Développement d'inhibiteurs de interactions protéine-protéine REMPLACER travers: Application à la conception et les inhibiteurs de CDK concurrentiel développement non-ATP

L’objectif global de la stratégie est de générer une thérapie efficace de type médicament à petite molécule par conversion d’un inhibiteur peptidique d’une interaction protéine-protéine. Ceci est réalisé en établissant une relation structure-activité pour l’interaction peptidique souhaitée afin de comprendre quelles parties peuvent être efficacement remplacées dans un deuxième temps. La chimie computationnelle est utilisée pour identifier des alternatives viables de fragments pour les déterminants peptidiques connus, qui peuvent ensuite être utilisés pour synthétiser une bibliothèque d’hybrides de peptides fragmentaires.

Ensuite, une bibliothèque d’hybrides est synthétisée entre ces fragments et le peptide tronqué afin de générer des molécules qui peuvent être testées dans un test in vitro pour identifier les molécules qui ressemblent davantage à des médicaments et qui récapitulent l’activité du peptide natif. Les résultats montrent que d’autres composés similaires à des médicaments peuvent être identifiés à l’aide de la méthodologie, ce qui représente des points de départ efficaces pour la découverte de médicaments inhibiteurs des interactions protéine-protéine. Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le criblage à haut débit est que la traction des protéines est extrêmement difficile du point de vue de la découverte de médicaments, et que les méthodes conventionnelles ne fonctionnent pas bien.

La stratégie de remplacement implique une approche itérative par étapes et peut donc prendre plus de temps ou est plus susceptible d’être efficace à long terme. Aujourd’hui, je vais faire moi-même la démonstration de la plupart des procédures avec l’aide de mon associée, le Dr Sandra Craig, qui mettra en place certaines des réactions et des procédures. Commencer cette procédure par la validation du protocole d’amarrage, suivie de la préparation du site de liaison du récepteur et des ligands comme décrit dans le protocole textuel pour arrimer les ligands dans la cycline un sillon.

Tout d’abord, sélectionnez la routine d’ajustement du ligand dans le protocole d’interactions entre les ligands du récepteur défini dans le logiciel, utilisez le récepteur et les ligands préparés comme entrée pour ce protocole. Pour ces trajets, sélectionnez PLP un comme réseau d’énergie. La grille d’énergie utilisée par le programme d’amarrage est le champ de force pour générer des interactions ligand-récepteur et des poses potentielles.

Plp one est un potentiel linéaire de paix, qui privilégie spécifiquement les interactions de liaison hydrogène. Spécifiez que les poses doivent être réduites à l’énergie et que le nombre de poses générées est de 10. Laissez tous les autres paramètres aux valeurs par défaut en premier lieu.

Affichez les poses dans le programme de visualisation, puis triez par valeurs décroissantes du score PLP un. Utilisez des fonctions de scoring telles que plp, one pour estimer l’affinité de liaison d’un ligand amarré en fonction d’une pose de ligand candidat, de la géométrie et de l’interaction non covalente avec la structure du récepteur cible. Analysez visuellement les 25 % des poses les plus marquées pour détecter la super impossibilité avec le groupe de capping connu.

Observez également si la pose a rempli des filtres d’interaction, qui sont réglés pour inclure des contraintes d’atomes qui nécessitent des contacts intermoléculaires connus pour être critiques pour la liaison et ou sont nécessaires pour positionner le groupe de coiffage potentiel dans la géométrie correcte pour la formation de la liaison amide. Enfin, examinez les poses pour la complémentarité visuelle, qui est définie comme un remplissage efficace de la poche de liaison d’une manière cohérente avec l’activité de la structure connue. Relations pour la synthèse des groupes de coiffage d’extrémité, utiliser tous les matériaux de départ, solvants et réactifs commerciaux et synthétiser par chimie organique synthétique conventionnelle.

Effectuez une chromatographie sur couche mince ou CCM sur gel de silice pour surveiller les réactions en dissolvant d’abord le matériau de départ et le mélange réactionnel dans la phase mobile. Repérez ensuite le matériau de départ dissous et le mélange réactionnel sur la plaque CCM à l’aide de tubes capillaires. Placez la plaque CCM dans la chambre contenant la phase mobile.

Une fois que la phase mobile atteint 90 % de la plaque TLC, retirez et faites sécher la plaque à l’air. Utilisez la lumière UV pour détecter le matériau de départ et les mélanges réactionnels comme des points visibles. Calculez ensuite le RF de chaque spot, qui est le rapport entre la distance parcourue par le spot et la phase mobile.

