Name: Synthèse d’indoxyl-glycosides pour la détection des activités de la glycosidase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Découvrez une nouvelle approche de synthèse des glycosides d'indoxyle pour le dépistage enzymatique. Cette méthode utilise des esters d'acide indoxylique comme intermédiaires et offre des rendements supérieurs aux méthodes antérieures.

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Le soutien de ce travail par Glycom A/S, Copenhague, Danemark, est vivement remercié.

Remarques générales :
Toutes les réactions ont été effectuées à l’aide d’une hotte et d’un équipement de protection individuelle approprié. Tous les réactifs et solvants (p.a. ; teneur en eau pour les solvants secs : MeCN <50 ppm ; et2o <0,01 %; CH2Cl2 <0,003 %; Les THF <0,005 %) ont été achetés auprès de sources commerciales et utilisés tels quels. La TLC a été réalisée sur des plaques de gel de silice Merck 60 F254. Les composés ont été détectés par UV et/ou par traitement à l’EtOH/H2SO4 (9:1) et chauffage ultérieur. La chromatographie sur colonne a été réalisée avec du gel de silice Merck/Fluka 60 (230-400 mesh). Les filtrations ont été effectuées à l’aide d’un entonnoir Büchner et d’une pompe d’aspiration. Les solvants ont été éliminés à l’aide d’un évaporateur rotatif (40 °C, ~200 tr/min). Les produits ont été séchés sous vide poussé (pompe à palettes rotatives). Les réactions nécessitant des solvants secs ont été réalisées sous atmosphère d’argon.
Dans ce qui suit, la synthèse de X-Gal (16) utilisant l’ester allylique de l’acide 5-bromo-4-chloro-indoxylique (12) est décrite. Pour d’autres composés avec des profils de substitution variés ainsi que des esters méthyliques préparés selon cette séquence synthétique, voir réf.17-19.
1. Accepteur : Synthèse de l’ester allylique18 de l’acide 5-bromo-4-chloro-indoxylique (12)
<ol>
	<li>N-acétylation : synthèse de N-(4-bromo-3-chloro-2-méthylphényl)-acétamide (6)
	<ol>
		<li>Dissoudre 10,0 g (45,7 mmol) de 4-bromo-3-chloro-2-méthylaniline dans 30 ml de dichlorométhane. 
		Prudence! Le dichlorométhane est nocif et refroidit la solution dans un bain de glace.</li>
		<li>Ajouter 6,50 ml (68,7 mmol) d’anhydride acétique goutte à goutte et laisser le mélange se réchauffer à température ambiante. Le mélange peut être remué pendant 8 heures ou toute la nuit. Prudence! L’anhydride acétique est corrosif et inflammable.</li>
		<li>Retirer le solvant et recristalliser à partir de l’acétate d’éthyle/méthanol 9:1 (rendement : 97 % (11,6 g, 44,2 mmol), solide incolore). 
		Prudence! L’acétate d’éthyle est irritant et inflammable. Prudence! Le méthanol est toxique et inflammable.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oxydation : Synthèse de l’acide N-acétyl-5-bromo-6-chloro-anthranilique (7)
	<ol>
		<li>Reflux : mélange de 2,30 g (8,76 mmol) de 6 (produit obtenu à l’étape 1.1) et de 2,10 g (8,52 mmol) de MgSO4•7H2O dans 40 ml d’eau dans une fiole à 3 cols à fond rond équipée d’un refroidisseur et d’un entonnoir compte-gouttes.</li>
		<li>Ajouter goutte à goutte 50 ml de solution saturée de KMnO4 dans de l’eau au mélange réactionnel pendant 3 heures. Chauffer ensuite pendant 2 heures supplémentaires sous reflux, env. 135 °C bain d’huile. Prudence! Le permanganate de potassium est nocif et oxydant.</li>
		<li>Refroidir à température ambiante et filtrer la pyrolusite (MnO2), qui se forme pendant la réaction. 
