Transposon Mediated intégration du plasmide ADN dans le zone sous-ventriculaire de souris néonatale pour générer des modèles nouveaux de glioblastome

L’objectif de cette procédure est de créer de nouveaux modèles de glioblastomes et, à terme, de développer de nouvelles approches thérapeutiques en induisant la formation de glioblastomes porteurs de mutations génétiques spécifiques chez la souris. Ceci est accompli en créant d’abord des plasmides de transposons, codant pour les gènes spécifiques d’intérêt. Les étapes suivantes consistent à préparer les plasmides avec un réactif de transfection et à les injecter dans le ventricule latéral de souris néonatales.

L’absorption dans la progression tumorale est ensuite surveillée par luminescence. Lorsque les animaux deviennent plus abondants, ils sont sacrifiés pour l’analyse histologique et immunohistochimique. Ainsi, de nouveaux glioblastomes avec des altérations génétiques spécifiques sont induits dans des contextes génétiques de type sauvage ou ciblés.

Ces tumeurs peuvent être étudiées in vivo ou utilisées in vitro pour générer de nouvelles lignées cellulaires susceptibles d’analyses biochimiques et d’expériences de cytotoxicité utilisant des agents chimiothérapeutiques. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes, comme par exemple les injections orthotopiques de lignées cellulaires de glioblastome, est que les tumeurs sont induites par la transformation maligne de cellules endogènes à un animal immunocompétent en utilisant des altérations génétiques très spécifiquement choisies. Ce processus reproduit plus fidèlement l’étiologie de la maladie humaine et récapitule les principales caractéristiques histopathologiques du GBM humain.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuro-oncologie, telles que quelles sont les mutations conductrices responsables de l’induction de différents types de glioblastome multiforme, classique, pré-neural, neural chez l’adulte ou dans les tumeurs pédiatriques. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie de la GPM depuis les nouvelles chimiothérapies. Les immunothérapies par rayonnement, ou une combinaison de celles-ci, peuvent être testées relativement rapidement in vivo ou in vitro à l’aide de ce modèle.

J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque j’ai discuté avec mon collègue, le Dr John de l’Université du Minnesota, qui avait développé le modèle initial de tumeur cérébrale en utilisant l’intégration médiée des oncogènes de la belle au bois dormant, un inhibiteur des gènes suppresseurs de tumeur dans l’ADN génomique de l’hôte. J’ai pensé que cette méthodologie serait très puissante pour étudier l’impact de nouvelles mutations dans la progression tumorale et aider à développer des thérapies ciblées pour le cancer du cerveau Trois à quatre semaines avant l’expérience, installez une cage d’élevage de souris avec un mâle et une femelle, incluez un igloo en plastique coloré pour enrichir l’environnement et augmenter les chances d’accouplement. Retirez le mâle une fois qu’une grossesse a été confirmée et, 18 jours après le jour de l’accouplement, commencez à surveiller la femelle pour l’accouchement.

Assurez-vous qu’une mère porteuse est disponible au moment de l’accouchement. Le premier jour postnatal, effectuez les injections intraventriculaires. Préparez la solution d’injection par Ali en citant 20 microlitres du mélange d’ADN contenant la transposée sur les plasmides à une concentration finale de 0,5 microgramme d’ADN par microlitre.

Ensuite, à une aliquote de 20 microlitres de solution de PEI à la solution d’ADN et laissez-les incuber à température ambiante pendant 20 minutes à une heure, après quoi le mélange doit être stocké sur de la glace. Pour l’aiguille d’injection, fixez une seringue de 10 microlitres à une aiguille hypodermique de calibre 30, biseautée à 12,5 degrés. Fixez ensuite la seringue à une micro-pompe à injection automatique.

Testez l’installation avec 10 microlitres d’eau et assurez-vous de vider la seringue. Maintenant, refroidissez le stade stéréotaxique néonatal avec une bouillie de glace sèche et d’alcool. Lorsqu’il est refroidi entre deux et huit degrés Celsius, procédez aux injections.

Anesthésie d’abord un chiot en le plaçant sur de la glace pendant deux minutes. Pendant que le chiot est sur de la glace, chargez la seringue avec la solution d’injection. Une fois anesthésié, transférez le chiot dans le cadre et immobilisez sa tête entre les barres d’oreille recouvertes de gaze.

Vérifiez que la face dorsale du crâne est horizontale et parallèle à la surface du cadre. De plus, les sutures crâniennes doivent être clairement visibles. Si la tête du chiot n’est pas immobilisée assez fermement, elle se déplacera pendant l’injection.

Alors que s’il est serré trop fermement entre les barres d’oreille du cadre, le lambda ne sera pas visible et la pression à l’intérieur de la tête forcera la solution injectée à s’échapper Avec le chiot fermement saisi par le cadre, essuyez la tête avec de l’éthanol à 70 %, puis abaissez l’aiguille et ajustez sa position pour qu’elle entre en contact avec le lambda. Ensuite, soulevez l’aiguille et déplacez-la de 0,8 millimètre latéralement et de 1,5 millimètre de compte. Ensuite, abaissez-le à nouveau jusqu’à ce qu’il creuse légèrement la peau.

