Utilisant le virus adéno-associé comme un outil pour étudier les obstacles dans la maladie de la rétine

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la perméabilité de la barrière hématorétinienne et l'intégrité de la membrane limitante interne dans des modèles animaux de maladies rétiniennes. Cela est réalisé en injectant d'abord des particules de virus AAV contenant un transgène GFP dans le vitré ou dans la circulation sanguine. La deuxième étape consiste à prélever des échantillons sanguins à différents moments après les injections.

Le prélèvement sanguin est complété par une imagerie du fond de l'œil in vivo effectuée chaque semaine. La dernière étape consiste à réaliser une immunohistochimie sur des montages plats de la rétine et sur des cryosections rétiniennes. Enfin, la microscopie confocale et la PCR sont utilisées pour révéler le motif de transduction, indicateur de l'intégrité de la membrane limitante interne, ainsi que pour détecter la présence de particules d'AAV dans la circulation sanguine, démontrant ainsi la perméabilité de la barrière hématorétinienne.

Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes est que la méthode d'application de l'AAV fournit des informations sur la perméabilité de la barrière hématorétinienne qui ne sont pas accessibles avec d'autres cellules. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie génique médiée par l'AAV, car elle permet de s'assurer de la perméabilité de la barrière hématorétinienne aux particules d'AAV, évitant ainsi tout effet secondaire indésirable. Cette méthode peut fournir des informations sur l'intégrité de la membrane limitante interne dans des modèles animaux d'autres maladies rétiniennes, comme chez les rats diabétiques.

L'idée de cette méthode nous est d'abord venue lorsque nous avons observé que la rétine de notre modèle de souris DP 71 nulle, présentant une rupture de la barrière hématorétinienne, était transduite plus efficacement que la rétine de type sauvage.

Commencez par anesthésier des souris C-57 black-six J. Vérifiez la perte de trois réflexes : le réflexe d’orientation, le réflexe de retrait et la réponse à la pincée de la queue.

La perte de ces réflexes confirme l'anesthésie. Ensuite, dilater les pupilles en appliquant du néosynéphrine à 5 % et du mydriaticum à 0,5 % sur la cornée à l’aide d’un compte-gouttes. Puis utiliser une pommade vétérinaire pour lubrifier les yeux afin qu’ils ne s’assèchent pas trop. Chargement maintenant d’une aiguille jetable ultrafine de calibre 30 avec une solution mère contenant de un à quatre fois 10 à la puissance 11 particules d’AAV-GFP.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car elles doivent réaliser une injection intravitréenne aussi sûre que possible sans toucher le cristallin ni la rétine. Insérez ensuite une aiguille jetable ultrafine de calibre 30 à travers l'équateur et à proximité du limbe jusqu'à la cavité vitréenne. Après avoir introduit l'aiguille dans l'œil, injectez un microlitre de solution tout en observant l'aiguille au centre de la cavité vitréenne.

Utilisez un œil comme témoin pour les expériences sur la membrane limitante interne et injectez les deux yeux pour les expériences sur la barrière hématorétinienne. Après l'injection, appliquez un traitement topique anti-inflammatoire et antibactérien à chaque œil injecté. Une semaine plus tard, dilatez les pupilles avec de la néosynéphrine et du mydriaticum, puis effectuez des examens du fond d'œil à l’aide d’une caméra de fond d’œil.

Suivez l'expression de la GFP par des observations effectuées une semaine, deux semaines, un mois et deux mois après l'injection. Après avoir prélevé les yeux d'un animal injecté euthanasié, disséquez les yeux pour enlever le cristallin et la cornée. Ensuite, fixez par immersion l'œil disséqué dans du paraformaldéhyde 4 % pendant une heure. Après une heure, protégez les yeux par cryo-protection dans du saccharose 10 % pendant une autre heure à température ambiante. Puis, faites tremper les yeux dans du saccharose 20 % pendant un tiers d'heure à température ambiante.

Enfin, laissez les yeux dans une solution de saccharose à 30 % pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, incluez et congélez les cupules oculaires dans une résine d'inclusion telle que la matrice cryo. Ensuite, à l'aide du cryostat, réalisez des coupes de 10 micromètres et montez-les sur des lames préparées pour les tissus congelés.

