élution est représenté. pression d&#39;air positive est utilisée pour pousser la solution d&#39;extrait de boeuf dans le récipient de pression à travers le con de logement de cartouchecontenant le filtre à cartouche électropositif. Une pompe péristaltique peut être remplacé par le récipient sous pression, à l&#39;entrée de la pompe étant placée dans le récipient contenant la solution d&#39;extrait de boeuf. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> Figure 2. Moyenne Poliovirus Récupération (%) à partir de la terre et de qualité réactif eau. La récupération pour cent en moyenne est indiquée pour le poliovirus à partir du sol ( <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; n = 4) et de qualité réactif eau ( <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; n = 12) des échantillons. Les douze échantillons d&#39;eau de qualité réactif inclus six ensemencés avec 300 MPN et six ensemencées avec 1.000 MPN du poliovirus. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;erreur standard.

Nous présentons ici une procédure pour mesurer le nombre total de virus cultivables à l’aide de la lignée cellulaire rénale du singe vert de buffle. La procédure fournit un outil normalisé pour mesurer la présence de virus infectieux dans l’environnement et les eaux potables.

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus Présence dans l&#39;eau par la culture et de RT-qPCR. II. Total des cultivable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

L'objectif général du protocole suivant est de mesurer le taux de particules virales infectieuses dans un échantillon d'eau. Cette mesure est réalisée en utilisant une solution d'extraction basique pour éluer des particules virales chargées négativement à partir d'un filtre électropositif qui a été préalablement concentré avec des virus provenant d'eau potable ou environnementale. La collecte des virus sur un filtre en cartouche électropositif est décrite dans la première partie de cette série.En tant que deuxième étape, le pH de l'éluat est lentement abaissé, ce qui entraîne la formation d'un floc de ces protéines extraites et du virus présent dans l'échantillon. Ensuite, le floc est recueilli par centrifugation, dissous dans un tampon phosphate de sodium et stérilisé par filtration afin d'éliminer les bactéries et les moisissures. Puis, l'éluat concentré final est inoculé sur des cellules rénales de singe vert Buffalo, et les cellules sont observées pendant 14 jours pour détecter l'effet cytopathogène, ou CPE, afin de révéler la réplication virale.Pour libérer les particules virales associées aux cellules, tous les flacons de cellules sont congelés à la fin de 14 jours, ou lorsque l'effet cytopathogène (EC) dans un flacon atteint 75 % ou plus. Après un deuxième et un troisième passage afin de confirmer que l'EC est dû à la réplication virale, un programme de calcul de la concentration la plus probable, ou méthode du nombre le plus probable (MPN), est utilisé pour déterminer le nombre le plus probable par litre de chaque échantillon analysé. En fin de compte, la composante acide virale totale culturable de la méthode EPA 1615 fournit une mesure du niveau de particules virales infectieuses présentes dans l'échantillon d'eau.Ce dosage viral total n'est qu'une composante de la méthode EPA 1615. La méthode complète mesure la présence d'entérovirus et de norovirus dans les eaux potables et environnementales. Les résultats obtenus pour les virus peuvent ensuite être utilisés comme données d'entrée pour évaluer le risque lié à l'exposition à ces virus dans l'eau potable et l'eau de loisir.L'avantage principal de ce protocole est qu'il fournit une approche normalisée unique pour la mesure des virus dans l'eau. Cette approche repose en réalité sur la méthode décrite dans la règle relative à la collecte de données, publiée en 1996. Le principal problème rencontré par les nouveaux utilisateurs avec cette méthode consiste à maintenir la lignée cellulaire BGM exempte de contamination et à interpréter les effets cytopathogènes (CPE).Shay Fout et moi allons démontrer les procédures d'illusion et de floculation organique, suivies de la technique de culture cellulaire. Pour effectuer la première élution, placer 500 millilitres d'extrait de viande tamponné à 1,5 % à