		Prudence! La pyrolusite est nocive.</li>
		<li>Ajouter de l’acide chlorhydrique (37 %) au filtrat jusqu’à pH 1, puis filtrer le produit et le faire sécher sous vide (rendement : 70 % (1,80 g, 6,15 mmol), solide incolore). 
		Prudence! L’acide chlorhydrique est corrosif.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Désacétylation : Synthèse de l’acide 5-bromo-6-chloro-anthranilique (8)
	<ol>
		<li>Dissoudre 3,90 g (13,3 mmol) de 7 (produit obtenu à partir de l’étape 1.2) dans 70 ml d’une solution aqueuse d’hydroxyde de sodium 1 N et chauffer à environ 100 °C (bain d’huile) pendant 5 h 
		Prudence! L’hydroxyde de sodium est corrosif.</li>
		<li>Refroidir à température ambiante et ajouter de l’acide chlorhydrique (37 %) jusqu’à pH 1, puis filtrer le produit avec un entonnoir Büchner et le faire sécher sous vide (rendement : 88 % (2,93 g, 11,7 mmol), solide incolore).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Formation d’anhydride : Synthèse de l’anhydride 5-bromo-6-chloro-isatoïque (9)
	<ol>
		<li>Mettre en suspension 8,17 g (32,6 mmol) de 8 (produit obtenu à partir de l’étape 1.3) dans 33 ml d’acétonitrile sec 
		Prudence! L’acétonitrile est nocif et inflammable.</li>
		<li>Agiter à température ambiante et ajouter 5,3 ml et une solution de 3,22 g (10,8 mmol) de triphosgène dans 18,5 ml de dichlorométhane sec goutte à goutte simultanément sur une période de 30 min. Puis chauffé pendant 3 h à 50 °C (bain d’huile). Prudence! La pyridine est nocive et inflammable. 
		Prudence! Le triphosgène est toxique et peut libérer du phosgène.</li>
		<li>Retirez environ 75 % du solvant et éteignez la réaction en ajoutant 100 ml d’eau distillée et filtrez votre produit. Lavez avec une petite quantité de dichlorométhane froid.</li>
		<li>Sécher le produit sous vide, (rendement : 88 % (7,53 g, 27,2 mmol), solide incolore).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N-alkylation : Synthèse de l’anhydride 5-bromo-6-chloro-N-[(méthoxycarbonyl)allyl]-isatoïque (10)
	<ol>
		<li>Dissoudre 25 g (90 mmol) de 9 (produit obtenu à l’étape 1.4) dans 250 ml de diméthylformamide anhydre et refroidir avec un bain ><de glace.
		Prudence! Le diméthylformamide est nocif et inflammable</li>
		<li>Ajouter 1,15 équivalent d’hydrure de sodium (60 % dans la paraffine) par portions. 
		Prudence! L’hydrure de sodium est corrosif et inflammable ; forte réaction avec l’eau/la glace.</li>
		<li>Après 30 min d’agitation à 0 °C, laisser chauffer à température ambiante et ajouter 1,2 équivalent de bromoacétate d’allyle goutte à goutte.</li>
		<li>Après avoir agité pendant 5 heures, éteignez la réaction en ajoutant 500 ml d’eau distillée et filtrez votre produit.</li>
		<li>Laver à l’eau (3 fois, 100 ml) et sécher le produit sous vide, (rendement : 93 % (31,5 g, 84,1 mmol), solide incolore).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ouverture de l’anhydride : Synthèse de l’ester allylique de l’acide 5-bromo-6-chloro-N-(méthoxycarbonylallyl)-anthranilique (11)
	<ol>
		<li>Dissoudre 10 g (27 mmol) de 10 (produit obtenu à partir de l’étape 1.5) dans 100 ml d’alcool allylique. 
		Prudence! L’alcool allylique est nocif et dangereux pour l’environnement.</li>
		<li>Ajouter 350 mg (8,70 mmol) d’hydrure de sodium (60 % dans la paraffine) par portions.</li>
		<li>Après avoir remué pendant 6,5 heures ou toute la nuit, retirez le solvant.</li>
		<li>Soumettre le produit brut à la chromatographie sur colonne (colonne 30 x 6 cm ; 240 g de silice) éther de pétrole/acétate d’éthyle 2:1 ; RF = 0,66), (rendement : 80 % (8,30 g, 21,3 mmol), huile jaune). 
