Name: Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique Utilisation du nématode Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Découvrez un test à haut débit pour évaluer la toxicité germinale chimique chez Caenorhabditis elegans. Cette méthode utilise des marqueurs fluorescents pour détecter les embryons aneuploïdes et identifier les substances toxiques.

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Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement suivantes NIH ES020353 et le prix Colgate-Palmolive Alternative Research Grant pour avoir rendu ce travail possible.

1. Préparation des bactéries Alimentation NOTE: Cette section décrit la préparation de bactéries d&#39;alimentation (la souche de E. coli OP50). <ol><li> Isoler une seule colonie de E. coli souche OP50 à partir d&#39;un bouillon de lysogénie (LB) plaque de gélose et aseptique inoculer dans 300 ml de bouillon LB autoclave. </li><li> Laisser la culture inoculé à croître pendant une nuit dans un agitateur à 200 tpm et 37 ° C, jusqu&#39;à ce que la saturation soit atteinte. </li><li> Transférer le OP50 en 6 tubes de 50 ml coniques stériles, pré-pesées. Pellet les bactéries par centrifugation pendant 5 min à 6000 tpm (5000 xg). </li><li> Jeter le surnageant et laver les bactéries avec 50 ml d&#39;M9 stérile. Répéter deux fois. </li><li> Après le second lavage retirer le M9 restant, assurant qu&#39;aucun M9 est laissé dans le tube. </li><li> Déterminer le poids de la pastille par pesée du tube contenant le culot de bactéries et soustraire le poids du tube conique de 50 ml. </li><li> Reprendre le culot in M9 à une concentration de 100 mg / ml. </li><li> Conserver la solution de OP50 à 4 ° C jusqu&#39;à son utilisation pour la culture de la vis sans fin. </li></ol> 2. Préparation de nématodes croissance à moyen (NGM) des boîtes de Petri NOTE: Cette section décrit la préparation de plaques NGM Petri, qui sont les plaques où le C. vers elegans sont maintenues en routine en laboratoire. <ol><li> Autoclave le milieu de gélose NGM. </li><li> En utilisant des procédures stériles, distribuer 17 ml d&#39;une solution de gélose NGM dans des boîtes de Pétri de 6 cm en utilisant une pompe péristaltique. NOTE: Une quantité constante d&#39;agar dans les plaques réduit le besoin de recentrer le microscope lors du passage d&#39;une plaque à l&#39;autre. </li><li> Laisser les plaques à température ambiante pendant 2 à 3 jours avant utilisation pour laisser la gélose solidifier et permettre à l&#39;excès d&#39;humidité de se évaporer. </li><li> Ensemencer les plaques NGM en utilisant une technique stérile. Appliquer 1-2 gouttes de culture liquide OP50 et diffuser l&#39;aide d&#39;une tige de verre. Veillez à ne pasfaire passer le gazon bactérien tout le chemin vers les bords des plaques. </li><li> Laisser la pelouse OP50 à croître pendant 1-2 jours à la température ambiante avant d&#39;utiliser les plaques à croître vers. </li></ol> 3. Préparation d&#39;une population de Worm synchrone NOTE: Le cycle de vie de C. elegans est composé du stade embryonnaire, quatre stades larvaires (L1-L4) et l&#39;âge adulte. Cette section décrit la préparation d&#39;une population de vers l&#39;âge synchrone. Tous les matériaux entrant en contact avec C. elegans après le traitement de l&#39;eau de Javel doivent être stériles. <ol><li> Jour 1 - Préparation de gravides Worm population <ol><li> Utilisez des assiettes NGM dans lequel la majorité de la population de vers se compose de larves L1 affamés. </li><li> Recueillir les larves L1 avec un ver stérilisée ramasser et de les transférer au frais 6 cm de plaques NGM ensemencé avec OP50. Incuber pendant environ 65 heures à 20 ° C jusqu&#39;à ce que la majorité des vers adultes sont gravides. Àéviter plaque surpeuplement et permettent les vers de se développer sans épuiser les bactéries, ne pas transférer plus d&#39;un ou deux groupes de larves L1 à chaque plaque NGM frais. </li></ol></li><li> Jour 4 - Création d&#39;un synchronisée L1 larves population <ol><li> Recueillir les vers gravides