Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique Utilisation du nématode

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer de manière exhaustive la toxicité chimique germinale à l'aide du nématode Caenorhabditis elegans. Cette évaluation est réalisée en synchronisant d'abord les vers en ajoutant une solution d'eau de Javel diluée à une population de vers à stades mixtes de la souche C. elegans PX4781 GFP. Cette étape permet d'obtenir un grand nombre d'embryons protégés de l'eau de Javel par leur enveloppe œuf.

La deuxième étape consiste à générer une population synchronisée de larves L1 en laissant les embryons éclore dans un liquide sans nourriture. Ensuite, les vers grandissent jusqu'à leur quatrième stade larvaire, ou L4, moment auquel ils sont exposés aux composés d'intérêt en milieu liquide pendant 65 heures. La dernière étape est la visualisation, par microscopie à fluorescence, de l'expression des rapporteurs GFP dans les embryons situés à l'intérieur de l'utérus des vers.

En fin de compte, la proportion d'embryons positifs pour la GFP par rapport au témoin DMSO reflète l'antigénicité des composés testés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les modèles de Rodin ou les tests en culture cellulaire, est que nous pouvons évaluer la génotoxicité et la toxicité germinale des produits chimiques dans un modèle animal entier tout en réalisant simultanément un test à haut débit lors de la procédure. Aujourd'hui, ce sera la boursière postdoctorale Dr. Daniella Perotti.

Les vers graphiques pour cette procédure ont été préparés précédemment comme décrit dans le texte du protocole associé. Ramasser les vers GR à partir du milieu de croissance pour nématodes ou des boîtes de milieu NGM en les lavant avec un à deux millilitres de M neuf, puis les transférer dans un tube conique de 15 millilitres. Laisser les vers GR sédimenter au fond du tube conique de 15 millilitres pendant environ cinq à dix minutes. Ensuite, retirer le surnageant sans perturber le culot de vers.

Transférez le culot de vers vers deux à quatre tubes de microcentrifugeuse et ajoutez un millilitre de solution de javel diluée dans chaque tube. Incubez deux à trois minutes à température ambiante. Surveillez l'évolution de la réaction au microscope stéréo afin de confirmer que tous les vers sont morts.

Ne pas laisser agir l'eau de Javel plus de cinq minutes, car les embryons pourraient mourir. Ramasser les vers par centrifugation pendant une minute, à 3000 tr/min.

Éliminer le surnageant et ajouter un millilitre de M neuf stérile pour neutraliser la réaction. S'assurer que tous les matériaux entrant en contact avec les vers après le traitement à l'eau de Javel sont stériles. Laver les vers deux fois avec le milieu M neuf.

Éliminer le surnageant et ajouter du M neuf à 100 à 200 microlitres. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, ajouter une goutte du mélange de vers dans du M neuf sur des plaques NGM claires et incuber pendant au moins 24 heures à 20 degrés Celsius pour permettre l’éclosion des embryons en l’absence de nourriture. La croissance des larves sera arrêtée au stade L1. Deux étapes de synchronisation.

Le blanchiment et la privation en acide aminé L sont utilisés parce qu'il est essentiel d'obtenir une population larvaire très synchronisée afin de maximiser le nombre de larves L4 qui seront utilisées pour l'exposition. Un jour après l'obtention d'une population synchronisée de larves L1, récupérez les larves L1 à partir des boîtes NGM claires. Lavez les boîtes avec un à deux millilitres de M9 et transférez les larves L1 dans un tube conique de 15 millilitres.

Laisser les vers adultes morts sédimenter au fond du tube conique de 15 millilitres pendant environ cinq minutes. Recueillir le surnageant contenant les vers L1 dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Précipiter les vers par centrifugation pendant deux minutes à 2 600 tr/min.

Éliminer le surnageant en laissant environ 500 microlitres. Déterminer la concentration de vers dans la solution M neuf en comptant le nombre de vers dans des gouttes de 10 microlitres. À l’aide d’un microscope stéréo, compter au moins cinq gouttes.

Ajustez la concentration des vers à 20 à 25 vers par microlitre dans du M nine, puis ajoutez 50 microlitres du mélange de vers dans du M nine sur des plaques NGM. Ensemencées avec la souche bactérienne OP50 servant d'aliment, incubez pendant 65 heures à 15 degrés Celsius afin de permettre à la population synchronisée au stade L1 de croître jusqu'au stade L4. Cet écran utilise une souche CL présentant un rapporteur transcriptionnel fluorescent pour détecter les perturbations de la lignée germinale et l'induction d'une aneuploïdie embryonnaire.

Prélevez les quatre larves L4 à partir des plaques NGM claires en lavant les plaques avec un à deux millilitres de M9, puis transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Laissez les vers L4 sédimenter au fond du tube conique de 15 millilitres pendant environ cinq à dix minutes. Ensuite, retirez le surnageant sans perturber le culot de vers.

