Name: Développement dinhibiteurs de interactions protéine-protéine REMPLACER travers: Application à la conception et les inhibiteurs de CDK concurrentiel développement non-ATP (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Découvrez la stratégie REPLACE pour convertir des inhibiteurs peptidiques en molécules de type médicament. Cette approche computationnelle et synthétique permet d'identifier des fragments alternatifs viables et d'établir des relations structure-activité pour les interactions protéine-protéine.

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Nous remercions Douglas Pittman et Michael Wyatt, Ph. D., pour leur aide avec la culture cellulaire, ainsi que le Dr Wyatt et Mme Erin Anderson pour leur aide dans la mise au point des tests de liaison. Nous remercions Mike Walla et Bill Cotham du Département de chimie et de biochimie de l’Université de Caroline du Sud pour leur aide en matière de spectrométrie de masse, ainsi que Helga Cohen et le Dr Perry Pellechia pour la spectrométrie RMN. Ce travail a été financé par les National Institutes of Health par le biais de la subvention de projet de recherche, 5R01CA131368.

1. Computational identification du potentiel à petites molécules des groupes de recouvrement Remarque: En principe, une variété de pharmacophores accueil ou méthodes de recherche peut être utilisé pour prédire les groupes de coiffage potentiels. Le but principal de calcul dans REMPLACER études est d&#39;identifier de petites molécules qui conservent les caractéristiques et les interactions des acides aminés qui sont substitués. <ol><li> Validation du protocole LigandFit d&#39;accueil 14 </li></ol> Remarque: Dans des études antérieures, la méthode d&#39;accueil (LigandFit 15, un module dans le moléculaire suite de programme de modélisation, Discovery Studio 3.0) a été validé afin d&#39;assurer que cet algorithme est suffisante pour reproduire les modes de liaison des Ncaps connu et de montrer que les résultats obtenus pour composés inconnus sont prédictive 14. <ol style="margin-left: 40px;"><li> En utilisant les étapes (1,2 - 1,5) suivants, identifier les paramètres optimaux pour LigandFit comme suit: en PLP1ergy grille pour la génération de pose, la minimisation des poses générées et la fonction de notation PLP1 pour l&#39;analyse des poses. </li><li> Afin de limiter les conformations obtenus et à positionner de manière appropriée ligands pour la formation de liaison covalente dans le peptide coiffé, d&#39;azote et de régler les atomes d&#39;azote d&#39;indole amide de Trp217 et Gln254 respectivement en tant que filtres d&#39;interaction pour une liaison hydrogène. </li><li> Conception et ancrer une bibliothèque d&#39;alternatives de fragments dans la CDK2 / cycline Un récepteur (2UUE). Prioriser les groupes de coiffage potentiels pour la synthèse et l&#39;approvisionnement commercial basé sur PLP1 notation, les interactions avec les filtres d&#39;interaction et de complémentarité avec la CBG. Les différentes étapes nécessaires à LigandFit accueil sont les suivantes. </li></ol><ol start="2"><li> Préparation du récepteur de site de liaison 14 <ol><li> Importez le CDK2 / cycline A structure cristalline (id pdb: 2UUE) dans une fenêtre de visualisation dans le logiciel. Cette structure contient les FLIP précédemment identifié 5-méthyl-1-phényl-1 H-1, 2,4-triazole-3-carboxamide (3,5-DCPT) FRVR lié à la rainure de la cycline (Figure 3). </li><li> Supprimer ou de garder en place les résidus FRVR (C-terminale). Quand la séquence du peptide est conservée, utiliser le groupe amino N-terminal du peptide en tant que filtre pour l&#39;interaction ligand. De les «interactions ligand-récepteur&quot; outils, de créer une sphère autour de la N-Cap 3,5-DCPT de Show / Hide place sphère. La sphère est créée pour définir la zone active dans le site de liaison où les interactions ligand-récepteur sont autorisés à se produire au cours de la liaison. </li><li> Définir le site de liaison plus loin de la &quot;trouver le site que le volume du ligand choisi&quot; et supprimer le ligand 3,5-DCPT de la protéine. Effectuer cette étape pour définir le volume de la liaison au sein de la sphère créée. </li><li> Set d&#39;azote et des atomes d&#39;azote d&#39;indole amide des résidus Trp217 et Gln254 que des filtres d&#39;interaction pour une liaison hydrogène. Réglez les filtres d&#39;interaction de sorte que seuls les poses qui porcelaineRact avec les atomes de résidus de consigne sera filtrée pendant le processus d&#39;accueil préservant ainsi des interactions importantes dans les poses amarrés. </li></ol></li><li> Préparation de ligands 14 <ol><li> Concevoir une bibliothèque de 100 groupes de coiffage potentiels sur la base de critères tels que la masse moléculaire inférieure à 500, la présence d&#39;un groupe carboxylate pour la