des plaques NGM en les lavant avec 1-2 ml de M9 et de les transférer à un tube conique de 15 ml. </li><li> Laissez les vers gravides sédimentent au fond du tube de 15 ml conique pour environ 5-10 min. Eliminer le surnageant sans perturber le culot à vis sans fin. </li><li> Transférer le culot de ver 2-4 microtubes et ajouter 1 ml d&#39;eau de Javel / solution de NaOH. Incuber pendant 2-3 min à température ambiante. Surveillez la progression de la réaction sous la loupe binoculaire pour confirmer tous les vers sont morts. Ne pas blanchir plus de 5 min que les embryons pourraient mourir. </li><li> Recueillir les vers par centrifugation pendant 1 min à 3000 rpm (900 xg). Retirer le surnageant et ajouter 1 ml de M9 stérileneutraliser la réaction. </li><li> Laver les vers deux fois par centrifugation pendant 1 min à 3000 rpm (900 x g). </li><li> Retirer le surnageant et ajouter M9 jusqu&#39;à 100-200 ul. </li><li> En utilisant une pipette Pasteur en verre ajouter une goutte de la vis sans fin / M9 mélanger pour effacer plaques NGM et incuber pendant au moins 24 heures à 20 ° C pour permettre aux embryons éclosent. REMARQUE: Sans nourriture la croissance des larves sera arrêtée au stade L1. </li></ol></li><li> Jour 5 - Création d&#39;un synchronisée larves L4 population <ol><li> Recueillir les larves L1 à partir des plaques NGM claires par lavage des plaques avec 2.1 ml de M9 et les transférer dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Laissez les morts vers adultes sédiment au fond du tube conique de 15 ml pendant environ 5 min. </li><li> Recueillir le surnageant, où les vers sont L1, dans un nouveau tube conique de 15 ml, et précipiter les vers par centrifugation pendant 2 min à 2600 rpm (1000 xg). </li><li> Eliminer le surnageant leyant environ 500 pi. </li><li> Déterminer la concentration de la solution vers dans M9 en comptant le nombre de vers dans 10 ul de gouttes à l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope. Comptez au moins 5 gouttes. </li><li> Ajuster la concentration des vers à 20-25 vers / ul et ajouter 50 ul du ver / M9 mélange sur des plaques NGM ensemencés avec OP50. </li><li> Incuber pendant 65 heures à 15 ° C (pour l&#39;incubation à travers le week-end) pour permettre à la population synchronisée L1 à grandir jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le stade L4. </li></ol></li></ol> 4. Exposition de Worms à des produits chimiques dans les plaques à 96 puits NOTE: Cette section décrit l&#39;utilisation de Pxol1 :: rapporteur transcriptionnel GFP contenant C. souche elegans pour le dépistage de l&#39;induction de l&#39;aneuploïdie. <ol><li> Recueillir les larves L4 à partir des plaques NGM claires par lavage des plaques avec 2.1 ml de M9 et les transférer dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Laissez le L4 vers sédiments au fond de la15 ml tube conique de environ 5-10 min. Eliminer le surnageant sans perturber le culot à vis sans fin. </li><li> Ajouter 3-5 ml de M9 et déterminer la concentration de la solution vers dans M9 en comptant le nombre de vers dans 10 ul de gouttes à l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope. Comptez au moins 5 gouttes pour chaque échantillon. </li><li> Remettre en suspension les vers à une concentration de 1,000 / ml dans les vers M9. </li><li> Diluer les bactéries OP50 de l&#39;article 1 10 fois avec M9. Assurez-vous que les bactéries remises en suspension atteignent la température ambiante parce que la température inférieure affecte le développement du ver. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, d&#39;abord ajouter 100 ul du ver / M9 mélange (de l&#39;étape 4.4) et puis ajouter 400 pl des bactéries OP50 dilué (de l&#39;étape 4.5) pour chaque puits d&#39;une 2 ml ronde profonde de plaque de 96 puits à fond. À la fin, chaque puits aura 100 vers dans 500 pi. </li><li> Ajouter 0,5 ul de la substance d&#39;essai ou le contrôle approprié pour les puits souhaités, pour parvenir à une concentr finale suggéréation de 100 uM, une concentration couramment utilisé dans les écrans chimiques en C. elegans 12. Exposer l&#39;éthanol ou le DMSO témoins de solvant à une concentration finale de 0,1%. NOTE: Nous vous recommandons l&#39;utilisation de nocodazole (100 M) comme témoin positif. </li><li> Sceller la plaque avec un film adhésif. Ne oubliez pas de sceller la plaque bien de prévenir la contamination croisée entre les puits. </li><li> Envelopper la plaque avec une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Transférer la plaque à un agitateur (170 à 180 rpm) de la température appropriée pour la longueur de temps appropriée (24 ou 65 h). La température de la pièce affecte la croissance des vers; maintenir la température autour de 20 ° C. </li></ol> Acquisition 5. Image gravides Worms dans une plaque 384 puits NOTE: Cette section décrit l&#39;utilisation d&#39;un microscope à haute teneur à l&#39;image de la Pxol1 exposée :: vers GFP, de visualiser l&#39;expression de la GFP dans les embryons dans l&#39;utérus d&#39;hermaphrodites adultes. Pourchaque plaque 384 puits à cribler, utiliser des vers de plaques 4 x 96 puits. <ol><li> Après exposition aux produits chimiques dans le shaker, laissez la plaque à 96 puits de repos pendant 10-15 min pour permettre les vers adultes dans les sédiments au fond de la plaque. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, retirer 350 pi de la M9, ​​en faisant très attention à ne pas déranger les vers dans le fond de la plaque. </li><li> Laver les vers avec 1 ml de M9 et répétez l&#39;étape 5.1. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, retirez 1 ml de la M9, ​​étant Vey attention à ne pas déranger les vers dans le bas de la plaque. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, remettre en suspension les vers dans le M9 restante et de recueillir 100 pi du ver / M9 mélange des plaques à 96 puits et le charger dans les puits d&#39;une murs noirs / plaque de fond claire 384 puits. Répétez le processus en utilisant les vers de plaques 4 x 96 puits, jusqu&#39;à ce que tous les puits de la plaque 384 puits ont été chargés. NOTE: Il est important pour tous les puits d&#39;avoir le même volume pour augmenter lal&#39;efficacité et la rapidité de la mise au point automatique pendant le processus d&#39;acquisition d&#39;image. Chaque puits doit contenir entre 80 à 100 vers. </li><li> Ajouter 1 ul de lévamisole (100 M) à chaque puits et laisser les vers incuber pendant environ 30 min. REMARQUE: lévamisole agit comme un agoniste du récepteur de l&#39;acétylcholine et immobilise les vers. </li><li> Transférer la plaque à un microscope haute teneur grand champ capable de fournir l&#39;imagerie automatisée. </li><li> Pour l&#39;acquisition de l&#39;image, utiliser une acquisition et d&#39;analyse d&#39;image logiciel teneur élevée selon les directives du fabricant. Sélectionnez l&#39;objectif 4X pour acquérir une image par bien. </li><li> Avant de commencer l&#39;acquisition de l&#39;image, réglez les paramètres d&#39;imagerie de la GFP à 45 ms de l&#39;exposition et de la résolution de 2160 x image pour 2160. </li><li> Recueillir les données que le nombre de vers GFP-positives divisé par le nombre total de vers dans le puits, cette dernière mesure étant relativement constante entre les puits. </li></ol>

<ol><li>Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from:
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<li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li>
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<li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La méthode décrite ici constitue la première stratégie de grande échelle pour l&#39;identification de substances toxiques de la lignée germinale. Il nécessite l&#39;utilisation d&#39;un transgénique GFP Pxol-1 :: GFP contenant la souche qui rend fidèlement l&#39;induction de l&#39;aneuploïdie dans les embryons précoces qui est utilisé comme un proxy pour le dysfonctionnement de la lignée germinale. La méthode implique la synchronisation minutieuse d&#39;un C. elegans population de vers et de l&#39;expo...