Ajoutez trois à cinq millilitres de M neuf et déterminez la concentration de vers dans la solution M neuf en comptant le nombre de vers dans des gouttes de 10 microlitres. À l’aide d’un microscope stéréo, comptez au moins cinq gouttes pour chaque échantillon. Resuspendez les vers à une concentration d’un ver par millilitre dans du M neuf.

Diluez dix fois les bactéries OP 50 préparées précédemment avec du M nine. Veillez à ce que les bactéries resuspendues atteignent la température ambiante, car des températures plus basses affectent le développement des vers. À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez d’abord 100 microlitres du mélange de vers en M nine dans chaque puits d’une plaque 96 puits profonde de 2 millilitres à fond rond. Ensuite, ajoutez enfin 400 microlitres des bactéries OP 50 diluées dans chaque puits.

Chaque puits contiendra 100 vers dans 500 microlitres. Ajouter 0,5 microlitre de la substance testée dans les puits souhaités afin d'obtenir une concentration finale de 100 micromolaire. Une concentration couramment utilisée dans les criblages chimiques chez C. elegans consiste à exposer des témoins de solvant éthanol ou DMSO à une concentration finale de 0,1 % comme témoin positif.

Utilisez 100 micromolaire sans cosolvant. Scellez la plaque à l’aide d’un film adhésif. Veillez à bien sceller la plaque afin d’éviter toute contamination croisée entre les puits.

Enveloppez la plaque avec du papier d'aluminium. Transférez la plaque dans un agitateur à la température appropriée pendant une durée adéquate. Maintenez la température ambiante aux alentours de 20 degrés Celsius, car la température influence la croissance des vers à l'issue de l'exposition chimique dans l'agitateur.

Laisser reposer les plaques de 96 puits pendant 10 à 15 minutes afin de permettre aux vers adultes de sédimenter au fond de la plaque à l’aide d’une pipette multipuits. Retirer 350 microlitres du milieu M neuf de chaque puits en prenant soin de ne pas déranger les vers au fond de la plaque. Laver les vers avec un millilitre de milieu M neuf et laisser à nouveau reposer la plaque pendant 10 à 15 minutes pour permettre aux vers adultes de sédimenter au fond.

Retirer un millilitre de M neuf de chaque puits en faisant très attention de ne pas déranger les vers au fond de la plaque. Resuspendre les vers dans le M neuf restant. Prélever 100 microlitres du mélange de vers dans le M neuf à partir de la plaque 96 puits et les déposer dans les puits d'une plaque 384 puits à parois noires et fond transparent.

Répétez le processus en utilisant des vers provenant de 4 plaques de 96 puits jusqu'à ce que tous les puits de la plaque de 384 puits soient remplis. Il est important que tous les puits aient le même volume afin d'augmenter l'efficacité et la vitesse de la mise au point automatique pendant le processus d'acquisition d'images. Ensuite, ajoutez un microlitre de lale dans chaque puit et laissez les vers s'incuber pendant environ 30 minutes.

Lale agit comme un agoniste du récepteur de l'acétylcholine et immobilise les vers ; transférez la plaque vers un microscope à champ large à contenu élevé capable de fournir une imagerie automatisée. Utilisez un logiciel d'acquisition et d'analyse d'images à contenu élevé conformément aux instructions du fabricant. Sélectionnez l'objectif 4 x pour acquérir une image par.

Réglez les paramètres d’imagerie de la GFP sur un temps d’exposition de 45 millisecondes et une résolution d’image de 2160 par 2160. Commencez l’acquisition d’images : les vers exposés sont directement imagés dans des plaques de 384 puits. Le nombre de vers contenant au moins un embryon positif pour la GFP est compté pour chaque puits et normalisé par rapport au nombre total de vers dans ce puits, comme indiqué ici.

L'exposition à des agents chimiques tels que le poison des microtubules no-code AOL conduit à l'induction d'une forte proportion d'embryons exprimant la GFP par rapport au témoin DMSO. Les embryons positifs pour la GFP sont nettement plus brillants que la faible fluorescence de fond observée dans d'autres embryons, ainsi que la fluorescence autofluorescente observée dans l'intestin des animaux. La flèche rouge indique des embryons positifs pour la GFP clairement visibles dans l'utérus d'un vers traité au no-code AOL.

Après cette procédure, d'autres méthodes peuvent être réalisées, comme la coloration de l'ADN des vers afin d'obtenir une analyse plus détaillée de l'effet des produits chimiques sur la lignée germinale. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la toxicologie d'évaluer rapidement la toxicité reproductive et la toxicité pour la lignée germinale des composés chimiques.