Perméabilisez maintenant les sections sur les lames avec un détergent pendant cinq minutes. Effectuez ensuite deux lavages rapides dans le PBS. Bloquez ensuite les yeux pendant une heure à température ambiante.

Pour les montages plats de rétine, facilitez la dissection en fixant les yeux énucléés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 à 30 minutes. Cette fixation, ainsi que celle suivant la dissection, doivent être effectuées correctement, car elles sont essentielles pour préserver la fluorescence de la GFP. Après une période de fixation de 15 à 30 minutes, disséquez les yeux, retirez la cornée et le cristallin.

Séparez la rétine de l'épithélium pigmentaire rétinien et de la sclérotique en découpant autour de l'ora serrata et du nerf optique. Après la dissection, immergez les rétines dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant encore 30 minutes afin de fixer le tissu et la protéine fluorescente dans les cellules rétiniennes transduites. Après la fixation, lavez l'échantillon pendant cinq minutes dans du PBS stérile à pH 7,4.

Ensuite, remplacer le PBS par le tampon de blocage et incuber les rétines pendant quatre heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Commencer l'étape de marquage en incubant les échantillons avec les anticorps primaires dans le tampon de blocage pendant quatre heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l'application de l'anticorps primaire, laver les tissus trois fois avec du PBS, puis incuber les tissus dans une dilution au 1/500 d'anticorps conjugués à la fluorochrome Alexa dans le tampon de blocage.

Incuber pendant une heure pour les cryosections ou deux heures pour les montages plats. Effectuer cette étape à température ambiante et protéger de la lumière. Après l'application du second anticorps, l'éliminer par trois lavages au PBS, comme précédemment.

Effectuez maintenant des incisions de détente dans la rétine afin de pouvoir la monter à plat sur une lame de verre, avec soit les photorécepteurs, soit les cellules ganglionnaires de la rétine orientées vers le haut. Appliquez un milieu de montage aqueux et une lamelle. Les lames peuvent être conservées à quatre degrés Celsius avant l’imagerie en microscopie confocale.

Commencez par générer un contrôle positif pour les particules d'AAV circulantes. Prélevez d'abord un échantillon sanguin de 10 à 20 microlitres avant l'injection de l'AAV. Ensuite, une fois l'animal anesthésié, injectez 100 microlitres de la solution virale stock dans la circulation sanguine.

Le moyen le plus simple d'injecter des substances dans la circulation sanguine est la veine pénienne. Dans cet enregistrement vidéo, nous injectons un colorant bleu comme témoin visuel de l'injection. Pendant les trois jours suivants, continuez à prélever périodiquement de petites échantillons de sang, puis sacrifiez la souris. À partir d'un échantillon de tissu, extrayez l'ADN génomique des prélèvements à l'aide d'un kit commercial ; à l'aide de l'ADN obtenu, effectuez une amplification par PCR avec une paire d'amorces ciblant GFP. Effectuez 30 cycles avec des extensions de 45 secondes et un appariement à 55 degrés Celsius. On s'attendait à ce que le profil de transduction du vecteur SHH 10 augmente chez les souris DP 71 nulles. Si le modèle animal présentait des perturbations dans la structure de la membrane limitante interne, les souris DP 71 nulles présenteraient des barrières rétiniennes altérées et constitueraient donc une comparaison utile : l'injection intravitréenne de SHH 10 cible plus efficacement les cellules gliales de Müller chez les souris DP 71 nulles.

Ceci indique une instabilité de la membrane limitante interne dans cette lignée de souris transgénique par rapport aux témoins de type sauvage. L'injection d'AAV5-GFP a également démontré une perméabilité de la membrane limitante interne. L'AAV5 s'est révélé inefficace par injection intravitréenne chez les souris de type sauvage, mais est devenu fortement efficace pour la livraison de gènes aux photorécepteurs chez les souris présentant des barrières rétiniennes altérées, comme les souris DP71 nulles.

Par analyse PCR, la barrière hématorétinienne des souris déficientes en DP71 reste sélective aux particules AAV, puisqu'aucune trace d'AAV n'a été détectée dans leurs échantillons sanguins après injection intravitréenne. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser le virus associé à l'adénovirus afin d'évaluer l'intégrité de la membrane limitante interne ou la perméabilité de la barrière hématorétinienne, en analysant le profil de transduction de la rétine ou la présence de particules AAV dans la circulation sanguine.