Il ya environ 87 000 produits chimiques inscrits pour le commerce aux États-Unis, mais seulement un petit nombre d&#39;entre eux ont été testé pour ses effets potentiels sur la santé 1. Parmi ceux qui ont été testés, seule une partie a été évalué pour les effets sur la santé de la reproduction en partie à cause de la difficulté à déterminer l&#39;altération des événements reproduction début chez les mammifères, en particulier au cours du développement des cellules germinales femelles et la différenciation. En effet, les premiers événements méiotiques ont lieu pendant les premiers stades du développement embryonnaire chez les mammifères femelles et sont donc difficiles d&#39;accès et se accumuler dans les numéros appropriés à des fins de dépistage. La lignée germinale fournit le lien crucial entre les générations, et sa fonction appropriée dépend de l&#39;exécution précise du programme complexe de la division cellulaire et chromosomique appelée méiose. Le dérèglement du processus méiotique peut provoquer une réduction de la fertilité et de la productiongamètes et des embryons avec un nombre anormal de chromosomes, un état appelé aneuploïdie. Chromosomiques erreurs de ségrégation dans la méiose sont très pertinents pour la santé humaine. Les anomalies chromosomiques sont communs, avec une fréquence de 1 à 150 naissances vivantes, la trisomie 21, 18 et 13 ainsi que chromosomes X et Y étant les erreurs types les plus répandus 2,3. En outre, les malformations congénitales, y compris ceux d&#39;origine chromosomiques, sont la principale cause de mortalité infantile aux États-Unis 4 L&#39;idée que les influences environnementales peuvent affecter la ségrégation et le comportement chromosomique ne est pas nouveau 5, mais est encore mal comprise. Il est donc crucial pour enquêter sur laquelle des produits chimiques introduits dans notre environnement sont interférer avec la fertilité humaine, le développement des jeunes et la santé reproductive en général. À la lumière de ces limites des modèles de mammifères, nous avons développé un test de l&#39;écran à haut débit pour tester la toxicité de la reproduction dans le ascaris &lt;em&gt; C. elegans. Nous avons mobilisé plusieurs caractéristiques importantes offertes par ce système de modèle génétique communément employés comme sa petite taille, à faible coût, cycle de reproduction court, forte proportion de cellules germinales et la facilité de manipulation 6. Worms peuvent être cultivées dans des plaques à 96 puits ou dans des cultures liquides à volume élevé et à cause de leur transparence peuvent être directement visualisés sur des plaques pour la détection des journalistes fluorescentes. Le test décrit ci-dessous tire profit de ces caractéristiques et profite d&#39;une souche du ver contenant le rapporteur fluorescent Pxol-1 :: GFP pour détecter la perturbation lignée germinale et l&#39;induction de l&#39;aneuploïdie embryonnaire. L&#39;utilisation de cette souche rapporteur est basé sur la présence des hommes généralement rares dans une population de vers principalement hermaphrodite. Ces mâles (&lt;0,2%) proviennent naturellement de l&#39;erreur dans la ségrégation du chromosome X 7. Cependant, comme la perturbation de la lignée germinale conduit souvent à des erreurs dans la ségrégation des autosomeset hétérochromosomes, il est corrélé à la fois avec une incidence élevée de mâles phénotype (X mauvaise ségrégation) ainsi que la létalité embryonnaire (autosome de mauvaise ségrégation). Pour détecter facilement l&#39;induction des hommes tout en contournant la question de la mortalité embryonnaire, un promoteur spécifique mâle (xol-1) est utilisé pour diriger l&#39;expression de la GFP dans les embryons précoces encore contenues dans l&#39;utérus de la vis sans fin. En tant que tel, l&#39;apparition d&#39;embryons exprimant la GFP est utilisée comme indicateur de la présence d&#39;embryons aneuploïdes. Cette méthode a déjà été utilisée pour identifier les gènes impliqués dans le maintien de la lignée germinale et la méiose 8,9. Adapté au dépistage chimique, cette souche est employé dans un milieu à l&#39;écran à haut débit. Surtout, la souche rapporte fidèlement la aneugenicity de produits chimiques et est donc pertinent de paramètres de la reproduction des mammifères 10. L&#39;essai décrit ici sera particulièrement utile pour les toxicologues dans les milieux de l&#39;industrie pharmaceutique et chimique à la recherched&#39;évaluer rapidement la toxicité des produits chimiques sur les effets sur la reproduction. En outre, ce test se aligne pleinement avec les priorités gouvernementales mises en évidence dans la toxicité dans le 21 e rapport de 11 siècle.

