Détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (EFIRM)

L'objectif général de cette procédure est d'extraire efficacement des exosomes à partir de liquides biologiques, d'expulser le contenu des exosomes et d'analyser rapidement ce contenu. Cette approche est réalisée en extrayant d'abord les exosomes des liquides biologiques à l'aide de microparticules magnétiques portant des anticorps ciblant des marqueurs d'exosomes, puis en déposant les exosomes extraits sur une surface d'électrode. Ensuite, l'exosome est lysé à l'aide d'un champ électrique et son contenu est hybridé à des sondes fixées sur la surface de l'électrode.

Une molécule rapporteur est également hybridée au système. La dernière étape consiste à ajouter une solution de substrat à la surface de l'électrode, puis à obtenir le signal en mesurant le courant électrique. En fin de compte, la mesure électrochimique du courant permet de déterminer la quantité d'acide nucléique ou de protéine présente dans l'échantillon d'exosomes.

Le principal avantage de cette technologie par rapport aux méthodes existantes, telles que l'ultracentrifugation et le tampon lysine, réside dans sa simplicité et sa rapidité pour l'extraction et le test du contenu des exosomes. Nous sommes très enthousiastes à propos de cette technologie, car, pour la première fois, la technologie efim nous permet d'utiliser les informations libérées par les organes en cas de maladie ou d'état normal, informations qui sont excrétées par l'organe d'origine via la circulation vasculaire et qui atteignent ensuite notre cavité buccale. Cette technologie nous permet de capturer ces informations et de libérer leur contenu moléculaire, que nous pouvons détecter simultanément de manière souple.

Ces informations discriminantes pour la maladie, en général, peuvent poser des difficultés aux utilisateurs novices de cette méthode, car l'utilisation de microparticules magnétiques peut être délicate si l'on n'est pas attentif. En outre, le recours à des méthodes électrochimiques pour l'analyse d'échantillons biologiques peut constituer un paradigme nouveau pour certains. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la manipulation des microparticules magnétiques et le chargement électrochimique sont difficiles à maîtriser. Une attention particulière doit être portée lors de la manipulation des microparticules magnétiques et de leur chargement sur les électrodes.

Pour commencer la resuspension, préparez une solution mère contenant 10 microgrammes par millilitre de microparticules magnétiques revêtues de streptadinine, puis ajoutez cinq microlitres de cette solution dans un tube de microcentrifugeuse contenant 495 microlitres de PBS afin de laver les billes. Commencez par placer le tube sur un support magnétique pendant une minute, puis retirez soigneusement le tampon sans perturber les billes.

Ensuite, transférez le tube sur un support non magnétique. Ajoutez 500 microlitres de PBS et faites un lavage des billes par PET. Répétez cette opération un total de trois fois ; après le dernier lavage, réutilisez les billes.

Suspendez les billes dans 490 microlitres de PBS, puis ajoutez 5 microlitres d'anticorps Biotinylé anti-CD63 humain de souris provenant d'une solution mère à 1 milligramme par millilitre. Mélangez la solution à l'aide d'une pipette programmée sur un rotateur d'échantillons pour une rotation réciproque à 90 degrés pendant cinq secondes et une vibration à 5 degrés pendant une seconde. Placez les tubes dans le rotateur et exécutez le programme pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, transférez les tubes sur le support magnétique pendant cinq minutes. Lavez les billes trois fois avec 500 microlitres de PBS, puis resuspendez-les dans 490 microlitres de PBS contenant Caine. Étiquetez un tube avec l'identification de l'échantillon, puis ajoutez 10 microlitres de l'échantillon en pipetant plusieurs fois pour mélanger l'échantillon avec les billes conjuguées à l'anticorps.

Ensuite, transférez les tubes sur le rotateur d'échantillons et exécutez le même programme pendant deux heures à température ambiante. Lavez ensuite les billes trois fois avec 500 microlitres d'un tampon tris chlorhydrate à une molaire. À l'aide du support magnétique, les exosomes sont maintenant liés aux billes magnétiques pour préparer l'électrode.

Diluez d'abord les solutions mères du sonde, du chlorure de potassium et du monomère oléique dans de l'eau distillée. La sonde d'ADN biotinylée en extrémité 5' est spécifique de l'ARNm de GA DH. Mélangez la solution de sonde-monomère par vortexage.

