Name: Détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (EFIRM) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Découvrez une méthode d'extraction et d'analyse rapide des exosomes à partir de biofluides en utilisant des microparticules magnétiques et un champ électrique. Cette technique permet la quantification électrochimique des acides nucléiques et des protéines pour la découverte de biomarqueurs.

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Ce travail a été soutenu par le National Center for Research Resources et le Centre national pour l&#39;avancement des sciences translationnelle, National Institutes of Health, par Grant UL1TR000124 (FW); Félix &amp; Mildred Yip Doué chaire et le Fonds famille Barnes (à DTWW), l&#39;Institut national de recherche dentaire et craniofaciale des Instituts nationaux de la santé en vertu Prix Nombre T90DE022734 (MT). Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

1. Extraction Exosome magnétique à base de perle <ol><li> Pipeter une solution bien mélangée de 5 ul de microparticules magnétiques revêtues de streptavidine dans 495 pl de tampon phosphate salin (PBS) tampon dans un tube de microcentrifugeuse pour remettre en suspension les billes. Lavez et remettre en suspension les perles avec 500 pi de PBS trois fois en utilisant une grille magnétique. Le rack est un ensemble d&#39;aimants sur le côté d&#39;une unité d&#39;habitation qui peuvent maintenir les tubes échantillons à centrifuger. <ol><li> Pour chaque lavage, d&#39;abord laisser les tubes se asseoir sur la grille pendant 1 min, puis utilisez une pointe de pipette pour enlever soigneusement le tampon de surnageant sans déranger les perles. </li><li> Placer les tubes sur une grille régulière sans aimants sur le côté. Ajouter 500 pi de PBS dans les tubes, et utiliser la pipette pour mélanger la solution et de perles ensemble. Ensuite, mettre les tubes de retour sur la grille magnétique pour séparer à nouveau les perles de la solution. </li><li> Effectuez cette élimination de tampon par aimantation et remise en suspension dans un PBStrois fois au total. Ceci effectue un lavage initiale des particules magnétiques. </li></ol></li><li> Remettre en suspension les billes dans 490 pl de tampon PBS, avec le tube placé sur la partie non magnétisée de la crémaillère magnétique. Pipeter 5 ul de l&#39;anticorps CD63 anti-humain de souris biotinylé à 1,0 mg / ml concentration de matière dans le mélange de billes. Utilisez la pipette pour mélanger les perles et l&#39;anticorps en solution. </li><li> Placer les microtubes avec perles et mélange d&#39;anticorps biotinylé sur un échantillon rotateurs. Régler les paramètres des rotateurs pour le dispositif de rotation de l&#39;échantillon pour la rotation réciproque de basculement à 90 ° pendant 5 s et vibrant à 5 ° C pendant 1 sec. Faire tourner les tubes de mélange échantillon-bille à ces paramètres pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Retirer anticorps non lié après conjugaison. <ol><li> Après 30 min de rotation à la température ambiante, placer les tubes de retour dans le rack magnétique pendant 5 min. </li><li> Effectuer trois lavages de perles en supprimant la phase liquide à l&#39;aide d&#39;une micropipette et laver avec 500 μ; L de PBS. Après la triple lavage, remettre en suspension les perles dans 490 ul de caséine-PBS et le lieu sur la partie non magnétisé de la crémaillère. </li></ol></li><li> extraction de Exosome en utilisant des billes revêtues d&#39;anticorps. <ol><li> Étiqueter chaque tube avec ciblée ID de l&#39;échantillon. Pipeter un échantillon de 10 ul de sérum ou de salive dans le tube de microcentrifugeuse. Utilisez la pipette pour mélanger l&#39;échantillon et des billes magnétiques par pipetage à plusieurs reprises. </li><li> Placer les tubes à échantillon et des billes anti-humains d&#39;anticorps anti-CD63 sur la coiffe et faire tourner pendant 2 heures à température ambiante. Utiliser les mêmes paramètres des rotateurs comme décrit à l&#39;étape 1.2. </li><li> Suite à 2 h de l&#39;échantillon tournant, effectuer un lavage triple en magnétisant à billes séparées de la solution, en éliminant la phase liquide avec la micropipette, et la remise en suspension des billes dans 500 pl de tampon Tris-HCl. Les perles résultantes sont désormais liés aux exosomes et sont prêts pour la libération du champ électrique et de mesure. </li></ol></li></ol> 2. Champ électrique induite publié une Mesure de la teneur exosomales <ol><li> Revêtement préalable initiale de l&#39;électrode avec Primer GADPH <ol><li> Appliquer une matière plastique et à un réseau d&#39;électrodes afin d&#39;éviter la contamination croisée des électrodes individuelles. Pour cette expérience, en utilisant un réseau d&#39;électrodes 16 du capteur à chaque électrode de l&#39;unité dans la matrice constituée d&#39;un travail, le compteur, et l&#39;électrode de référence en or nu. </li><li> Préparer un mélange d&#39;actions de 100 nM sonde d&#39;ADN, 0,3 M de KCl, et 10 mM pyrrole par pipetage des réactifs d&#39;achat d&#39;actions dans un tube avec de l&#39;eau distillée ultra pure. Bien mélanger au vortex. NOTE: Pour cette étude, la sonde d&#39;ADN