température ambiante, pH 9,0, dans un cylindre gradué. Ensuite, ouvrir le boîtier de la cartouche filtrante et ajouter une quantité suffisante d'extrait de viande pour recouvrir complètement le filtre électropositif.Placer le reste de l'extrait de bœuf dans un bécher. Remettre le couvercle du logement du filtre. Après une minute de temps de contact, utiliser une pompe péristaltique et un tube stérile pour faire passer lentement la solution d'extrait de bœuf présente dans le logement, ainsi que celle restant dans le bécher, à travers le filtre.Recueillir l'éluate dans un bécher en verre stérile de 2 litres. Répéter ces étapes avec 500 millilitres supplémentaires d'extrait de bœuf tamponné à 1,5 %, en utilisant toutefois un temps de contact de 15 minutes. Ajouter l'extrait de bœuf de la deuxième élution au bécher de 2 litres contenant celui de la première élution, puis ajouter une barrette magnétique stérile au bécher.Placer le bécher contenant l'éluat sur une plaque agitatrice. Allumer la plaque et augmenter la vitesse d'agitation jusqu'à la formation d'un vortex. Régler lentement le pH de l'éluat à 3,5 ± 0,1 par addition goutte à goutte d'acide chlorhydrique 1,2 molaire, ou HCl.Ajoutez l'acide goutte à goutte, car une addition rapide inactiverait le virus. Pendant ce temps, l'éluat deviendra trouble, un précipité commençant à se former. Réduisez la vitesse d'agitation à un mélange lent et continuez à surveiller et à maintenir le pH de l'éluat à 3,5 ± 0,1 pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, verser la suspension précipitée d'extrait de boeuf dans un ou plusieurs flacons d'ultracentrifugation, et centrifuger pendant 15 minutes à 2 500 ×g à quatre degrés Celsius. Retirer les flacons de la centrifugeuse, puis décantation lentement le surnageant afin d'éviter la perte du précipité en culot. Le surnageant peut être mis au rebut.Pour les lots d'extrait de viande qui se dissolvent en moins de 5 minutes, ajouter 30 millilitres de phosphate de sodium 0,15 molaire, pH 9,0, dans le flacon de centrifugation contenant le précipité. Consulter le protocole écrit pour les instructions concernant la dissolution des précipités qui ne se dissolvent pas en moins de cinq minutes. Agiter pendant 10 minutes après que le précipité soit complètement dissous.Ensuite, retirez l'agitateur magnétique et centrifugez le précipitant dissous pendant 10 minutes à 4 000 à 10 000 ×g et à quatre degrés Celsius. Versez soigneusement le surnageant dans un bécher en verre sans perturber le culot. Ajoutez un agitateur magnétique dans le bécher, puis jetez le culot.Placer le bécher sur un agitateur magnétique et agiter la solution. Ajouter de l'acide chlorhydrique 1,2 M goutte à goutte pour ajuster le pH entre 7,0 et 7,5. Stériliser par filtration le surnageant en le faisant passer à travers un filtre stérilisant muni d'un préfiltre prétraité avec 15 millilitres d'extrait de viande tamponné à 1,5 %, pH 7,0 à 7,5.Voir le protocole écrit pour calculer le volume d'échantillonnage du test, ou S, pour tous les échantillons. Ensuite, calculer le volume d'inoculum en divisant S par 10. À l'aide de ces calculs, diviser le volume final concentré de l'échantillon, c'est-à-dire l'échantillon obtenu après la stérilisation par filtration, en trois sous-échantillons, comme décrit dans le protocole écrit.Inoculez 10 vessels d'essai contenant une monocouche de cellules BGM pour chaque échantillon à tester, avec le volume du sous-échantillon un, équivalent au volume d'inoculum, ainsi que les témoins totaux de l'essai quantitatif en unités de virus cultivables. Pour le témoin enrichi en laboratoire et la matrice d'échantillon enrichie en laboratoire, préparez des dilutions au facteur cinq, 25 et 125 à l’aide du sous-échantillon trois et du phosphate de sodium 0,15 molaire, pH 7,0 à 7,5, comme diluant. En plus des vessels inoculés avec le sous-échantillon un non dilué, inoculez 10 vessels de culture cellulaire lavés pour chaque série de dilutions, en utilisant un volume d'inoculum par vessel d'essai.Répartir l'inoculum sur la surface des monocouches cellulaires en inclinant les récipients d'avant en arrière. Incuber les récipients d'essai à température ambiante pendant 80 à 120 minutes sur une plateforme mécanique oscillante effectuant une à cinq oscillations