		Prudence! L’éther de pétrole est inflammable, irritant et dangereux pour l’environnement.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Condensation de Dieckmann : synthèse de l’ester allyle de l’acide 5-bromo-4-chloro-indoxylique (12)
	<ol>
		<li>Mélanger 3,0 g (7,7 mmol) de 11 (produit obtenu à l’étape 1.6) et 1,75 g (15,6 mmol) de tert-butoxyde de potassium dans 100 ml d’éther diéthylique sec. 
		Prudence! Le tert-butoxyde de potassium est corrosif et inflammable. 
		Prudence! L’éther diéthylique est nocif et extrêmement inflammable.</li>
		<li>Chauffer le mélange sous reflux (refroidisseur) pendant 2 heures à 40-45 °C.</li>
		<li>Retirer environ 75 % du solvant et ajouter de l’acide chlorhydrique dilué (100 ml, 1 M). 
		Prudence! Ne pas sécher complètement, une décomposition peut se produire.</li>
		<li>Filtrer le produit et le faire sécher sous vide (rendement : 84 % (5,14 g, 15,5 mmol), solide incolore à légèrement vert).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indoxyl-glycoside : synthèse de X-Gal17
<ol>
	<li>Glycosylation par transfert de phase : Synthèse de (ester allylique de l’acide 5-bromo-4-chloro-indox-3-ylique) 2,3,4,6-tétra-O-acétyl-β-ᴅ-galactopyranoside (14)
	<ol>
		<li>Mélanger 400 mg (1,21 mmol) d’allylester 12 (produit obtenu à l’étape 1.7), 410 mg (1,21 mmol) d’hydrogénosulfate de tétrabutylammonium et 500 mg (1,21 mmol) de bromure de 2,3,4,6-tétra-O-O-acétyl-α-ᴅ-galactopyranosyle (α-acétobromogalactose) dans 10 ml de dichlorométhane. Prudence! Le sulfate d’hydrogène de tétrabutylammonium est nocif.</li>
		<li>Ajouter 10 ml d’une solution aqueuse de carbonate de potassium (1 M). 
		Prudence! Le carbonate de potassium est corrosif.</li>
		<li>Remuer à température ambiante jusqu’à consommation complète du donneur (CCM : éther de pétrole/acétate d’éthyle).</li>
		<li>Séparer la phase organique (entonnoir séparateur), sécher sur Na2SO4 et retirer le solvant.</li>
		<li>Soumettre le produit brut à la chromatographie sur colonne (éther de pétrole/acétate d’éthyle 1:1 ; RF = 0,33). (rendement : 86 % (690 mg, 1,04 mmol), solide incolore).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Clivage et décarboxylation des esters : synthèse de (N-acétyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl) 2,3,4,6-tétra-O-acétyl-β-ᴅ-galactopyranoside (15)
	<ol>
		<li>Dissoudre 600 mg (0,908 mmol) de 14 (produit obtenu à partir de l’étape 2.1) dans 15 ml de tétrahydrofurane. 
		Prudence! Le tétrahydrofurane est nocif et inflammable.</li>
		<li>Ajouter 800 μl de morpholine et 105 mg (9,09 μmol) de tétrakis(triphénylphosphine)palladium(0) et remuer toute la nuit à température ambiante. 
		Mise en garde ! La morpholine est inflammable et corrosive.</li>
		<li>Retirez le solvant.</li>
		<li>Ajouter 400 mg (2,40 mmol) d’acétate d’argent, 800 mg (5,79 mmol) de carbonate de potassium et 10 ml d><'anhydride acétique.
		Prudence! L’acétate d’argent est irritant et dangereux pour l’environnement.</li>
		<li>Chauffer à 90-100 °C pendant 20 min.</li>
		<li>Après refroidissement à température ambiante, diluer avec du dichlorométhane.</li>
		<li>Lavez le mélange deux fois avec de l’eau et une fois avec une solution diluée de NaHCO3 (10 %). 