ligature avec le peptide tronqué et l&#39;inclusion de groupes hydrophobes appropriés (groupe phényle substitué) de van der Waals interaction dans la poche secondaire, indiqué dans le tableau 1. </li><li> Sélectionner noyaux hétérocycliques pour mimer des interactions de liaison hydrogène avec le peptide et Trp217 substituants inclus pour remplacer les interactions ion-appariement de chaînes latérales basiques de l&#39;HAKRRLIF. Dock ligands que des molécules d&#39;aldéhyde respectifs de sorte que l&#39;oxygène du carbonyle peut interagir avec l&#39;atome d&#39;azote d&#39;amide Gln254 analogue à squelette peptidique dans le peptide parent (Tableau 1). </li><li> Avant docroi, minimiser ligands conçus pour une conformation à faible énergie et de préparer dans un état d&#39;ionisation appropriée en utilisant le protocole &quot;Préparer ligands&quot;. Dessiner et exporter ces N bouchons potentiels dans le format de fichier .sdf dans ChemDraw pour une feuille de calcul avant d&#39;être importés dans le logiciel. Note: Préparer protocole de ligands est utilisée pour minimiser tous les ligands d&#39;être amarré à leurs états d&#39;énergie les plus bas et les frais d&#39;ionisation ont été appliqués aux atomes applicables. Les paramètres par défaut sont utilisés pour cette étape. </li></ol></li><li> Accueil des ligands dans la cycline A Groove 14 <ol><li> Sélectionnez la routine LigandFit de récepteur-ligand protocole de interactions ensemble du logiciel. Utilisation du récepteur et les ligands préparé comme entrée pour ce protocole. </li><li> Pour ces essais, sélectionnez PLP1 comme grille de l&#39;énergie, précisent que pose l&#39;énergie soit réduit au minimum et que le nombre de poses générés 10. Laissez tous les autres paramètres, les valeurs par défaut. Remarque: LigandFit estun procédé d&#39;ancrage qui permet d&#39;identifier et de générer des poses de grande affinité et complémentarité potentiel avec le site actif d&#39;une protéine en utilisant un filtre de comparaison de forme à base qui est combinée avec une recherche de Monte Carlo algorithme de conformation. La grille de l&#39;énergie utilisée par le programme d&#39;accueil est le domaine pour générer interactions ligand-récepteur et les poses potentiels vigueur. PLP1 potentiel est linéaire par morceaux qui privilégie en particulier des interactions de liaison hydrogène et où le type de PLP atome est attribué pour chaque atome de ligand non hydrogène ou un atome non-hydrogène du récepteur. </li></ol></li><li> Analyse des résultats <ol><li> Dans le premier cas, l&#39;affichage pose dans le programme de visualiseur puis trier par ordre décroissant des valeurs de la partition PLP1. Utiliser des fonctions telles que la notation PLP1 pour estimer l&#39;affinité de liaison d&#39;un ligand à base d&#39;un quai ligand candidat pose géométrie et de l&#39;interaction non covalente avec la structure de récepteur cible. Remarque: Ici, la fonction PLP1 de notation a été trouvé à give les meilleurs résultats car il comprend une estimation de la liaison hydrogène. </li><li> Analyser visuellement le top 25% des poses marqués pour 1) superposabilité avec le groupe de coiffage connu (ayant un rapport écart quadratique moyen (RMSD) valeur inférieure à 2 a), 2) remplie filtres d&#39;interaction et 3) la complémentarité visuel avec la rainure de la cycline . Il est admis que dans une pose amarré correctement (par rapport à une structure expérimentale) a une valeur RMSD de &lt;2 Å. </li><li> Examinez poses pour complémentarité visuelle, qui est défini comme ayant un remplissage efficace de la poche de liaison d&#39;une manière qui soit compatible avec les relations structure-activité connue. Les filtres d&#39;interaction sont définis pour inclure des restrictions d&#39;atomes qui nécessitent contacts intermoléculaires connues pour être essentielles pour la liaison et / ou sont nécessaires pour positionner le groupe de coiffage potentiel dans la géométrie correcte pour la formation de liaisons amide. Trois exemples de poses amarrés des groupes N coiffage potentiels faisant des liaisons hydrogène avec INTERACTIONSn filtres sont représentés sur la figure 4. </li></ol></li></ol> 2. synthèse et la caractérisation de N -capping Groupes potentiels <ol start="1"><li> Synthèse de N groupes de coiffage. </li><li> Pour la synthèse, utiliser tous les commerciaux à partir des matériaux, des solvants et des réactifs obtenue. Synthétiser groupes potentiels de N-coiffage en chimie organique de synthèse classique (Figure 5 12,13 pour un exemple). </li><li> Effectuer la Chromatographie sur couche mince (CCM) sur gel de silice pour des réactions de contrôle. <ol><li> On dissout le produit de départ et le mélange de réaction (1 mg) dans la phase mobile et les repérer sur la plaque de CCM en utilisant des tubes