Ensuite, placez le mélange réactionnel dans un entonnoir séparateur et lavez-le avec de l’acide aqueux ou une solution de base selon le cas. Récupérez le solvant organique et évaporez-le dans un évaporateur rotatif avant le séchage. Le produit brut obtenu sous vide, dissoudre 500 milligrammes de produit brut dans trois à cinq millilitres de solvant approprié et ajouté à un échantillon de silice ou de RP 18 avant de sécher à l’air, placer un échantillon contenant le produit brut dans de la silice, des cartouches à pression en phase inversée.

Purifier le matériau brut à l’aide de la chromatographie flash automatisée à haute performance. Utilisation d’une colonne instantanée de 100 grammes avec un dégradé. Parcourez 15 volumes de colonnes.

Sécher le produit purifié recueilli dans le solvant par chromatographie flash à l’aide d’un évaporateur rotatif en évaporant tout le solvant jusqu’à ce qu’il soit sec. Ensuite, séchez davantage le produit sous vide pour éliminer tous les solvants résiduels. Effectuer la caractérisation du produit purifié par RMN, MS et HPLC analytique comme décrit dans le protocole textuel pour synthétiser des fragments d’extrémité, des peptides inhibiteurs ligaturés ou des retournements d’assemblage.

Composés peptiques finis grâce à des méthodes standard de synthèse en phase solide. Activez cinq équivalents de l’acide aminé C terminal dans 4,4 équivalents de HBTU dans deux millilitres de DIMÉTHYLFORMAMIDE ou DMF pendant cinq minutes. Chargez le mélange sur la résine de patinoire en utilisant six équivalents de di isopropyléthylamine pendant une heure à température ambiante.

Retirez le groupe de protection FM du résidu de la borne C en utilisant 20 % d’INE dans trois millilitres de DMF pendant 10 minutes. Couplez les acides aminés suivants étape par étape à chaque étape. Couplez cinq équivalents de l’acide aminé suivant à l’aide de six équivalents d’isopropyle DI, d’éthylamine et de 4,4 équivalents de HBTU dans deux millilitres de DMF pendant une heure.

À température ambiante, appliquez les cycles de lavage après le couplage des acides aminés et les étapes de protection FM D après l’assemblage des peptides. Couplez les groupes de recouvrement N à l’aide de six équivalents d’isopropyle DI, d’éthylamine et de 4,4 équivalents de HBTU dans deux millilitres de DMF pendant une heure à température ambiante une fois l’assemblage des peptides terminé. Traitez le mélange réactionnel avec deux millilitres du mélange de clivage pendant la nuit pour éliminer les groupes protecteurs de la chaîne latérale et Cleve retourne la résine pour tritter le produit résultant avec de l’éther dathylique froid pour précipiter et si nécessaire, concentrer dans un filtre à évaporateur rotatif le solide résultant et sécher sous vide ou lyophiliser à l’aide d’un lyophilisateur.

À ce stade, passez à l’essai de liaison par polarisation de fluorescence tel que décrit dans le protocole textuel pour la détermination de la liaison compétitive. La structure du modèle H-A-K-R-R-L-I-F liée à la rainure de liaison du cyclone est illustrée. Le sillon cycliste se compose de deux poches hydrophobes, une poche primaire plus grande et une poche secondaire plus petite, qui sont comblées par des résidus acides représentés en rouge.

D’autres interactions importantes comprennent les contacts de liaison hydrogène du squelette peptidique et les interactions d’appariement ionique des trois résidus de base du peptide ici, le mode de liaison de trois cinq D-C-P-T-R-L-I-F est montré, affiché avec des interactions de liaison hydrogène avec les atomes de la chaîne latérale du tryptophane deux 17 et de la glutamine 2 54 amarrés. Des poses de trois groupes représentatifs et de coiffe sont montrées, chacun de ces composés possédant des liaisons hydrogène avec les atomes filtres d’interaction du tryptophane deux 17 et de la glutamine 2 54. Comme le montrent les lignes pointillées vertes, le fenouil subsistant fait les interactions du mur de Vander avec la poche hydrophobe secondaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une meilleure compréhension de la façon d’effectuer et d’appliquer la stratégie de remplacement, en convertissant un inhibiteur peptidique connu en une molécule plus proche d’un médicament, qui inhibe la traction d’une protéine protéique, et constitue un point de départ pour le développement thérapeutique.