		Prudence! Le bicarbonate de sodium est corrosif.</li>
		<li>Sécher la phase organique sur Na2SO4 (filtre) et retirer le solvant.</li>
		<li>Soumettre le produit brut à la chromatographie sur colonne (PE/EA 1:1 ; RF = 0,24), (rendement : 88 % (495 mg, 8,00 mmol), solide incolore).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Désacétylation de Zemplén : Synthèse de (5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-β-ᴅ-galactopyranoside (16)
	<ol>
		<li>Dissoudre 396 mg (0,436 mmol) 15 (produit obtenu à l’étape 2.2) dans 10 ml de méthanol.</li>
		<li>Ajoutez une quantité catalytique de méthanolate de sodium et remuez toute la nuit à température ambiante. 
		Prudence! Le méthanolate de sodium est inflammable et corrosif.</li>
		<li>Neutraliser avec Amberlite IR-120 H+ (filtre) et concentrate. 
		Prudence! L’Amberlite IR-120 H+ est irritant.</li>
		<li>Sécher le produit sous vide, (rendement : 87 % (170 mg, 0,416 mmol), solide incolore).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Démonstration de l’expérience du modèle : Preuve d’activité de la β-galactosidase utilisant X-Gal
<ol>
	<li>Préparez une solution de 0,5 mM de X-Gal dans un tampon de 500 μl (Tris-HCl 20 mM ; pH 7,4 ; 50 mM de NaCl, 0,1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique ; ou tout autre tampon approprié pour votre enzyme) dans un tube de microcentrifugation (le X-Gal peut être dissous dans quelques μl de diméthylsulfoxyde).</li>
	<li>Ajouter 1 μl de β,1-3-galactosidase (EC 3.2.1.23 10 000 U/ml ; ou tout autre β-galactosidase approprié) et agiter (600 rps) à 37 °C.</li>
	<li>Suivez la réaction. Le colorant de type indigo se forme après une courte période de temps.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

En raison de faibles rendements et de limitations, en particulier pour les structures de type glucose et les saccharides plus complexes, une nouvelle approche synthétique des glycosides d’indoxyle a été développée. Les esters d’acide indoxylique se sont avérés être des intermédiaires clés précieux et ont été obtenus dans une voie modulaire et évolutive. Toutes les étapes sont à haut rendement et, grâce à des matériaux de départ bon marché et à un travail facile, des synthèses de plusieurs grammes sont possibles. L’avanta...

Pendant longtemps, la production d'indigo a constitué un processus économiquement très important. Avant que des synthèses chimiques à grande échelle ne rendent l'indigo accessible à moindre coût, des précurseurs étaient obtenus à partir de sources naturelles depuis l'époque préchrétienne. La culture des plantes productrices d'indigo (indigo naturel) en Europe est devenue peu rentable à partir du 17th siècle, car la quantité de précurseurs de l'indigo présents dans la plante indienne d'indigo (0,2-0,8 %) est environ 30 fois plus élevée. À la fin du XIXe siècle, la synthèse chimique de l'indigo a supplanté la culture traditionnelle1,2.
Les précurseurs de l'indigo présents naturellement dans les plantes comprennent l'indican (1), l'insatan A (2) et l'isatan B (3) (Figure 1). Tous comportent un motif indoxyle lié à un résidu glycosylique. Le clivage de la liaison glycosidique, par exemple par hydrolyse enzymatique, conduit à la libération de l'indoxyle (4). L'indoxyle lui-même est pratiquement incolore, mais peut être rapidement oxydé pour former un colorant indigo (5). Cette réaction sensible a été adaptée en biochimie, en histochimie, en bactériologie et en biologie moléculaire pour le suivi de l'activité enzymatique. Un criblage de l'activité in vivo, sans isolement ni purification des enzymes, ainsi que des tests rapides sur des boîtes de gélose ou en solution (par ex., criblage bleu-blanc, microplaques) sont possibles. Selon le résidu (par ex., esters, glycosides, sulfates) lié à la partie indoxyle, des substrats appropriés pour différentes classes d'enzymes (par ex., estérases, glycosidases, sulfatases) ont été développés3. Dans ce qui suit, l'accent sera mis sur la formation et l'application des glycosides d'indoxyle.