capillaires. </li><li> Placer la plaque de CCM dans la chambre de réception de phase mobile (l&#39;acétate d&#39;éthyle et d&#39;hexane dans un rapport 35:65). Une fois la phase mobile atteint 90% de la plaque de CCM, enlever et sécher à l&#39;air de la plaque. </li><li> Utilisez la lumière UV pour détecter les matériels et de réaction à partir des mélanges comme des taches visibles. Calculer la R f de tous les spots (rapport de la distance parcourue par la place et la phase mobile). Remarque: La réaction est terminée lorsqu&#39;il n&#39;y a pas lieu vu au Rf du produit de départ. </li></ol></li><li> Après l&#39;achèvement de la réaction travailler jusqu&#39;à le mélange de réaction en le plaçant dans un entonnoir de séparation et de lavage avec un acide aqueux ou d&#39;une solution de base selon le cas. Recueillir le solvant organique, évaporer dans un évaporateur rotatif et sécher le produit brut obtenu sous vide. </li><li> Dissoudre 500 mg de produit brut dans 3-5 ml de solvant approprié et ajouter à un 1 g de silice ou RP18 samplet et sécher sous air. Placez le samplet contenant le produit brut dans les / RP SNAP cartouches flash de silice et de purifier le matériau brut par Chromatographie flash haute performance automatisée (selon le protocole du fabricant) employant une colonne SNAP 100 g avec une course de gradient à partir de l&#39;acétate d&#39;éthyle 6%: 94 % d&#39;hexanes à acétate d&#39;éthyle à 50% et plus de 50% d&#39;hexanes15 volumes de colonne. </li><li> Sécher le produit purifié recueilli dans un solvant de Chromatographie éclair en utilisant un évaporateur rotatif par évaporation tout le solvant à sec et encore sécher le produit sous vide pour éliminer tous les solvants résiduels. Effectuer la caractérisation du produit purifié par RMN, MS et HPLC analytique. <ol><li> Pour RMN 1 H et 13 C RMN, peser environ 10 mg de l&#39;échantillon purifié, la dissoudre dans un solvant deutéré approprié, et transférer le contenu d&#39;un tube de RMN à sec pour enregistrer le spectre RMN 2,14. </li><li> Enregistrez la RMN 1 H et 13 spectres RMN C avec un champ haute spectromètre de RMN (minimum 300 MHz). Acquérir les spectres de masse en utilisant un QTOF (Tandem quadruple 1 heure de spectromètre de masse de vol), ionisation par électronébulisation (ESI) ou VG 70S (double focalisation spectromètre de masse à secteur magnétique, EI) 2,14. </li><li> Analyser la pureté des produits par CLHP avec un détecteur à barrettes de diodes et équipé avecC18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 um colonne pour analyse. Utilisez un terme de gradient à partir de 100% de l&#39;eau (acide trifluoroacétique à 0,1%) à 60% d&#39;acétonitrile (de l&#39;acide trifluoroacétique à 0,1%) de plus de 30 min et maintenir le gradient pendant 4 min. Extraire les chromatogrammes à 226 et 254 nm 2,14. Remarque: puretés analytiques des composés évalués étaient&gt; 95%. </li></ol></li></ol> 3. La synthèse en phase solide pour la génération de flips 2 <ol start="1"><li> Synthèse de flips de N-capped <ol><li> Assemblez composés peptidiques N-plafonnés par des méthodes de synthèse en phase solide standard en utilisant les étapes suivantes. <ol><li> Activer 5 équivalents de l&#39;acide aminé C-terminal (Fmoc-Phe) dans 4,4 équivalents d&#39;O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; tétraméthyl-uronium-hexafluoro-phosphate (HBTU, 221,93 mg) dans 2 ml de DMF pendant 5 min. Chargez le mélange HBTU Fmoc-Phe sur la résine Rink utilisant 6 équivalents de diisopropyléthylamine (DIPEA, 103.13mg) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Éliminer le groupe protecteur Fmoc du résidu C-terminal en utilisant 20% de pipéridine dans 3 ml de DMF pendant 10 min. Couple acides aminés ultérieurs (par exemple, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC), étape par étape. A chaque étape, deux 5 équivalents de l&#39;acide aminé suivant en utilisant 6 équivalents de DIPEA (103,13 mg) et 4,4 équivalents de HBTU (221,93 mg) dans 2 ml de DMF pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Appliquer cycles de lavage (5 x 10 ml de DMF + 5 x 10 ml de DCM) après couplage d&#39;acides aminés et de déprotection Fmoc étapes décrites ci-dessus. Après l&#39;assemblage d&#39;un peptide, ou deux groupes en utilisant 6 équivalents de DIPEA (103,13 mg) et 4,4 équivalents de HBTU (221,93 mg) de N-coiffage dans 2 ml de DMF pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> À l&#39;issue de l&#39;ensemble de peptide, traiter le mélange de réaction avec 2 ml de mélange de clivage (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N pour supprimer protecteurs de chaîne latérale des groupes, et clivent flips de la résine. Triturer le produit résultant avec de l&#39;éther diéthylique froid pour précipiter et if nécessaire concentré dans un évaporateur