choisie correspond au gène de référence de GAPDH, qui est connu pour exister dans exosomes. La séquence de la sonde utilisée est: 5&#39;-biotine-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 &#39;. Utilisez ce mélange sur toutes les électrodes. </li><li> Pipeter 60 ul du mélange de monomère d&#39;ADN-sonde sur la surface de chaque électrode en or. Examinez les électrodes pour se assurer qu&#39;il ya une couverture adéquate du travail, contre, et des électrodes de référence par le mélange liquide. </li><li> Electropolymerize mélange monomère-sonde pour créer une couche de polymère conducteur sur la surface de l&#39;électrode par application d&#39;une onde carrée (CSW) le profil cyclique de champ électrique à la surface de l&#39;électrode. Ce champ électrique consiste à appliquer 350 mV pour 9 sec et de commutation immédiatement 950 mV pour 1 sec. Appliquer ce profil cyclique onde carrée à l&#39;électrode pendant 10 cycles, pour un total de 100 secondes de champ électrique appliqué. </li><li> Rincer la surface du capteur 3 fois à l&#39;eau distillée et on sèche avec de l&#39;azote gazeux pour éliminer le liquide de la surface de l&#39;électrode. Se assurer que le liquide est correctement supprimé de l&#39;électrode. </li></ol></li><li> Exosome déchargement de la cargaison <ol><li> Charge 5 ul de 1 uM d&#39;une sonde de détection dans 495 ul du mélange complexe de bourrelet exosomes et en utilisant une pipette pour mélanger. REMARQUE: La sonde de détection est une séquence d&#39;amorce d&#39;ADN conjugué à une molécule de fluorescéine à l&#39;extrémité 3 &#39;. Le détecteur de probe séquence utilisée pour cette étude correspond à l&#39;ARNm GAPDH trouvés dans exosomes. La séquence de la sonde de détection conjugué à la fluorescéine est la suivante: 5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-fluorescéine-3 &#39;. </li><li> Introduire à la pipette 60 ul de la sonde et de perles exosomes mélange complexe sur la surface d&#39;électrode en or avec un réseau d&#39;aimants dessous. Ce réseau d&#39;aimants est constitué de seize 2,54 mm diamètre des aimants en néodyme alignés pour correspondre aux électrodes de travail du capteur. La figure 2A illustre le placement des aimants et solution de bourrelet exosomes. </li><li> Une fois que l&#39;échantillon est chargé sur la surface de l&#39;électrode, appliquer 20 cycles du champ électrique CSW avec neuf secondes à -300 mV et 1 s à 200 mV (200 du total sec). La cargaison de exosomal qui est libérée va se hybrider aux amorces sur la surface de l&#39;électrode. Si des marqueurs de surface de la exosomes sont l&#39;objet d&#39;enquête, sauter cette partie de l&#39;expérience. Figure 2B illustre ce processus. </li> &lt;li&gt; Lavez-off les analytes non liés à la surface de l&#39;électrode par triple rinçage de la surface de l&#39;électrode avec de l&#39;eau distillée. Sécher l&#39;électrode avec de l&#39;azote gazeux. </li></ol></li><li> Reporter anticorps et Lecture <ol><li> Ajouter 60 ul de 150 unité / anticorps anti-fluorescéine ml conjugué à la peroxydase de raifort (HRP en 1: 1000 dilution) dilués dans caséine / PBS. </li><li> Utilisez un champ électrique conjugaison conduit à HRP anti-fluorescéine complexe pour le sandwich de la sonde. Appliquer -200 mV pendant 1 s et 500 mV pendant 1 s à 5 cycles à la surface de l&#39;électrode. La figure 2A montre les complexes de sonde de capture et de détection à la fois une protéine et d&#39;acide nucléique système. </li><li> Surface du capteur de lavage Triple utilisant de l&#39;eau distillée et sécher avec de l&#39;azote gazeux. </li><li> Après le lavage-off de l&#39;excès de l&#39;anticorps anti-fluorescéine non lié, ajouter 60 ul de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tétraméthylbenzidine (TMB). Chargez ce substrat sur chaque surface de capteur à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. </li><li> Effectuer une lecture ampérométrique du courant par mesure du courant d&#39;électrode à -200 mV pendant 60 secondes en utilisant un potentiostat capable électrochimique de mesure simultanée de 16 canaux. La figure 2C est un exemple de profil de courant lors de la lecture. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> Figure 2. Composants de EFIRM méthode. (A) la méthode d&#39;extraction exosomes de biofluide utilisant CD63 anti-humain revêtu microparticules magnétiques et déchargement de la cargaison de exosomes par ondes carrés cycliques appliquées au complexe de particules exosomes. (B) Schéma de l&#39;électrode biocapteur utilisé pour détecter des cibles ARN / ADN / protéine de la exosomes libérés. (C) un exemple représentatif de lecture ampérométrique de la méthodologie de EFIRM, où plus grande ampleur actuelle correspond to niveaux plus élevés d&#39;une biomolécule. Ce chiffre est de Wei et al. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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<li>Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+exosomal+biomarker+by+electric+field-induced+release+and+measurement+%28EFIRM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM).</a> Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).</li>
</ol>