<img alt="Schéma du processus d'hydrolyse de l'indican montrant les dérivés de l'indole et la formation du colorant indigo." src="/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Précurseurs naturels de l'indigo et formation du colorant indigo par hydrolyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
Le motif de substitution de la partie indoxyle détermine la couleur et les propriétés physiques du colorant indigo obtenu. Les motifs de substitution les plus courants sont le 5-bromo-4-chloro (abrévié par X ; bleu-vert), le 5-bromo (bleu) et le 5-bromo-6-chloro (magenta), car ils forment les particules de colorant les plus petites, ne forment pas de granules et présentent la moindre diffusion à partir des sites d'hydrolyse. Cette dernière propriété est particulièrement importante pour les expériences in vivo3.
Le premier rapport sur une méthode indigène pour la détection de l'activité estérase a été publié en 1951 par Barrnett et Seligman, qui utilisaient l'acétate et le butyrate d'indoxyle4. Environ une décennie plus tard, le principe indigène a été adapté pour la localisation de la glucosidase chez les mammifères5. Depuis, plusieurs glycosides d'indoxyle ont été développés, bien que leur synthèse se soit révélée difficile. La plupart des synthèses reposent sur l'utilisation d'un indoxyle N-acétylé comme accepteur et du donneur correspondant, un halogénure de glycosyle6-14. La glycosylation est réalisée dans l'acétone en présence d'hydroxyde de sodium. Dans ces conditions, un certain nombre de réactions secondaires se produisent, réduisant considérablement le rendement. Des rendements de glycosylation particulièrement faibles ont été rapportés pour les structures de type glucose (par exemple 15 % pour le (indol-3-yle N-acétyl-5-bromo-4-chloro)-2,3,4,6-tétra-O-acétyl-β-ᴅ-glucopyranoside6 et 26 % pour le (indol-3-yle N-acétyl-5-bromo-4-chloro)-2,3,2',3',4'-penta-O-acétyl-β-ᴅ-xylobioside14 dans un exemple plus récent). Grâce à une nouvelle approche utilisant des esters d'acide indoxylique, un nombre considérable de glycosides d'indoxyle a été préparé avec de bons rendements (par exemple, (indol-3-yle N-acétyl-5-bromo-4-chloro)-2,3,4,6-tétra-O-acétyl-β-ᴅ-glucopyranoside, rendement de 57 %).
Le protocole suivant décrit la synthèse simple de l'ester allylique de l'acide indoxylique (5-bromo-4-chloro) et, à partir de celui-ci, la synthèse d'un glycoside d'indoxyle (X-Gal). Une expérience modèle simple montre la réactivité enzymatique de la β-galactosidase en utilisant X-Gal.