rotatif. </li></ol></li></ol></li><li> Synthèse de flips coiffe N-C-plafonnés <ol><li> Peser et dissoudre le peptide Arg-Leu-terminal coiffé N et protégé (16,1 mg, 0,02 mmol) dans du dichlorométhane et ajouter [4- (3-chlorophénoxy) pyridin-2-yl] méthanamine (C-CAP) avec O - benzotriazole N, N, N &#39;, N&#39; tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HBTU, 16,7 mg, 0,02 mmol) et de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol). </li><li> Agiter et surveiller la réaction à la température ambiante jusqu&#39;à ce qu&#39;une CCM / HPLC indique la consommation complète du matériau de départ. Après l&#39;achèvement de la réaction, on concentre le mélange réactionnel brut en utilisant un évaporateur rotatif, puis on sépare l&#39;acétate d&#39;éthyle et de l&#39;eau. </li><li> Séparer la phase aqueuse et la couche organique; laver la couche organique avec du NaOH 1 N, du HCl 1 N et de la saumure. Sécher la couche organique avec environ 1 g de sulfate de sodium et on concentre le produit dans un évaporateur rotatif. Finally traiter le produit O / N avec le mélange de clivage (95: 2,5: 2,5 acide trifluoroacétique / H 2 O / TIPS) pour la déprotection. </li><li> Triturer le produit résultant avec de l&#39;éther diéthylique froid et, si nécessaire, concentré dans un évaporateur rotatif jusqu&#39;à siccité complète afin d&#39;éliminer tout le solvant. En outre sécher le produit sous vide pour éliminer tous les solvants résiduels. </li></ol></li><li> Purification et la caractérisation de flips <ol><li> Purifier FLIP brut en utilisant des méthodes semi-HPLC préparative en phase inverse. Lyophiliser les FLIP purifiées et de caractériser leur masse moléculaire en utilisant la spectrométrie de masse 2,14. </li><li> Déterminer la pureté analytique des FLIP par HPLC avec un détecteur à barrettes de diodes et équipé d&#39;un C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 um colonne. Utilisation d&#39;une méthode de gradient à partir de 95% de H 2 O (acide trifluoroacétique à 0,1%) / 5% d&#39;acétonitrile (acide trifluoroacétique à 0,1%) à 35% de H 2 O (acide trifluoroacétique à 0,1%) / 65% d&#39;acétonitrile (0,1% trifluoroacel&#39;acide tic) sur 30 min et détiennent le gradient pendant 4 min. Extrait chromatogrammes à 226 et 254 nm. </li></ol></li></ol> 4. polarisation de fluorescence Essai de liaison pour la détermination de la liaison compétitive 2,14 <ol start="1"><li> Effectuez le test en noir 384 puits (138 pl) plaques en utilisant la procédure suivante. </li><li> Diluer les échantillons, des peptides traceurs (4 nM) et des complexes de kinase (CDK2 / cycline A - 18 ug / ml, CDK4 / cycline D - 37 ug / ml) aux concentrations nécessaires dans le tampon de dosage (HEPES 25 mM pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% de Nonidet P-40, 1 mM de dithiothréitol (DTT). </li><li> Pour chaque puits de la plaque de 384 puits, ajouter: 5 pi de CDK4D1 ou CDK2CA (0,3 pg / puits purifiée complexe humain recombinant de kinase), solution de composé de 5 pi, 5 pi de 30 nM peptide traceur (fluorescéinyle Ahx-Pro-Val Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly-fluorescéinyle ou Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly peptide traceur). Utiliser 5 pi de chaque DMSO (6%), buffer, traceur et 5 pi de DMSO (6%), le complexe de kinase, comme traceur puits témoins </li><li> Après l&#39;addition des tous les composants, centrifuger la plaque à 500 tours par minute pendant 1 min (41.16 XG) à température ambiante et ensuite incuber la plaque avec agitation pendant 45 min à température ambiante. En utilisant un lecteur de plaque multimode et un détecteur équipé 485 nm / 535 nm excitation / filtres d&#39;émission et un miroir dichroïque lire l&#39;intensité fluorescéine de chaque puits de la plaque. </li><li> Calculer la polarisation moyenne relative (mp) pour tous les échantillons d&#39;essai en utilisant l&#39;équation ci-dessous montre. Déterminer les valeurs IC50 par régression logarithmique en corrélant les députés et les tests relatifs concentrations. </li></ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

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<li>Yin, H., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+targeting+protein-protein+interactions+with+synthetic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le ciblage des interactions protéine-protéine (IPP) dans la découverte de médicaments est très difficile, car celles-ci impliquent généralement une grande interface de contact peu profonde composée de contacts nombreux et diffus19. De plus, les composés peptidiques qui inhibent les IPP qui se prêtent à la découverte de médicaments sont problématiques en raison de leur masse moléculaire plus élevée, de leur instabilité métabolique et de leur faible biodisponibilité20. Les stratégies actuelles qui ont...