David Wong est co-fondateur de RNAmeTRIX Inc., une société de diagnostic moléculaire. PeriRx LLC sous-licence de propriété intellectuelle se rapportant aux diagnostics moléculaires de RNAmeTRIX. David Wong est un consultant pour PeriRx.

Comme les résultats l&#39;indiquent, CD63 anti-humain revêtu nanoparticules magnétiques sont capables de capturer spécifiquement les petites particules qui ont une taille allant de 70 à 100 nm. Cette particule capturée est cohérent avec le profil déjà observé des exosomes. En outre, l&#39;utilisation de la CCF basse tension suivant la capture des particules est indiquée pour les retirer de la surface des billes et causer des profils de dégradation d&#39;ADN similaires à celle d&#39;une méthode traditionnelle de tampon d...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

recherche Exosome est un domaine émergent de l&#39;enquête qui examine microvésicules lipidiques qui portent une ARN, l&#39;ADN 2, 3 et en protéines cargaison. Enquêtes précédentes de la biologie exosomes ont conduit à l&#39;identification des exosomes dans biofluides tels que le sang 4, 5 urine, le lait maternel 6, 7 et la salive. Des études ont démontré que les exosomes jouent un rôle dans différentes voies cellulaires, méditant à distance communication entre les différents systèmes du corps 8. En raison du rôle exosomes jouent dans la communication intercellulaire, on suppose qu&#39;elles peuvent conditionner biomolécules cibles (protéines, ARN et ADN) corrélés à des états pathologiques. 3 in vitro et de l&#39;animal modèle 9 études semblent confirmer cette hypothèse. En recherchant la teneur exosomal pour la découverte de biomarqueurs, il est nécessaire de développer une méthodologie pour l&#39;isolement de exosome sélective de fluides biologiques, expulsi induiteen charge des cargaisons d&#39;exosomes, et la quantification de biomolécules d&#39;exosomes. Dans la mesure de ce travail, les exosomes seront définis comme une structure ayant un diamètre d&#39;environ 70 à 100 nm et possédant surface marqueur CD63. Les chercheurs généralement abord purifier exosomes par ultracentrifugation 10 puis traiter le contenu exosomal grâce à l&#39;utilisation de kits de tampon de lyse. Utilisation de méthodes de tampon de lyse nécessite des temps d&#39;incubation allant de quelques minutes à quelques heures. Ce processus peut potentiellement nuire fret exosomes et conduire à la dégradation de l&#39;échantillon. Par exemple, un ARN exosomes salivaire libéré par le tampon de lyse dans le milieu extracellulaire entourant possède une demi-vie de moins de 1 min, ce qui rend la mesure de l&#39;ARN exosomal post-Lysis Buffer une tâche particulièrement difficile sans l&#39;addition de réactifs de stabilisation 11. L&#39;effet composé de l&#39;ajout de divers réactifs pour la lyse et la stabilisation peut introduire des agents qui compliquent et interférer avec l&#39;analysis du contenu de exosomal. Une autre approche peut être utile pour décharger rapidement le contenu de exosomal et la préservation de la cargaison en toute sécurité pour la caractérisation. Dans ce travail, nous proposons l&#39;utilisation d&#39;un champ électrique non-uniforme pour la libération de contenu exosomal. Champs électriques ont été connus pour porter la capacité à polariser et perturber la bicouche lipidique