<table><tbody><tr><td>Anhydride acétique</td><td>Gr&uuml ; ssing</td><td>10298</td><td>Corrosif, inflammable</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608-001-00-3</td><td>Nocif, inflammable</td></tr><tr><td>Alcool allylique</td><td>Aldrich</td><td>453021</td><td>Nocif, dangereux pour l’environnement</td></tr><tr><td>Amberlite IR-120 H+</td><td>Fluka</td><td>06428</td><td></td></tr><tr><td>Irritant Acide bromoacétique</td><td>Merck</td><td>802260</td><td>Corrosif, toxique, dangereux pour l’environnement</td></tr><tr><td>4-Bromo-3-chloro-2-méthylaniline</td><td>ABCR</td><td>AB 171687</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td> irritant <td>ACROS</td><td>326850010</td><td></td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td> nocif <td>Gr&uuml ; ssing</td><td>10274</td> Diméthylformamide <td>nocif, extrêmement inflammable</td></tr><tr><td></td><td>ACROS</td><td>348430010</td> Diméthylsulfoxyde <td>nocif, inflammable</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’éthyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>607-022-00-5</td><td>Irritant, inflammable</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>AppliChem</td><td>A1103.0500</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>&bêta ; 1,3-galactosidase recombinante E. coli</td><td>Calbiochem</td><td>345795</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>VWR</td><td>20252.290</td><td>Corrosif</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium hydraté</td><td>Merck</td><td>105885</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>ACROS</td><td>326950010</td><td>Toxique, inflammable</td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>Janssen Chimica</td><td>15.868.57</td><td>Corrosif, inflammable</td></tr><tr><td>Éther de pétrole</td><td>Azelis</td><td>111053</td><td>Inflammable, irritant, dangereux pour l’environnement</td></tr><tr><td>Carbonate de potassium</td><td>Gr&uuml ; ssing</td><td>12005</td><td></td></tr><tr><td>Permanganate de potassium</td> corrosif <td>Gr&uuml ; ssing</td><td>12056</td><td>Nocif, oxydant</td></tr><tr><td>Tert-butoxyde de potassium</td><td>Merck</td><td>804918</td><td>Corrosif, inflammable</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>613-002-00-7</td><td>Nocif, inflammable</td></tr><tr><td>Acétate d’argent</td><td>Fluka</td><td>85140</td><td>Irritant, dangereux pour l’environnement</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Gr&uuml ; ssing</td><td>12144</td><td>Corrosif</td></tr><tr><td>Hydrure de sodium</td><td>Merck</td><td>814552</td><td>Corrosif, inflammable</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Riedel-de H&auml ; fr</td><td>S181200</td> Méthanolate de sodium <td>corrosif</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>806538</td> Sulfate de sodium <td>corrosif et inflammable</td></tr><tr><td></td><td>Gr&uuml ; ssing</td><td>12175</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’hydrogénium de tétrabutylammonium</td><td>Lancaster</td><td>5438</td><td></td></tr><tr><td>Tétrahydrofurane</td> nocif <td>Sigma-Aldrich</td><td>87371</td><td>Nocif et inflammable</td></tr><tr><td>Tetrakis (triphénylphosphine)palladium(0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216666</td><td></td></tr><tr><td>Triphosgene</td><td>Fluka</td><td>15217</td><td>Tris</td></tr><tr><td>(hydroxyméthyl)aminométhane toxique chlorhydrate</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td>Irritant</td></tr></tbody></table>

synthèse d’indoxyl-glycosides pour la détection des activités de la glycosidase

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Les glycosides indoxyles se sont avérés être des outils précieux et polyvalents pour surveiller les activités des glycosidases. Les indoxyles sont libérés par hydrolyse enzymatique et sont rapidement oxydés, par exemple par l’oxygène atmosphérique, en colorants de type indigo. Cette réaction permet un criblage in vivo rapide et facile sans isolement ni purification des enzymes, ainsi que des tests rapides sur plaques de gélose ou en solution (par exemple, criblage bleu-blanc, micro-puits) et est utilisée en biochimie, histochimie, bactériologie et biologie moléculaire. Malheureusement, la synthèse de tels substrats s’est avérée difficile, en raison de diverses réactions secondaires et de la faible réactivité de la fonction hydroxyle de l’indoxyle. En particulier pour les structures de type glucose, de faibles rendements ont été observés. Notre nouvelle approche utilise l’ester d’acide indoxylique comme intermédiaire clé. Des esters d’acide indoxylique avec des profils de substitution variés ont été préparés sur des voies évolutives. Des glycosylations de transfert de phase avec ces accepteurs et des halogénures de glycosyle peracétylés peuvent être effectuées dans des conditions courantes à des rendements élevés. Le clivage de l’ester et la glycosylation modérée par l’argent qui s’ensuit produisent les glycosides indoxyles peracétylés à haut rendement. Enfin, la déprotection est effectuée selon Zemplén.