Dans cet article, une étude de l&#39;application de la REPLACE (remplacement par des alternatives ligand partielle à l&#39;aide de calcul enrichissement) stratégie visant à convertir des inhibiteurs peptidiques de interactions protéine-protéine en plus de molécules pharmaceutiquement pertinents cas est décrit 1-3. Bien que les IPP représentent une source de cibles potentielles de médicaments, mais sous-exploité riche, méthodologies existantes sont largement insuffisants pour faire de ces largement accessible. Les stratégies actuelles, y compris fragment conception basée sur 4, criblage à haut débit 5 et 6 peptides agrafées ont apporté des progrès, mais ceux-ci sont dans de nombreux cas inefficaces. En conséquence, davantage de progrès et des approches plus efficaces sont nécessaires. REPLACE a été entièrement validée dans le développement d&#39;inhibiteurs de kinases qui ont des propriétés améliorées de drug-like et qui ont un potentiel de développement en tant qu&#39;agents thérapeutiques anti-tumorales. Cette stratégie est illustrée dans le développement d&#39;inhibiteurs non-ATP de cellulesCDK de cycle et implique comme suit: 1) l&#39;obtention d&#39;informations structurelles 3D sur les interactions de HAKRRLIF / RRLIF sillon de liaison avec la cycline; 2) déterminer les déterminants de liaison importants pour l&#39;interaction peptidique; 3) la troncature du peptide N-terminale contenant un ou plusieurs déterminants de liaison; 4) l&#39;identification de calcul de potentiels de petites molécules variantes alternatives (ligands partiels, PLA) pour la partie tronquée du peptide et qui conservent les interactions clés du peptide parent; 5) la synthèse ou l&#39;approvisionnement commercial de PLA prédits se lier avidement avec le sous-site précédemment occupée par le résidu (s) peptidique est supprimé; 6) synthèse de feuillette ligature des meilleurs PLA au peptide tronqué en utilisant une synthèse en phase solide; 7) Les essais de culbutes dans un liant in vitro ou un dosage fonctionnel (polarisation de fluorescence dans le contexte / cycline CDK), suivie d&#39;une caractérisation plus poussée dans un essai de viabilité des cellules. Une représentation schématique de REMPLACER stratégy est montré dans la figure 1. Dans cet article, itérations de la stratégie REPLACE sont discutés et l&#39;application de CDK2 / cycline A décrit en détail. CDK sont soupçonnés d&#39;être directement ou indirectement déréglementé dans la majorité des tumeurs et sont donc considérés cancer appropriée cibles médicamenteuses 7. CDK nécessite association avec cyclines pour l&#39;activation complète et phosphorylent ensuite protéines clés impliquées dans la régulation du cycle cellulaire 8. Les deux principaux groupes de CDK sont les isotypes et qui éliminent les points de contrôle du cycle cellulaire [G1 / S (CDK4 / cycline D, CDK6 / cycline D et CDK4 / cycline E), la phase S (CDK2 / cycline A) et G2 / M (CDK1 / cycline B)] et les régulateurs de l&#39;ARN polymérase par phosphorylation (CDK7 / cycline H, CDK8 / cycline C, CDK9 / cycline T). Une étape clé dans la progression de la phase S se produit lorsque le facteur de transcription E2F1 forme un complexe avec la protéine DP qui se lie ensuite à l&#39;ADN et initie la transcription du gène. CDK2 / cycline A est nécessaire pour neutraliser la transcription E2F1activité à travers la phosphorylation conduisant ainsi à libérer du complexe E2F1-DP et sa dégradation ultérieure. L&#39;inhibition de CDK2 / cycline A est censé maintenir E2F1 dans son état ADN lié à l&#39;activation persistante conduisant. Le niveau résultant de l&#39;E2F-1 l&#39;activité dépassera le seuil nécessaire pour induire l&#39;apoptose p53 indépendante suggérant donc une stratégie thérapeutique. En raison de p53 et dérégulé voies pRb, des niveaux élevés de l&#39;E2F-1 se produisent fréquemment dans les cellules cancéreuses et l&#39;inhibition de la CDK2 / cycline A doit conduire à l&#39;apoptose sélective dans les tumeurs et peut être considéré comme une cible de cancer validée 7. Cliniquement inhibiteurs de CDK étudiés ciblent le site hautement conservée ATP liaison menant à traverser la réactivité parmi les plus de 500 protéines kinases dans le kinome humaine et qui pourrait donner lieu à des effets et de la toxicité 9 Side. Une autre approche est non-ATP inhibition compétitive en ciblant le recrutement de substrat à travers la CBGprésent sur ​​la cycline sous-unité régulatrice positive et qui est donc distincte et distante de l&#39;ATP site de liaison 10,11. Le CBG est principalement hydrophobe présente une rainure dans la cycline A, la cycline D et la cycline E et a été montré pour reconnaître une séquence consensus trouvée dans les substrats et des suppresseurs de tumeurs. Comme un peptide isolé, le motif de liaison de la cycline (CBM) se lie à la CBG et a été montré pour inhiber l&#39;activité de kinase de CDK du cycle cellulaire. Le CBM a été optimisé pour un octapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / cycline A IC 50 de 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / cycline D, IC 50 de 0,88 ± 0,34 M) et, en outre tronquée à un pentapeptide qui représente un bon compromis entre le poids moléculaire de la drogue la ressemblance et de la puissance (RRLIF, CDK2 / cycline A IC 50 de 1,01 ± 0,17 uM, CDK4 / cycline D, IC 50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. Les GBC composent d&#39;une grande primaire et secondaire plus petite poche hydrophobe qui sont comblé par une acidic région (comprend Glu220, Glu224 et Asp283). Les déterminants de liaison clés de HAKRRLIF comprennent l&#39;interaction de Ala2 avec les liaisons poche hydrophobe secondaire, appariement d&#39;ions et d&#39;hydrogène de Lys3, Arg 4 et arg5 avec la région acide et un degré élevé de complémentarité de Leu6 et Phe8 avec le site lipophile primaire. En outre, de nombreuses liaisons hydrogène sont contribué au squelette du peptide tandis Ile7 agit comme un résidu d&#39;écartement permettant un contact optimal avec la poche primaire. Le mode de fixation et les interactions des HAKRRLIF avec CBG est montré dans la figure 2. Cibler le CBM / CBG interaction protéine-protéine inhibe l&#39;activité kinase de CDK2 de / cycline A, CDK2 / cycline E et CDK4 / cycline D, ce qui devrait déclencher l&#39;apoptose à médiation par E2F1 des cellules cancéreuses sans affecter