Notez les coordonnées de cette position. Abaissez ensuite l’aiguille de 1,5 millimètre à travers la peau et le crâne et dans le cortex au niveau du ventricule latéral. Injectez 0,75 microlitre en 90 secondes et attendez une minute pour laisser la solution se disperser pendant l’attente.

Le prochain chiot à injecter peut être anesthésié. Après le poids, soulevez lentement l’aiguille, puis transférez le chiot dans un endroit de récupération sous une lampe chauffante. Le temps entre l’anesthésie et le réchauffement doit être inférieur à 10 minutes.

Le plus vite est le mieux, surveillez sa respiration et, si nécessaire, frottez doucement les membres pour stimuler la respiration. Une fois que le chiot est réchauffé, a une couleur rose et une respiration régulière, rendez-le à sa mère. Cela prend généralement cinq à sept minutes après l’injection.

Si plusieurs chiots sont injectés, ils doivent tous être récupérés avant d’en rendre à la mère. Si, au bout d’une demi-heure, tous les chiots ne sont pas prêts, rendez-lui la moitié, puis rendez-lui le reste plus tard à la fin de la procédure, surveillez la mère. Après avoir rendu les chiots.

Si elle ne répond pas aux petits, ajoutez la mère porteuse dans la cage. 24 à 72 heures après l’injection, surveillez l’absorption du plasmide et transférez tous les petits dans six boîtes de culture tissulaire bien approvisionnées, une petite par puits. Ensuite, chargez une seringue d’un millilitre avec 30 milligrammes par millilitre de Lucifer dans une solution saline ou PBS et fixez une aiguille hypodermique de calibre 30.

Injectez 30 microlitres de solution par voie sous-cutanée entre les omoplates de chaque chiot pour éviter de blesser le chiot, injectez la solution sous un petit pli de peau. Transférez immédiatement les petits vers un système d’imagerie par bioluminescence in vivo. Configurez une séquence pour acquérir quatre images consécutives à une minute d’intervalle avec une exposition automatique, un grand pliage et une ouverture d’un point. Plus tard.

Après environ 17 jours, les animaux pourraient commencer à former des tumeurs macroscopiques détectables par bioluminescence et histologie. La surveillance des tumeurs peut également prendre jusqu’à six semaines. Injectez 100 microlitres de solution luciférienne par voie intrapéritonéale avec une aiguille de calibre 26.

Après trois minutes, anesthésez les animaux dans une chambre d’anesthésie à l’oxygène fluoré ISO et placez les animaux dans la chambre d’imagerie équipée de cônes pour disperser le fluor ISO. Acquérez une série de six images à deux minutes d’intervalle avec un temps d’exposition automatique, un binning moyen et un diaphragme à ouverture ouverte de un. La région d’intérêt est généralement un ovale au-dessus de la tête, mesurée l’intensité de la luminescence chez chaque animal en utilisant les mêmes paramètres pour caractériser les caractéristiques histopathologiques des glioblastomes induits par SB.

C-57 noir six souris néonatales ont été injectées à P un avec un plasmide et une luciférase d’enrobage en combinaison avec des transposons d’inodes NRA S et SV 40 de grands plasmides T avec de l’ADN oncogène. Alternativement, un plasmide codant pour une courte épingle à cheveux P 53 avec PDGF bêta, et un rapporteur A GFP a été injecté en combinaison avec NRAS. Une nécrose pseudo-pale était évidente, ainsi qu’une nécrose périvasculaire et diffuse dans le cerveau.

Les glioblastomes du parenchyme ont également été surveillés par bioluminescence. Les animaux succombent généralement à la charge tumorale. Lorsque la luminescence atteignait une intensité de 10 à la septième à 10 à la neuvième unités calibrées.

Comme on pouvait s’y attendre, la survie médiane des animaux dépendait des combinaisons de transposons oncogènes injectés dans le cerveau néonatal. Les tumeurs les plus agressives ont été induites par NRS et les tumeurs de novo du grand antigène T SV 40 ont été caractérisées par leur expression de molécules caractéristiques. Les tumeurs naissantes faites pour exprimer la GFP induite avec SHP 53 et nras ont exprimé le marqueur de cellules souches neurales neston, et certaines ont également exprimé la protéine acide glio fibrillaire.

Après 56 jours, une tumeur a été trouvée entourée de nombreux astrocytes positifs au GFAP. Ces cellules tumorales exprimaient la néine mais pas la GFAP. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire la formation de glioblastomes, hébergeant des mutations génétiques spécifiques par des injections intraventriculaires chez des souris néonatales, et comment surveiller la progression de la maladie avec la bioluminescence.

Dans l’article, vous trouverez des détails sur la façon de cloner facilement un nouveau plasmide trans pro, codant pour des gènes d’intérêt, ainsi que sur la façon de surveiller les tumeurs et de les analyser avec l’histologie et l’immunohistochimie. En outre, vous trouverez une méthode détaillée sur la façon de générer de nouvelles lignées cellulaires de glioblastome à partir d’animaux atteints de tumeurs génétiquement modifiées. Nous espérons que cet article contribuera à accélérer la découverte de nouvelles thérapies pour cette maladie humaine dévastatrice.