<table><tbody><tr><td>60 mm Ventilée, arête vive Boîtes de Pétri</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Apex</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96 puits ronds clairs clairs 2 ml plaque à puits profond en polypropylène</td><td>Corning</td><td>P-DW-20-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Apex</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Centre</td><td></td> <td>de génétique Caenorhabditis<a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc » target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Éthanol 200 proof</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 plaques puits</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS System</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de lévamisole</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium anhydre (MgSO4)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress Acquisition d’images à haut contenu & Logiciel d’analyse</td><td>Dispositifs</td><td></td><td></td>moléculaires</tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Films de rayonne pour cultures biologiques</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Ce microscope a un grossissement total de 3,35X à 300X. N’importe quel microscope ayant des caractéristiques similaires fonctionnera.</td></tr><tr><td>TY2441 C. elegans, Pxol-1 ::GFP souche rapporteuse</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc » target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique utilisation du nématode<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

L&#39;identification de la toxicité pour la reproduction des milliers de produits chimiques présents dans notre environnement a été l&#39;un des défis les plus alléchantes dans le domaine de la santé environnementale. Cela est dû en partie à la rareté des systèmes modèles qui peuvent (1) récapituler précision touches caractéristiques des processus de reproduction et (2) le font dans un moyen à la mode à haut débit, sans la nécessité d&#39;un grand nombre d&#39;animaux vertébrés. Nous décrivons ici un essai chez le nématode C. elegans qui permet l&#39;identification rapide des substances toxiques de la lignée germinale en surveillant l&#39;induction d&#39;embryons aneuploïdes. En faisant usage d&#39;une ligne rapporteur GFP, des erreurs dans la ségrégation des chromosomes résultant de la perturbation de la lignée germinale sont facilement visualisés et quantifiés par microscopie à fluorescence automatisé. Ainsi, la projection d&#39;un ensemble particulier de composés pour sa toxicité peut être effectuée dans un format de plaque à 96 384 puits dans une affaire de jours. Une analyse secondaire des h positifsa peut être effectuée pour déterminer si les anomalies chromosomiques provenaient de la perturbation de la méiose ou de début erreurs chromosome de ségrégation embryonnaires. Au total, ce test représente une stratégie de premier passage rapide pour l&#39;évaluation rapide de la dysfonction de la lignée germinale suite d&#39;une exposition chimique.

L&#39;exposition de la Pxol-1 :: GFP souche rapporteuse à des agents chimiques tels que les microtubules poison nocodazole (figure 1) conduit à l&#39;induction d&#39;une forte proportion d&#39;embryons exprimant la GFP dans l&#39;utérus d&#39;hermaphrodites adultes exposés par rapport à un témoin de DMSO. Les embryons GFP-positives sont significativement plus lumineux que le fond faible fluorescence observé dans d&#39;autres embryons ainsi que l&#39;auto-fluorescence observée dans l&#39;intesti...

Nous décrivons les étapes détaillées d’un dosage chimique à haut débit chez le nématode Caenorhabditis elegans utilisé pour évaluer la toxicité germinale. Dans cet essai, la perturbation de la fonction germinale suite à une exposition à un produit chimique est surveillée à l’aide d’un rapporteur fluorescent spécifique aux embryons aneuploïdes.

Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique Utilisation du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer de manière exhaustive la toxicité chimique germinale à l'aide du nématode Caenorhabditis elegans. Cette évaluation est réalisée en synchronisant d'abord les vers en ajoutant une solution d'eau de Javel diluée à une population de vers à stades mixtes de la souche C. elegans PX4781 GFP. Cette étape permet d'obtenir un grand nombre d'embryons protégés de l'eau de Javel par leur enveloppe œuf.La deuxième étape consiste à générer une population synchronisée de larves L1 en laissant les embryons éclore dans un liquide sans nourriture. Ensuite, les vers grandissent jusqu'à leur quatrième stade larvaire, ou L4, moment auquel ils sont exposés aux composés d'intérêt en milieu liquide pendant 65 heures. La dernière étape est la visualisation, par microscopie à fluorescence, de l'expression des rapporteurs GFP dans les embryons situés à l'intérieur de l'utérus des vers.En fin de compte, la proportion d'embryons positifs pour la GFP par rapport au témoin DMSO reflète l'antigénicité des composés testés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les modèles de Rodin ou les tests en culture cellulaire, est que nous pouvons évaluer la génotoxicité et la toxicité germinale des produits chimiques dans un modèle animal entier tout en réalisant simultanément un test à haut débit lors de la procédure. Aujourd'hui, ce sera la boursière postdoctorale Dr. Daniella Perotti.Les vers graphiques pour cette procédure ont été préparés précédemment comme décrit dans le texte du protocole associé. Ramasser les vers GR à partir du milieu de croissance pour nématodes ou des boîtes de milieu NGM en les lavant avec un à deux millilitres de M neuf, puis les transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Laisser les vers GR sédimenter au fond du tube conique de 15 millilitres pendant environ cinq à dix minutes. Ensuite, retirer le surnageant sans perturber le culot de vers.Transférez le culot de vers vers deux à quatre tubes de microcentrifugeuse et ajoutez un millilitre de solution de javel diluée dans chaque tube. Incubez deux à trois minutes à température ambiante. Surveillez l'évolution de la réaction au microscope stéréo afin de confirmer que tous les vers sont morts.Ne pas laisser agir l'eau de Javel plus de cinq minutes, car les embryons pourraient mourir. Ramasser les vers par centrifugation pendant une minute, à 3000 tr/min.Éliminer le surnageant et ajouter un millilitre de M neuf stérile pour neutraliser la réaction. S'assurer que tous les matériaux entrant en contact avec les vers après le traitement à l'eau de Javel sont stériles. Laver les vers deux fois avec le milieu M neuf.Éliminer le surnageant et ajouter du M neuf à 100 à 200 microlitres. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, ajouter une goutte du mélange de vers dans du M neuf sur des plaques NGM claires et incuber pendant au moins 24 heures à 20 degrés Celsius pour permettre l’éclosion des embryons en l’absence de nourriture. La croissance des larves sera arrêtée au stade L1. Deux étapes de synchronisation.Le blanchiment et la privation en acide aminé L sont utilisés parce qu'il est essentiel d'obtenir une population larvaire très synchronisée afin de maximiser le nombre de larves L4 qui seront utilisées pour l'exposition. Un jour après l'obtention d'une population synchronisée de larves L1, récupérez les larves L1 à partir des boîtes NGM claires. Lavez les boîtes avec un à deux millilitres de M9 et transférez les larves L1 dans un tube conique de 15 millilitres.Laisser les vers adultes morts sédimenter au fond du tube conique de 15 millilitres pendant environ cinq minutes. Recueillir le surnageant contenant les vers L1 dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Précipiter les vers par centrifugation pendant deux minutes à 2 600 tr/min.Éliminer le surnageant en laissant environ 500 microlitres. Déterminer la concentration de vers dans la solution M neuf en comptant le nombre de vers dans des gouttes de 10 microlitres. À l’aide d’un microscope stéréo, compter au moins cinq gouttes.Ajustez la concentration des vers à 20 à 25 vers par microlitre dans du M nine, puis ajoutez 50 microlitres du mélange de vers dans du M nine sur des plaques NGM. Ensemencées avec la souche bactérienne OP50 servant d'aliment, incubez pendant 65 heures à 15 degrés Celsius afin de permettre à la population synchronisée au stade L1 de croître jusqu'au stade L4. Cet écran utilise une souche CL présentant un rapporteur transcriptionnel fluorescent pour détecter les perturbations de la lignée germinale et l'induction d'une aneuploïdie embryonnaire.Prélevez les quatre larves L4 à partir des plaques NGM claires en lavant les plaques avec un à deux millilitres de M9, puis transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Laissez