les cellules normales 7. Bien que CBM peptides dérivés sont des inhibiteurs efficaces de CDK du cycle cellulaire, il est peu probable qu&#39;ils soient utiles comme médicaments en raison de leur métabolismel&#39;instabilité et le manque général de la perméabilité cellulaire. À cette fin, nous avons appliqué la stratégie REPLACE afin de convertir ces inhibiteurs peptidiques puissants dans plusieurs composés de drogues pour la poursuite du développement de produits thérapeutiques anti-tumorales exploitant E2F1 déréglementé travers CDK2 / cycline A inhibition. Le protocole suivant résume travail qui a été accompli dans l&#39;application de REPLACE à la gorge de la cycline. Dans le premier cas, le remplacement des groupes de plafonnement des drogues pour le tétrapeptide N-terminale de HAKRRLIF ont été identifiés. En outre des améliorations dans ces groupes ont été étudiés dans une étude de validation supplémentaire pour REPLACE. Les résultats représentatifs de ces études sont également présentés.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Computational Chemistry</td></tr><tr><td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex Workstations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Synthetic Organic Chemistry</td></tr><tr><td colspan="4">Gel de silice (plaques GF-254) pour TLC, Biotage (Uppsala, Suède) pour la chromatographie flash, Waters Alliance 2695 HPLC avec un 2996 détecteur à barrettes de diodes et équipé d’un C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5&nbsp ; &mu ; m (Phenomenox Luna) pour la détermination de la pureté, les spectres RMN 1H et 13C ont été enregistrés avec un spectromètre Varian Mercury 300 et 400, respectivement. Les spectres de masse ont été mesurés à l’aide d’un spectromètre de masse à temps de vol en tandem quadruple-1, d’un spectromètre de masse par ionisation par électronébulisation (ESI) et d’un spectromètre de masse à secteur magnétique à double focale, EI.</td></tr><tr><td colspan="4">Flourescence Polarization Assay</td></tr><tr><td>384 plaques micro-puits, Micro pipettes</td><td>Grenier Bio-one</td><td>110256602</td><td></td></tr><tr><td>CDK4D1 et CDK2CA (complexe de kinase humaine recombinante bien purifiée)</td><td>BPS Bio Sciences</td><td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01 % Nonidet P-40, 1&nbsp ; mM dithiothrétiol (DTT))</td></tr><tr><td>25 nM HEPES</td><td>CALBIOCHEM</td><td></td><td></td></tr> 375368 <tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>127838</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Aldrich-70</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&#176 ; C congélateur</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTX880 détecteur multimode équipé de 485&nbsp ; nm/535&nbsp ; nm filtres d’excitation/émission et un miroir dichroïque adapté à la fluorescéine</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>96 plaques de puits</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stock congelé de lignées cellulaires U2OS (ostéosarcome) et DU145 (cancer de la prostate)</td> Sérum <td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU, milieux DMEM, trypsine, PEN/STRIP, réactif</td> <td>MTTFisher, Technologie du vivant, Héamocytomètre Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR-70</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&#176 ; C congélateur</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Thermo electron corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Réfrigérateur 4-8 &#176 ; C</td><td>Isotemp Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTX880 détecteur multimode équipé de 595&nbsp ; nm filter</td><td>Beckman Coulter, Brea, Californie</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

développement d&#39;inhibiteurs de interactions protéine-protéine remplacer travers: application à la conception et les inhibiteurs de cdk concurrentiel développement non-atp

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE est une stratégie unique développé pour cibler plus efficacement les interactions protéine-protéine (IPP). Il vise à élargir l&#39;espace disponible de médicament cible en fournissant une meilleure méthodologie pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de ces sites de liaison et qui représentent la majorité des cibles potentielles de médicaments. L&#39;objectif principal de ce document est de fournir un aperçu de la méthodologie de l&#39;utilisation et l&#39;application de la stratégie REMPLACER qui implique des approches de calculs de chimie et synthétiques. REPLACE est illustré par son application au développement de kinases cycline non-ATP concurrentiel dépendantes (CDK) inhibiteurs comme agents thérapeutiques anti-tumorales. CDK sont souvent déréglementés dans le cancer et sont donc considérés comme des cibles importantes pour le développement de médicaments. L&#39;inhibition de la CDK2 / cycline A dans la phase S a été rapporté à favoriser l&#39;apoptose sélective des cellules cancéreuses de manière indépendante de p53 par la voie de E2F1. Le ciblage interaction protéine-protéine à la cycline binding rainure (GBC) est une approche qui permettra à l&#39;inhibition spécifique du cycle cellulaire sur CDK transcription. La CBG est reconnu par une séquence consensus dérivée à partir de substrats de CDK et des protéines suppresseurs de tumeur appelé le motif de liaison (CBM) cycline. Le CBM a déjà été optimisé pour un octapeptide de p21Waf (HAKRRIF), puis encore tronqué à un pentapeptide conservant une activité suffisante (RRLIF). Peptides en général ne sont pas cellule perméable, sont métaboliquement instable et donc la REPLACE (remplacement partiel avec Ligand Alternatives travers Computational enrichissement) stratégie a été appliquée afin de générer plusieurs inhibiteurs de drug-like. La stratégie commence avec la conception du fragment ligaturé peptides inhibiteurs (de flips) qui inhibent sélectivement cycle cellulaire des complexes CDK / cycline. FLIP ont été générés par le remplacement itérative résidus de HAKRRLIF / RRLIF avec le fragment comme de petites molécules (groupes de recouvrement), à partir de l&#39;extrémité N-terminale (Ncaps), suivis par le remplacement surl&#39;extrémité C-terminale. Ces composés sont des points de départ pour la production d&#39;inhibiteurs de CDK non compétitifs de l&#39;ATP comme agents thérapeutiques anti-tumorales.