qui forme les membranes cellulaires. Notre travail expérimental explore l&#39;utilisation de non-uniformes ondes carrées cycliques (CSW) pour perturber la structure de microvésicule des exosomes et de libérer la cargaison transportée. Cette méthode utilise des tensions dans la gamme de plusieurs centaines de millivolts, ce qui signifie que la plupart des biomolécules ne seront pas perturbés. Nous démontrons que l&#39;utilisation d&#39;une onde cyclique carré est apte à actionner libération des exosomes salivaires contenu de l&#39;ARNm dans l&#39;environnement fluide environnant. Cette version de la teneur en exosomal est parfaitement intégré avec un système d&#39;électrodes qui peut être utilisé pour quantifier les niveaux d&#39;expression de biomarqueur 12,13. Cette méthode proposée permet sensibles, et le tampon de lyse analyse rapide, sans contenu de exosomes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de EFIRM Workflow.. La méthode de EFIRM est globalement divisé en trois grandes phases qui sont nécessaires pour la purification et l&#39;analyse des exosomes. Cette teneur en exosomal libération et l&#39;analyse sur la base de la méthode CSW est utilisé en conjonction avec des microbilles magnétiques spécifiques à CD63 pour l&#39;isolement d&#39;exosomes. Ces billes permettent CD63 affinité pour l&#39;isolement sélectif des exosomes à partir d&#39;échantillons salivaires (et d&#39;autres fluides biologiques). Après incubation et d&#39;extraction des exosomes en utilisant les perles magnétisées, les perles sont migrés vers le système de capteur électrochimique pour la CSW de presse basée contenu et la partie de l&#39;analyse de l&#39;expérience. La figure 1 donne un aperçu du travailse écouler de la méthode de EFIRM.

<table><tbody><tr><td>Système de lecture Helios 16 canaux avec interface à puce&nbsp ;</td><td>Genefluidics, États-Unis</td><td>&nbsp ; RS-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>16x Puce de capteur, or nu, paquet de 5 puces</td><td>Genefluidics, États-Unis</td><td>SC1000-16X-B</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD63 humain biotinylé</td><td>Ancell, États-Unis</td><td>215-030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen, États-Unis</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Aimant néodyne (1/10 » de diamètre x 1/32 » d’épaisseur)</td><td>K& J Magnetics, États-Unis</td><td>DH101</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Distilled</td><td>Water Life Technologies, États-Unis</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toldeo 3 M KCl Solution</td><td>Fisher Scientific, États-Unis</td><td>1911512</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma-Aldrich,</td><td>États-Unis W338605-100g</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescéine-POD, Fab fragments</td><td>Roche, Allemagne</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>Substrat de 3,3&prime ;,5,5&prime ;-tétraméthylbenzidine (TMB/H2O2, faible activité)</td><td>Neogen, États-Unis</td><td>330175</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Solution Life Technologies, États-Unis</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Casein/PBS</td><td>Fisher Scientific, États-Unis</td><td>37532</td><td></td></tr></tbody></table>

détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (efirm)