les vers L4 sédimenter au fond du tube conique de 15 millilitres pendant environ cinq à dix minutes. Ensuite, retirez le surnageant sans perturber le culot de vers.Ajoutez trois à cinq millilitres de M neuf et déterminez la concentration de vers dans la solution M neuf en comptant le nombre de vers dans des gouttes de 10 microlitres. À l’aide d’un microscope stéréo, comptez au moins cinq gouttes pour chaque échantillon. Resuspendez les vers à une concentration d’un ver par millilitre dans du M neuf.Diluez dix fois les bactéries OP 50 préparées précédemment avec du M nine. Veillez à ce que les bactéries resuspendues atteignent la température ambiante, car des températures plus basses affectent le développement des vers. À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez d’abord 100 microlitres du mélange de vers en M nine dans chaque puits d’une plaque 96 puits profonde de 2 millilitres à fond rond. Ensuite, ajoutez enfin 400 microlitres des bactéries OP 50 diluées dans chaque puits.Chaque puits contiendra 100 vers dans 500 microlitres. Ajouter 0,5 microlitre de la substance testée dans les puits souhaités afin d'obtenir une concentration finale de 100 micromolaire. Une concentration couramment utilisée dans les criblages chimiques chez C. elegans consiste à exposer des témoins de solvant éthanol ou DMSO à une concentration finale de 0,1 % comme témoin positif.Utilisez 100 micromolaire sans cosolvant. Scellez la plaque à l’aide d’un film adhésif. Veillez à bien sceller la plaque afin d’éviter toute contamination croisée entre les puits.Enveloppez la plaque avec du papier d'aluminium. Transférez la plaque dans un agitateur à la température appropriée pendant une durée adéquate. Maintenez la température ambiante aux alentours de 20 degrés Celsius, car la température influence la croissance des vers à l'issue de l'exposition chimique dans l'agitateur.Laisser reposer les plaques de 96 puits pendant 10 à 15 minutes afin de permettre aux vers adultes de sédimenter au fond de la plaque à l’aide d’une pipette multipuits. Retirer 350 microlitres du milieu M neuf de chaque puits en prenant soin de ne pas déranger les vers au fond de la plaque. Laver les vers avec un millilitre de milieu M neuf et laisser à nouveau reposer la plaque pendant 10 à 15 minutes pour permettre aux vers adultes de sédimenter au fond.Retirer un millilitre de M neuf de chaque puits en faisant très attention de ne pas déranger les vers au fond de la plaque. Resuspendre les vers dans le M neuf restant. Prélever 100 microlitres du mélange de vers dans le M neuf à partir de la plaque 96 puits et les déposer dans les puits d'une plaque 384 puits à parois noires et fond transparent.Répétez le processus en utilisant des vers provenant de 4 plaques de 96 puits jusqu'à ce que tous les puits de la plaque de 384 puits soient remplis. Il est important que tous les puits aient le même volume afin d'augmenter l'efficacité et la vitesse de la mise au point automatique pendant le processus d'acquisition d'images. Ensuite, ajoutez un microlitre de lale dans chaque puit et laissez les vers s'incuber pendant environ 30 minutes.Lale agit comme un agoniste du récepteur de l'acétylcholine et immobilise les vers ; transférez la plaque vers un microscope à champ large à contenu élevé capable de fournir une imagerie automatisée. Utilisez un logiciel d'acquisition et d'analyse d'images à contenu élevé conformément aux instructions du fabricant. Sélectionnez l'objectif 4 x pour acquérir une image par.Réglez les paramètres d’imagerie de la GFP sur un temps d’exposition de 45 millisecondes et une résolution d’image de 2160 par 2160. Commencez l’acquisition d’images : les vers exposés sont directement imagés dans des plaques de 384 puits. Le nombre de vers contenant au moins un embryon positif pour la GFP est compté pour chaque puits et normalisé par rapport au nombre total de vers dans ce puits, comme indiqué ici.L'exposition à des agents chimiques tels que le poison des microtubules no-code AOL conduit à l'induction d'une forte proportion d'embryons exprimant la GFP par rapport au témoin DMSO. Les embryons positifs pour la GFP sont nettement plus brillants que la faible fluorescence de fond observée dans d'autres embryons, ainsi que la fluorescence autofluorescente observée dans l'intestin des animaux. La flèche rouge indique des embryons positifs pour la GFP clairement visibles dans l'utérus d'un vers traité au no-code AOL.Après cette procédure, d'autres méthodes peuvent être réalisées, comme la coloration de l'ADN des vers afin d'obtenir une analyse plus détaillée de l'effet des produits chimiques sur la lignée germinale. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la toxicologie d'évaluer rapidement la toxicité reproductive et la toxicité pour la lignée germinale des composés chimiques.

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