par minute, ou en basculant manuellement les récipients toutes les 15 à 20 minutes, afin de permettre l'adsorption éventuelle du virus sur les cellules. Ensuite, ajouter le milieu de maintien préchauffé aux récipients d'essai, puis les incuber à 36,5 plus ou moins un degré Celsius.Rechercher l'apparition d'effets cytopathogènes dans chaque récipient d'essai au microscope pendant les trois premiers jours, puis les examiner tous les deux à trois jours jusqu'au jour 14. Transférer tous les récipients présentant plus de 75 % d'effets cytopathogènes dans un congélateur réglé à -70 °C ou inférieur. Après l'examen des récipients le dernier jour, congeler toutes les cultures restantes ainsi que les témoins de l'essai quantitatif de virus cultivables à -70 °C ou inférieur.Ensuite, décongeler toutes les cultures et filtrer plus de 15 % du milieu de chaque récipient d'essai positif au CPE à l'aide d'un filtre stérilisant de 0,2 micron. L'étape suivante consiste à effectuer un deuxième passage de tous les récipients d'essai du premier passage en utilisant des récipients d'essai cellulaires rénaux BGM lavés. Pour ce faire, inoculer les nouveaux récipients d'essai avec un volume d'inoculation représentant 10 % du milieu décongelé provenant de tous les récipients d'essai négatifs, ainsi que du milieu filtré des récipients positifs.Répétez les étapes effectuées pour le premier passage, en congelant tout récipient d'essai qui s'est révélé négatif au premier passage et positif au second. Ensuite, effectuez un troisième passage comme décrit pour le second passage, en utilisant uniquement les témoins de dosage négatifs ainsi que les cultures cellulaires qui étaient négatives lors du premier passage et positives lors du second passage. Identifiez comme positifs au virus les récipients d'essai individuels qui présentent des effets cytopathogènes lors des premier et second passages, ou, dans le cas où l'effet cytopathogène n'apparaît qu'au second passage, lors des second et troisième passages.Utilisez le calculateur du nombre le plus probable de l'Agence de protection de l'environnement des États-Unis avec les paramètres par défaut du programme définis comme indiqué dans le protocole, afin de calculer les titres viraux de tous les échantillons testés. Ensuite, utilisez les valeurs obtenues pour le nombre le plus probable d'unités infectieuses par millilitre, ainsi que les limites de confiance supérieure et inférieure par millilitre, pour calculer le nombre le plus probable d'unités infectieuses par litre et les limites de confiance correspondantes, comme décrit dans le protocole. Le pourcentage moyen de récupération est indiqué pour le poliovirus à partir d'échantillons d'eau souterraine et d'eau de qualité réactif.Le rendement moyen de récupération du poliovirus à partir d'échantillons d'eau souterraine a été en moyenne de 58 %, avec un coefficient de variation de 79 %. Aucun virus cultivable n'a été détecté dans les échantillons d'eau souterraine prélevés en double et non inoculés. La performance de la méthode a également été évaluée à l'aide d'échantillons de blanc enrichi en laboratoire, modifiés en utilisant deux niveaux différents d'inoculation. Les douze échantillons d'eau de qualité réactif comprenaient six échantillons inoculés avec 300 UMP d'unités infectieuses et six échantillons inoculés avec 1 000 UMP d'unités infectieuses de poliovirus.Ces témoins ont donné des résultats similaires, avec un rendement moyen de 111 % et un coefficient de variation de 100 %. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de respecter la technique aseptique et les bonnes pratiques de laboratoire afin d'éviter la contamination des échantillons. Il est également important de se souvenir que, lorsqu'on travaille avec des agents pathogènes viraux, des précautions doivent être prises, telles que le port de gants, chaque fois que cette procédure est effectuée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment diluer les virus, utiliser des filtres électropositifs, réaliser une floculation organique et effectuer des tests de culture cellulaire.En complément de cette procédure, vous pouvez également réaliser des tests moléculaires afin d'identifier et de détecter d'autres types de virus.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