Les toutes premières synthèses de l'indicane et du 5-bromo-indicane ont été publiées par Robertson dès 1927 et 192915,16. En utilisant l'ester méthylique de l'acide indoxylique comme accepteur, la position réactive en 2 a été bloquée, ce qui a permis de supprimer partiellement les réactions secondaires. La glycosylation en présence d'acétone et d'hydroxyde de sodium, suivie d'une déprotection et d'une décarboxylation (160 °C, anhydride acétique, 1 h), puis d'une déacétylation finale, a conduit à l'obtention de...

Les glycosides indoxyles sont des outils bien établis et largement utilisés pour le criblage enzymatique et la surveillance de l’activité enzymatique. En particulier pour les structures de type glucose, les synthèses précédentes se sont avérées difficiles et à faible rendement. Notre nouvelle approche utilise des esters d’acide indoxylique comme intermédiaires précieux pour produire un nombre considérable de glycosides d’indoxyle avec de bons rendements.

Synthèse d’indoxyl-glycosides pour la détection des activités de la glycosidase

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

L'objectif général de cette procédure est de présenter une nouvelle approche synthétique pour les glycosides endo, y compris ceux possédant des structures glucidiques complexes, avec de bons rendements. Cela est réalisé en premier lieu par la synthèse d'un accepteur d'ester allo d'acide inique, à partir du méthyle lène. La deuxième étape consiste à glycosyler cet accepteur avec un donneur haloglycosyle acétylé.Ensuite, l'ester de l'allèle est clivé par un catalyseur au palladium, et une décarboxylation médiée par l'argent est appliquée pour former le glycoside d'inox acétylé. La dernière étape consiste en une désacétylation par le zéplan afin d'obtenir le glycoside d'inox non protégé. Enfin, le substrat chromogène préparé est utilisé pour un test qualitatif d'activité enzymatique.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle permet de produire facilement des glycosides de structures glucidiques complexes et instables. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en lisant une publication d'Alexander Robertson datant de 1927, qui a mis au point la première synthèse de l'acide incaïque méthyl ester. Les méthodes ultérieures ont utilisé des accepteurs de type oxi-inoxy en raison de leur meilleure accessibilité, mais souffraient de rendements faibles et de difficultés de purification. Pour commencer la synthèse, un satellite, un alcène substitué par un halogène, tel que décrit dans le protocole du texte.Ensuite, dans un ballon rond à trois cols, faire une refluxer 2,3 grammes de l'acétamide méthyle halogéné obtenu dans 40 millilitres d'eau avec 2,1 grammes de sulfate de magnésium heptahydraté pendant trois heures. Ajouter goutte à goutte 50 millilitres d'une solution aqueuse saturée de permanganate de potassium, puis poursuivre le reflux du mélange pendant deux heures supplémentaires à environ 135 degrés Celsius dans un bain d'huile. Refroidir le mélange à température ambiante, puis le filtrer pour éliminer le sous-produit pyrocyte, et ajuster le pH de la solution à un à l'aide d'acide chlorhydrique à 37 %.Ensuite, filtrer le produit à partir du solvant et le sécher sous vide. Après séchage du DECI, isoler le produit comme décrit dans le protocole textuel, puis mettre en suspension 8,17 grammes du produit DECI obtenu dans 33 millilitres de triacétone d'acétone anhydre. Pendant 30 minutes, ajouter goutte à goutte 5,3 millilitres de pyridine et une solution de 3,22 grammes de tristine dans 18,5 millilitres de dichlorométhane anhydre à la solution. Chauffer ensuite la réaction à 50 degrés Celsius dans un bain d'huile.Après trois heures, éliminer environ 75 % du solvant et ajouter 100 millilitres d'eau distillée pour arrêter la réaction. Filtrer le produit, puis laver le filtre avec cinq à dix millilitres de chlorométhane froid. Après le lavage, sécher sous vide le produit, alkylé cet intermédiaire, puis ouvrir l'anhydride obtenu comme décrit dans le protocole du texte.Isolez le produit obtenu par chromatographie sur colonne. Commencez la