Utilisez un réseau d'électrodes à 16 capteurs dans lequel chaque électrode unitaire comprend des électrodes de travail, contre-électrode et référence composées d'or nu. Placez un puits en plastique sur le réseau d'électrodes afin d'éviter toute contamination croisée des électrodes. Transférez 60 microlitres de la solution monomère de sonde à la surface d'une électrode en or de sorte que les électrodes de travail, contre-électrode et référence soient recouvertes par le liquide.

Appliquer un profil de champ électrique carré cyclique, appelé champ A-C-S-W-E, afin de polymériser électriquement un monomère sonde. Cela crée une couche de polymère conducteur sur la surface de l'électrode. Rincer le capteur trois fois avec de l'eau distillée, puis le sécher à l'aide d'azote gazeux pour éliminer le liquide présent sur la surface de l'électrode.

Après avoir préalablement recouvert l'électrode avec la sonde de capture, ajouter cinq microlitres d'une solution monomolaire de la sonde de détection à 495 microlitres de la solution complexe de billes et d'exosomes, puis mélanger par pipetage. La sonde est un amorce d'ADN conjuguée à la fluorescéine en position trois prime, spécifique de GA dh. Placer un réseau d'électrodes précodé au-dessus d'un réseau d'aimants composé de 16 aimants alignés avec les électrodes de travail du capteur.

Ensuite, transférez 60 microlitres de la solution d'exosomes liés aux billes vers la surface de l'électrode. Appliquez un champ A-C-S-W-E pendant 20 cycles. Le contenu exosomal libéré s'hybridera à la sonde située sur la surface de l'électrode.

Rincez la surface de l'électrode trois fois avec de l'eau distillée afin d'éliminer tout analyte non lié, puis séchez l'électrode à l'aide d'un flux de gaz azote. Ensuite, préparez une dilution au 1/1000 d'anticorps anti-fluorescéine conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dans du PBS contenant de la Caine. Ajoutez alors 60 microlitres de la dilution d'anticorps sur la surface de l'électrode.

Appliquer le champ A-C-S-W-E sur la surface de l'électrode afin de conjuguer l'anticorps anti-fluorescéine HRP à la sonde de détection. Rincer la surface du capteur trois fois avec de l'eau distillée pour éliminer l'excès d'anticorps, puis sécher l'électrode à l'aide d'azote gazeux. Ensuite, déposer 60 microlitres de substrat TMB sur chaque surface de capteur à l’aide d’une pipette multicanaux et mesurer le courant électrochimique à l’aide d’un potentiostat à –200 millivolts pendant 60 secondes.

Pour obtenir la lecture tric, la microscopie électronique en transmission a été utilisée afin de déterminer si des exosomes étaient liés aux billes magnétiques. Les granules de taille comprise entre 70 et 100 nanomètres attachés aux billes sont compatibles avec la taille connue des exosomes après lyse par le champ électrique ou par un détergent. Aucun exosome n'est visible à proximité des billes.

L'ARNm de GA DH dans les exosomes a été détecté par lecture atric. La quantité de GA DH présente diminue au fil du temps, comme prévu après la lyse des exosomes par un champ électrique ou un détergent, indiquant une exposition à l'environnement extravésiculaire de la salive. Efim a été utilisé pour mesurer la teneur en exosomes du sérum et de la salive de souris ayant reçu une injection de cellules humaines de cancer du poumon produisant un marqueur exosomal humain CD 63 GFP.

Après 20 jours, des taux plus élevés de CD63 GFP ont été observés à la fois dans le sérum et la salive des souris injectées avec les cellules cancéreuses, mais pas chez celles injectées avec la solution saline. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter de toucher les billes afin d’extraire une quantité adéquate de liquide lors du lavage des billes, de laver uniformément la surface de l’électrode et de charger correctement les régions sur l’électrode. Cette technologie, cette technologie efim, fournit la capacité critique non satisfaite permettant de comprendre comment une maladie systémique, un organe distant, peut libérer son information et de la quantifier au sein de cette entité appelée exosomes.

Comment ils pénètrent dans la salive, dans notre cavité buccale, et permettent de capturer les exosomes, de libérer ces cibles moléculaires, et de les détecter simultanément dans des maladies menaçantes telles que le diabète, le cancer du pancréas ou d'autres troubles potentiellement mortels. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'extraire rapidement des exosomes à partir d'un liquide biologique, de libérer le contenu des exosomes, et d'analyser rapidement leur contenu à l'aide d'un système d'électrodes intégré.