Les interactions de HAKRRLIF avec la rainure de la cycline sont présentés sur la figure 2. Les résidus peptidiques qui représentent les principaux déterminants de liaison comprennent Ala2, Arg4, Leu6 et Phe8 par d&#39;autres résidus de fournir des contributions de plus petites 12,13,18. Dans cette étude de cas la stratégie REPLACE a été utilisée dans le but de trouver des alternatives fragments pour les résidus dans le tétrapeptide N-terminale de HAKRRLIF, imitant principalem...

Nous décrivons la mise en œuvre de la stratégie REPLACE pour cibler les interactions protéine-protéine. REPLACE est une stratégie itérative impliquant des approches synthétiques et computationnelles pour la conversion d’inhibiteurs peptidiques optimisés en molécules de type médicament.

Développement d&#39;inhibiteurs de interactions protéine-protéine REMPLACER travers: Application à la conception et les inhibiteurs de CDK concurrentiel développement non-ATP

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

L’objectif global de la stratégie est de générer une thérapie efficace de type médicament à petite molécule par conversion d’un inhibiteur peptidique d’une interaction protéine-protéine. Ceci est réalisé en établissant une relation structure-activité pour l’interaction peptidique souhaitée afin de comprendre quelles parties peuvent être efficacement remplacées dans un deuxième temps. La chimie computationnelle est utilisée pour identifier des alternatives viables de fragments pour les déterminants peptidiques connus, qui peuvent ensuite être utilisés pour synthétiser une bibliothèque d’hybrides de peptides fragmentaires.Ensuite, une bibliothèque d’hybrides est synthétisée entre ces fragments et le peptide tronqué afin de générer des molécules qui peuvent être testées dans un test in vitro pour identifier les molécules qui ressemblent davantage à des médicaments et qui récapitulent l’activité du peptide natif. Les résultats montrent que d’autres composés similaires à des médicaments peuvent être identifiés à l’aide de la méthodologie, ce qui représente des points de départ efficaces pour la découverte de médicaments inhibiteurs des interactions protéine-protéine. Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le criblage à haut débit est que la traction des protéines est extrêmement difficile du point de vue de la découverte de médicaments, et que les méthodes conventionnelles ne fonctionnent pas bien.La stratégie de remplacement implique une approche itérative par étapes et peut donc prendre plus de temps ou est plus susceptible d’être efficace à long terme. Aujourd’hui, je vais faire moi-même la démonstration de la plupart des procédures avec l’aide de mon associée, le Dr Sandra Craig, qui mettra en place certaines des réactions et des procédures. Commencer cette procédure par la validation du protocole d’amarrage, suivie de la préparation du site de liaison du récepteur et des ligands comme décrit dans le protocole textuel pour arrimer les ligands dans la cycline un sillon.Tout d’abord, sélectionnez la routine d’ajustement du ligand dans le protocole d’interactions entre les ligands du récepteur défini dans le logiciel, utilisez le récepteur et les ligands préparés comme entrée pour ce protocole. Pour ces trajets, sélectionnez PLP un comme réseau d’énergie. La grille d’énergie utilisée par le programme d’amarrage est le champ de force pour générer des interactions ligand-récepteur et des poses potentielles.Plp one est un potentiel linéaire de paix, qui privilégie spécifiquement les interactions de liaison hydrogène. Spécifiez que les poses doivent être réduites à l’énergie et que le nombre de poses générées est de 10. Laissez tous les autres paramètres aux valeurs par défaut en premier lieu.Affichez les poses dans le programme de visualisation, puis triez par valeurs décroissantes du score PLP un. Utilisez des fonctions de scoring telles que plp, one pour estimer l’affinité de liaison d’un ligand amarré en fonction d’une pose de ligand candidat, de la géométrie et de l’interaction non covalente avec la structure du récepteur cible. Analysez visuellement les 25 % des poses les plus marquées pour détecter la super impossibilité avec le groupe de capping connu.Observez également si la pose a rempli des filtres d’interaction, qui sont réglés pour inclure des contraintes d’atomes qui nécessitent des contacts intermoléculaires connus pour être critiques pour la liaison et ou sont nécessaires pour positionner le groupe de coiffage potentiel dans la géométrie correcte pour la formation de la liaison amide. Enfin, examinez les poses pour la complémentarité visuelle, qui est définie comme un remplissage efficace de la poche de liaison d’une manière cohérente avec l’activité de la structure connue. Relations pour la synthèse des groupes de coiffage d’extrémité, utiliser tous les matériaux de départ, solvants et réactifs commerciaux et synthétiser par chimie organique synthétique conventionnelle.Effectuez une chromatographie sur couche mince ou CCM sur gel de silice pour