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Les exosomes sont des structures microvésiculaire qui jouent un rôle de médiateur dans la communication intercellulaire. Il est intéressant d&#39;étudier la cargaison interne des exosomes pour déterminer si elles sont porteuses de maladies biomarqueurs discriminatoires. Pour effectuer une analyse de exosomal, il est nécessaire de mettre au point un procédé d&#39;extraction et d&#39;analyse des exosomes à partir de fluides biologiques cibles sans endommager le contenu interne. Libération induite de champ électrique et de mesure (EFIRM) est une méthode pour extraire spécifiquement exosomes de biofluides, le déchargement de leur cargaison, et de tester leur contenu ARN / protéines interne. Utilisation d&#39;un anticorps CD63 spécifique microparticule magnétique anti-humain, les exosomes sont tout d&#39;abord précipités à partir de fluides biologiques. Après extraction, basse tension électriques des ondes carrées cycliques (CCF) sont appliqués à rompre la membrane vésiculaire et provoquer déchargement de marchandises. Le contenu de la exosomes est hybridée à des amorces d&#39;ADN ou des anticorps immobilisés sur une surface d&#39;électrode pour quantification du contenu moléculaire. Procédé de EFIRM est avantageux pour l&#39;extraction des exosomes et déchargement des marchandises pour l&#39;analyse sans tampon de lyse. Ce procédé est capable de réaliser une détection spécifique de deux cibles d&#39;ARN et de protéines biomarqueurs dans le exosomes. EFIRM extrait exosomes spécifiquement en fonction de leurs marqueurs de surface par opposition à des techniques basées sur la taille. Microscopie électronique en transmission (TEM) et le dosage montrent la fonctionnalité du procédé de capture et d&#39;analyse des exosomes. Procédé de EFIRM a été appliqué à exosomales analyse de 9 souris injectées avec des cellules H640 de cancer du poumon humain (une lignée cellulaire transfectée pour exprimer le marqueur d&#39;exosomes CD63-GFP humain) afin de tester leur profil d&#39;exosomes contre 11 souris recevant témoins de sérum physiologique. Des niveaux élevés de biomarqueurs exosomales (GAPDH du gène de référence et de la protéine de surface marqueurs humaine CD63-GFP) ont été trouvé pour le H640 souris injectées dans les deux échantillons de sérum et de salive. En outre, saliVA et des échantillons de sérum ont été démontré que la linéarité (R = 0,79). Ces résultats suggèrent pour la viabilité des biomarqueurs salivaires exosomes pour la détection de maladies distales.

Validation de la capture des exosomes des Perles Utilisation TEM L&#39;isolement d&#39;exosomes à partir de la salive à l&#39;aide de billes magnétiques anti-CD63 humains a été validée en suivant le protocole d&#39;extraction à l&#39;aide de la microscopie électronique à transmission (TEM) d&#39;images. TEM montre billes magnétiques avec 70 à 100 nm granules immédiatement adjacentes (voir la figure 3A, et 3B), compatibles avec le profil conn...

Les exosomes sont des structures microvésiculaires présentes dans les biofluides qui peuvent porter d’importants biomarqueurs discriminants de maladies. Ici, une nouvelle méthode est utilisée pour extraire spécifiquement les exosomes et tester rapidement la cargaison exosomale pour les cibles ARN/protéines après la perturbation des exosomes à l’aide d’ondes carrées cycliques électriques non uniformes.

Détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

L'objectif général de cette procédure est d'extraire efficacement des exosomes à partir de liquides biologiques, d'expulser le contenu des exosomes et d'analyser rapidement ce contenu. Cette approche est réalisée en extrayant d'abord les exosomes des liquides biologiques à l'aide de microparticules magnétiques portant des anticorps ciblant des marqueurs d'exosomes, puis en déposant les exosomes extraits sur une surface d'électrode. Ensuite, l'exosome est lysé à l'aide d'un champ électrique et son contenu est hybridé à des sondes fixées sur la surface de l'électrode.Une molécule rapporteur est également hybridée au système. La dernière étape consiste à ajouter une solution de substrat à la surface de l'électrode, puis à obtenir le signal en mesurant le courant électrique. En fin de compte, la mesure électrochimique du courant permet de déterminer la quantité d'acide nucléique ou de protéine présente dans l'échantillon d'exosomes.Le principal avantage de cette technologie par rapport aux méthodes existantes, telles que l'ultracentrifugation et le tampon lysine, réside dans sa simplicité et sa rapidité pour l'extraction et le test du contenu des exosomes. Nous sommes très enthousiastes à propos de cette technologie, car, pour la première fois, la technologie efim nous permet d'utiliser les informations libérées par les organes en cas de maladie ou d'état normal, informations qui sont excrétées par l'organe d'origine via la circulation vasculaire et qui atteignent ensuite notre cavité buccale. Cette technologie nous permet de capturer ces informations et de libérer leur contenu moléculaire, que nous pouvons détecter simultanément de manière souple.Ces informations discriminantes pour la maladie, en général, peuvent poser des difficultés aux utilisateurs novices de cette méthode, car l'utilisation de microparticules magnétiques peut être délicate si l'on n'est pas attentif. En outre, le recours à des méthodes électrochimiques pour l'analyse d'échantillons biologiques peut constituer un paradigme nouveau pour certains. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la manipulation des microparticules magnétiques et le chargement électrochimique sont difficiles à maîtriser. Une attention particulière doit être portée lors de la manipulation des microparticules magnétiques et de leur chargement sur les électrodes.Pour commencer la resuspension, préparez une solution mère contenant 10 microgrammes par millilitre de microparticules magnétiques revêtues de streptadinine, puis ajoutez cinq microlitres de cette solution dans un tube de microcentrifugeuse contenant 495 microlitres de PBS afin de laver les billes. Commencez par placer le tube sur un support magnétique pendant une minute, puis retirez soigneusement le tampon sans perturber les billes.Ensuite, transférez le tube sur un support non magnétique. Ajoutez 500 microlitres de PBS et faites un lavage des billes par PET. Répétez cette opération un total de trois fois ; après le dernier lavage, réutilisez les billes.Suspendez les billes dans 490 microlitres de PBS, puis ajoutez 5 microlitres d'anticorps Biotinylé anti-CD63 humain de souris provenant d'une solution mère à 1 milligramme par millilitre. Mélangez la solution à l'aide d'une pipette programmée sur un rotateur d'échantillons pour une rotation réciproque à 90 degrés pendant cinq secondes et une vibration à 5 degrés pendant une seconde. Placez les tubes dans le rotateur et exécutez le programme pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, transférez les tubes sur le support magnétique pendant cinq minutes. Lavez les billes trois fois avec 500 microlitres de PBS, puis resuspendez-les dans 490 microlitres de PBS contenant Caine. Étiquetez un tube avec l'identification de l'échantillon, puis ajoutez 10 microlitres de l'échantillon en pipetant plusieurs fois pour mélanger l'échantillon avec les billes conjuguées à l'anticorps.Ensuite, transférez les tubes sur le rotateur d'échantillons et exécutez le même programme pendant deux heures à température ambiante. Lavez ensuite les billes trois fois avec 500 microlitres d'un tampon tris chlorhydrate à une molaire. À l'aide du support magnétique, les exosomes sont maintenant liés aux billes magnétiques pour préparer l'électrode.Diluez d'abord les solutions mères du sonde, du chlorure de potassium et du monomère oléique dans de l'eau distillée. La sonde d'ADN biotinylée en extrémité 5' est spécifique de l'ARNm de GA DH. Mélangez la solution de sonde-monomère par vortexage.Utilisez un réseau d'électrodes à 16 capteurs dans lequel