condensation de Dickman en mélangeant trois grammes du produit avec 1,75 gramme d'oxyde de potassium dans 100 millilitres d'un mélange réactionnel d'éther de dathyle anhydre sous reflux pendant deux heures à une température de 40 à 45 degrés Celsius. Ensuite, éliminez environ 75 % du solvant sous vide et précipitez le produit avec 100 millilitres d'acide chlorhydrique à une molarité de un molaire.Filtrez le produit, puis séchez-le sous vide. Pour commencer la synthèse de XG, mélangez 400 milligrammes de l'ester allylique de l'acide indoc clic avec 410 milligrammes de TBAs et 500 milligrammes d'alpha xto bromo galactose dans 10 millilitres de chlorométhane. Ajoutez ensuite 10 millilitres de carbonate de potassium aqueux à 1 molaire à la réaction.Agiter la réaction à température ambiante pendant environ trois heures et surveiller la consommation de l'alpha acéto bromo actose par chromatographie sur couche mince dans une solution équivalente de pétrole éther et d'acétate d'éthyle. Une fois l'alpha acéto bromo galactose complètement consommé, isoler la phase organique de la solution à l’aide d’une ampoule à décanter. Ensuite, sécher la phase organique sur du sulfate de sodium afin d’éliminer l’eau résiduelle, puis utiliser la chromatographie sur colonne pour purifier le produit comme décrit dans le protocole du texte afin de cliver l’ester allo. Dissoudre 600 milligrammes du côté galacto purique dans 15 millilitres de tétra hydro furanne anhydre.Éliminer le solvant sous vide, puis ajouter 400 milligrammes d'acétate d'argent, 800 milligrammes de carbonate de potassium et 10 millilitres d'anhydride acétique au produit, et chauffer la réaction à environ 95 degrés Celsius pendant 20 minutes. Laisser refroidir la réaction à température ambiante, puis diluer avec 50 millilitres de dichlorométhane. Pour le traitement de cette réaction, laver le mélange deux fois à l'eau et une fois avec une solution de bicarbonate de sodium à 10 %.Séchez la phase organique sur du sulfate de sodium, puis concentrez la solution. Utilisez la chromatographie sur colonne pour purifier le dérivé acétylé de galacto puric obtenu. Ensuite, dissolvez 396 milligrammes du matériau purifié dans 10 millilitres de méthanol.Ajoutez une quantité équivalente à la pointe d'une spatule de méthylate de sodium, puis agitez la réaction toute la nuit. Utilisez une résine échangeuse de cations pour neutraliser la réaction, puis concentrez la solution sous vide. Enfin, séchez le produit sous vide afin d'obtenir le xal, permettant de tester la validité de la voie de synthèse.Tout d'abord, dissoudre le xal dans quelques microlitres de diméthylsulfoxyde. Ensuite, préparer une solution mère de xal à 0,5 millimolaire dans un tampon approprié. Puis ajouter un microlitre de bêta-galacto et agiter le mélange à 600 tours par seconde.À 37 degrés Celsius, surveiller visuellement la réaction pour la formation d'un colorant indigo vif. La formation d'un colorant bleu en solution indique clairement une activité enzymatique dans le doxyl. Les glycosides sont importants pour surveiller l'activité de l'enzyme glycosidase, mais ils sont difficiles à synthétiser.L'approche synthétique présentée ici permet d'obtenir le produit final galacto purique endo avec un rendement global de 66 %. Une amélioration significative par rapport à la méthodologie précédente, qui conduisait uniquement à un rendement de 28 %. Les glycosides de doxyle obtenus peuvent être utilisés pour tester l'activité de solutions enzymatiques pures ou impures.Dans cet exemple, la couleur indigo n'a été observée que dans les puits contenant du bêta-galacto et a été produite avec seulement 0,1 millimolaire de XG. Une fois que l'accepteur cellulaire indoc est préparé, cette voie synthétique permettant d'obtenir les glycosides cellulaires indoc peut être réalisée en deux jours si elle est correctement effectuée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la synthèse et de l'utilisation des glycosides initiaux. Cette voie synthétique produit ces composés en bon rendement malgré leurs structures complexes.

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