surveiller les réactions en dissolvant d’abord le matériau de départ et le mélange réactionnel dans la phase mobile. Repérez ensuite le matériau de départ dissous et le mélange réactionnel sur la plaque CCM à l’aide de tubes capillaires. Placez la plaque CCM dans la chambre contenant la phase mobile.Une fois que la phase mobile atteint 90 % de la plaque TLC, retirez et faites sécher la plaque à l’air. Utilisez la lumière UV pour détecter le matériau de départ et les mélanges réactionnels comme des points visibles. Calculez ensuite le RF de chaque spot, qui est le rapport entre la distance parcourue par le spot et la phase mobile.Ensuite, placez le mélange réactionnel dans un entonnoir séparateur et lavez-le avec de l’acide aqueux ou une solution de base selon le cas. Récupérez le solvant organique et évaporez-le dans un évaporateur rotatif avant le séchage. Le produit brut obtenu sous vide, dissoudre 500 milligrammes de produit brut dans trois à cinq millilitres de solvant approprié et ajouté à un échantillon de silice ou de RP 18 avant de sécher à l’air, placer un échantillon contenant le produit brut dans de la silice, des cartouches à pression en phase inversée.Purifier le matériau brut à l’aide de la chromatographie flash automatisée à haute performance. Utilisation d’une colonne instantanée de 100 grammes avec un dégradé. Parcourez 15 volumes de colonnes.Sécher le produit purifié recueilli dans le solvant par chromatographie flash à l’aide d’un évaporateur rotatif en évaporant tout le solvant jusqu’à ce qu’il soit sec. Ensuite, séchez davantage le produit sous vide pour éliminer tous les solvants résiduels. Effectuer la caractérisation du produit purifié par RMN, MS et HPLC analytique comme décrit dans le protocole textuel pour synthétiser des fragments d’extrémité, des peptides inhibiteurs ligaturés ou des retournements d’assemblage.Composés peptiques finis grâce à des méthodes standard de synthèse en phase solide. Activez cinq équivalents de l’acide aminé C terminal dans 4,4 équivalents de HBTU dans deux millilitres de DIMÉTHYLFORMAMIDE ou DMF pendant cinq minutes. Chargez le mélange sur la résine de patinoire en utilisant six équivalents de di isopropyléthylamine pendant une heure à température ambiante.Retirez le groupe de protection FM du résidu de la borne C en utilisant 20 % d’INE dans trois millilitres de DMF pendant 10 minutes. Couplez les acides aminés suivants étape par étape à chaque étape. Couplez cinq équivalents de l’acide aminé suivant à l’aide de six équivalents d’isopropyle DI, d’éthylamine et de 4,4 équivalents de HBTU dans deux millilitres de DMF pendant une heure.À température ambiante, appliquez les cycles de lavage après le couplage des acides aminés et les étapes de protection FM D après l’assemblage des peptides. Couplez les groupes de recouvrement N à l’aide de six équivalents d’isopropyle DI, d’éthylamine et de 4,4 équivalents de HBTU dans deux millilitres de DMF pendant une heure à température ambiante une fois l’assemblage des peptides terminé. Traitez le mélange réactionnel avec deux millilitres du mélange de clivage pendant la nuit pour éliminer les groupes protecteurs de la chaîne latérale et Cleve retourne la résine pour tritter le produit résultant avec de l’éther dathylique froid pour précipiter et si nécessaire, concentrer dans un filtre à évaporateur rotatif le solide résultant et sécher sous vide ou lyophiliser à l’aide d’un lyophilisateur.À ce stade, passez à l’essai de liaison par polarisation de fluorescence tel que décrit dans le protocole textuel pour la détermination de la liaison compétitive. La structure du modèle H-A-K-R-R-L-I-F liée à la rainure de liaison du cyclone est illustrée. Le sillon cycliste se compose de deux poches hydrophobes, une poche primaire plus grande et une poche secondaire plus petite, qui sont comblées par des résidus acides représentés en rouge.D’autres interactions importantes comprennent les contacts de liaison hydrogène du squelette peptidique et les interactions d’appariement ionique des trois résidus de base du peptide ici, le mode de liaison de trois cinq D-C-P-T-R-L-I-F est montré, affiché avec des interactions de liaison hydrogène avec les atomes de la chaîne latérale du tryptophane deux 17 et de la glutamine 2 54 amarrés. Des poses de trois groupes représentatifs et de coiffe sont montrées, chacun de ces composés possédant des liaisons hydrogène avec les atomes filtres d’interaction du tryptophane deux 17 et de la glutamine 2 54. Comme le montrent les lignes pointillées vertes, le fenouil subsistant fait les interactions du mur de Vander avec la poche hydrophobe secondaire.Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une meilleure compréhension de la façon d’effectuer et d’appliquer la stratégie de remplacement, en convertissant un inhibiteur peptidique connu en une molécule plus proche d’un médicament, qui inhibe la traction d’une protéine protéique, et constitue un point de départ pour le développement thérapeutique.

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