chaque électrode unitaire comprend des électrodes de travail, contre-électrode et référence composées d'or nu. Placez un puits en plastique sur le réseau d'électrodes afin d'éviter toute contamination croisée des électrodes. Transférez 60 microlitres de la solution monomère de sonde à la surface d'une électrode en or de sorte que les électrodes de travail, contre-électrode et référence soient recouvertes par le liquide.Appliquer un profil de champ électrique carré cyclique, appelé champ A-C-S-W-E, afin de polymériser électriquement un monomère sonde. Cela crée une couche de polymère conducteur sur la surface de l'électrode. Rincer le capteur trois fois avec de l'eau distillée, puis le sécher à l'aide d'azote gazeux pour éliminer le liquide présent sur la surface de l'électrode.Après avoir préalablement recouvert l'électrode avec la sonde de capture, ajouter cinq microlitres d'une solution monomolaire de la sonde de détection à 495 microlitres de la solution complexe de billes et d'exosomes, puis mélanger par pipetage. La sonde est un amorce d'ADN conjuguée à la fluorescéine en position trois prime, spécifique de GA dh. Placer un réseau d'électrodes précodé au-dessus d'un réseau d'aimants composé de 16 aimants alignés avec les électrodes de travail du capteur.Ensuite, transférez 60 microlitres de la solution d'exosomes liés aux billes vers la surface de l'électrode. Appliquez un champ A-C-S-W-E pendant 20 cycles. Le contenu exosomal libéré s'hybridera à la sonde située sur la surface de l'électrode.Rincez la surface de l'électrode trois fois avec de l'eau distillée afin d'éliminer tout analyte non lié, puis séchez l'électrode à l'aide d'un flux de gaz azote. Ensuite, préparez une dilution au 1/1000 d'anticorps anti-fluorescéine conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dans du PBS contenant de la Caine. Ajoutez alors 60 microlitres de la dilution d'anticorps sur la surface de l'électrode.Appliquer le champ A-C-S-W-E sur la surface de l'électrode afin de conjuguer l'anticorps anti-fluorescéine HRP à la sonde de détection. Rincer la surface du capteur trois fois avec de l'eau distillée pour éliminer l'excès d'anticorps, puis sécher l'électrode à l'aide d'azote gazeux. Ensuite, déposer 60 microlitres de substrat TMB sur chaque surface de capteur à l’aide d’une pipette multicanaux et mesurer le courant électrochimique à l’aide d’un potentiostat à –200 millivolts pendant 60 secondes.Pour obtenir la lecture tric, la microscopie électronique en transmission a été utilisée afin de déterminer si des exosomes étaient liés aux billes magnétiques. Les granules de taille comprise entre 70 et 100 nanomètres attachés aux billes sont compatibles avec la taille connue des exosomes après lyse par le champ électrique ou par un détergent. Aucun exosome n'est visible à proximité des billes.L'ARNm de GA DH dans les exosomes a été détecté par lecture atric. La quantité de GA DH présente diminue au fil du temps, comme prévu après la lyse des exosomes par un champ électrique ou un détergent, indiquant une exposition à l'environnement extravésiculaire de la salive. Efim a été utilisé pour mesurer la teneur en exosomes du sérum et de la salive de souris ayant reçu une injection de cellules humaines de cancer du poumon produisant un marqueur exosomal humain CD 63 GFP.Après 20 jours, des taux plus élevés de CD63 GFP ont été observés à la fois dans le sérum et la salive des souris injectées avec les cellules cancéreuses, mais pas chez celles injectées avec la solution saline. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter de toucher les billes afin d’extraire une quantité adéquate de liquide lors du lavage des billes, de laver uniformément la surface de l’électrode et de charger correctement les régions sur l’électrode. Cette technologie, cette technologie efim, fournit la capacité critique non satisfaite permettant de comprendre comment une maladie systémique, un organe distant, peut libérer son information et de la quantifier au sein de cette entité appelée exosomes.Comment ils pénètrent dans la salive, dans notre cavité buccale, et permettent de capturer les exosomes, de libérer ces cibles moléculaires, et de les détecter simultanément dans des maladies menaçantes telles que le diabète, le cancer du pancréas ou d'autres troubles potentiellement mortels. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'extraire rapidement des exosomes à partir d'un liquide biologique, de libérer le contenu des exosomes, et d'analyser rapidement leur contenu à l'aide d'un système d'électrodes intégré.

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