Recherche

JoVE Journal

Environment

Environnement

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

La méthode EPA 1615 utilise un filtre électropositif pour concentrer les entérovirus et les norovirus dans l’environnement et les eaux potables. Ce manuscrit décrit la procédure de collecte d’échantillons pour les analyses de la méthode 1615.

Méthode EPA 1615. Mesure de entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par Culture et RT-qPCR. I. Prélèvement des échantillons de virus

Nous présentons ici une procédure de quantification des entérovirus et des norovirus dans les eaux environnementales et potables à l’aide de la transcription inverse-PCR quantitative. Le taux moyen de récupération du virus dans les eaux souterraines avec cette procédure normalisée de la méthode 1615 de l’EPA était de 20 % pour le poliovirus et de 30 % pour le norovirus murin.

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par la culture et RT-qPCR. Partie III. Détection de virus par RT-qPCR

Une méthodologie d’échantillonnage basée sur la macromousse a été développée et évaluée pour la détection et la quantification des norovirus sur les surfaces dures de l’environnement.

Swab Méthode d&#39;échantillonnage pour la détection des norovirus humains sur les surfaces

Une approche a été développée pour identifier les conditions optimales de concentration virale pour des échantillons d’eau de petit volume à l’aide de pointes d’adénovirus humains. Les techniques décrites ici sont utilisées pour identifier les paramètres de concentration d’autres cibles virales et appliquées à l’expérimentation de concentration virale à grande échelle.

Une procédure de petit volume pour la concentration virale de l&#39;eau

Ce manuscrit décrit un essai PCR duplex numérique qui peut être utilisé pour quantifier simultanément Enterococcus spp. , Et les marqueurs génétiques HF183 comme indicateurs de contamination fécale générale et humaine associée dans les eaux récréatives.

Un test PCR Duplex numérique pour simultanée Quantification de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Et le HF183 marqueur humain Fecal associé dans les eaux

Nous présentons le VacuSIP, une méthode simple, non intrusive et fiable pour un échantillonnage ponctuel propre et précis de l’eau. Le système a été mis au point et évalué pour la collecte simultanée de l’eau inhalée et expirée par les suspensions benthiques in situ, afin de mesurer proprement l’élimination et l’excrétion des composés particulaires et dissous.

VACUSIP, une méthode Inex améliorée pour<em&gt; In Situ</em&gt; Mesure des particules et composés dissous transformés par suspensivores actifs

Cet article présente le protocole pour une identification rapide pour Bemisia tabaci , basé sur la technologie d’amplification isotherme boucle-négociée (lampe). Le protocole nécessite une formation minimale de laboratoire et peut, par conséquent, être mis en œuvre sur place aux points d’entrée pour les importations de végétaux tels que les ports et aéroports.

Un test d’Amplification isotherme (lampe) médiée par la boucle pour une Identification rapide de Bemisia tabaci

Ce protocole diagnostique Tilapia lac Virus (TiLV) dans les tissus de tilapia à l’aide de méthodes de RT-PCR. L’ensemble de la méthode est décrite de la dissection des tissus à l’extraction d’ARN totale, suivie de la synthèse de cDNA et détection de TiLV par PCR classique ou PCR quantitative à l’aide d’ADN double brin contraignant un colorant fluorescent obligatoire.

Détection de Tilapia lac Virus à l’aide de RT-PCR classique et SYBR Green RT-qPCR

Une conception de microplots pour la recherche sur les traceurs de 15N est décrite pour tenir compte de multiples événements d’échantillonnage des plantes et des sols en saison. Des procédures de collecte et de traitement des échantillons de sol et d’usine, y compris les protocoles de broyage et de pesage, pour l’analyse de 15N sont mises de l’avant.

Conception de microplots et préparation d’échantillons de plantes et de sols pour 15analyses d’azote

Apprenez à mesurer les virus infectieux dans l'eau en utilisant la méthode EPA 1615 avec culture cellulaire sur lignée BGM. Cette approche standardisée permet d'évaluer les risques sanitaires liés aux virus entériques.

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus Présence dans leau par la culture et de RT-qPCR. II. Total des cultivable Virus Assay (Vidéo) | JoVE Journal

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus Présence dans l'eau par la culture et de RT-qPCR. II. Total des cultivable Virus Assay

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