Caractérisation fonctionnelle de Na ⁺ / H ⁺ Echangeurs de intracellulaire Compartiments utilisant la sélection Proton-tuant les exprimer à la membrane plasmique

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer l’activité d’échangeurs de protons sodiques exprimés intracellulairement. Ceci est réalisé en sélectionnant d’abord les cellules qui expriment les échangeurs de protons sodiques intracellulaires au niveau de la membrane plasmique par sélection de destruction de protons. Dans un deuxième temps, les cellules sélectionnées sont acidifiées, puis la récupération du pH intracellulaire est mesurée pour confirmer l’activité d’échange de protons sodiques des cellules.

La cinétique rapide du transport des ions est ensuite mesurée pour déterminer les constantes d’affinité pour le cation transporté et les inhibiteurs. En fin de compte, le suivi des changements du pH intracellulaire et de la cinétique rapide des cellules somatiques sélectionnées permet la caractérisation fonctionnelle de l’échange de protéines intracellulaires. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’expression de transporteurs mutants ou l’utilisation de cellules per, est qu’elle permet l’expression de transporteurs intracellulaires de type blanc au niveau de la membrane plasmique, ce qui permet de mesurer directement leur fonction.

La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Mallory Poet, un chercheur scientifique de mon laboratoire, pour commencer la procédure de destruction des protons. Tout d’abord, incubez les cellules exprimant l’échangeur de protons de sodium intracellulaire d’intérêt en chargeant la solution à 37 degrés Celsius et un incubateur sans dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, aspirez la solution de chargement et lavez les cellules deux fois avec un milieu frais.

Après le deuxième lavage, aspirez le milieu et incubez les cellules en solution de récupération dans un incubateur sans dioxyde de carbone. Après une autre heure, remplacez le milieu de récupération par un milieu de culture ordinaire et cultivez les cellules dans des conditions de culture standard. Répéter ce cycle de sélection deux fois par semaine jusqu’à ce que des clones stables émergent pour imager le pH de fluorescence intracellulaire des cellules.

Tout d’abord, un ensemble d’imagerie composé d’un microscope inversé couplé à une caméra vidéo haute sensibilité avec des filtres d’interférence à bande étroite de 450 nanomètres et 490 nanomètres associés aux filtres de densité neutre en quartz appropriés pour l’excitation. Si possible, utilisez l’ensemble approprié de filtres et les conditions d’éclairage pour établir des valeurs de fluorescence comparables pour les canaux un et deux afin que le rapport s’approche de 1 pour mesurer l’activité directe de l’échangeur de protons de sodium. Ensuite, acidifiez les cellules avec une incubation d’une heure dans une solution de charge d’ammonium.

En l’absence de dioxyde de carbone pendant les cinq dernières minutes de l’incubation, colorez les cellules avec un rapport métrique sensible au pH et à la fluorescence. À la fin de la période d’incubation, rin les cellules avec une solution de charge d’ammonium pour éliminer la sonde extracellulaire et monter les cellules colorées sur le microscope. Sélectionnez les régions d’intérêt où les valeurs fluorescentes seront mesurées, le cas échéant.

Enregistrez ensuite plusieurs images pour établir une base de référence et perfuser les cellules avec la solution RIN pour initier une baisse de la fluorescence. Une fois que le pH s’est stabilisé, parcourez les cellules avec la solution d’intérêt pour mesurer les taux de récupération du pH médiés par l’échange d’hydrogène de lithium, d’hydrogène de sodium ou d’hydrogène de potassium. Maintenant, parcourez les cellules avec la solution de hippies complétée par du chlorure de potassium et de la gérine.

Ensuite, collectez les mesures de fluorescence à partir des images et exportez les données dans un tableur au format texte pour mesurer le taux initial de l’échangeur de protons sodiques. Septièmement, par l’absorption rapide du lithium, acidifient les cellules et les plaques multipuits par la technique de chargement d’Imodium, comme cela vient d’être démontré. Ensuite, rincez les plaques deux fois rapidement comme nous venons de le démontrer.

Ensuite, incubez les cellules dans des solutions d’absorption contenant un à 10 micromolaires de lithium et les concentrations souhaitées du cation ou des inhibiteurs d’intérêt pendant environ une minute ou moins à la fin de la période d’absorption, retirez soigneusement le milieu d’absorption et lavez rapidement les cellules quatre fois avec du PBS glacé en moins de 10 secondes au total pour éviter l’efflux de lithium, puis lys les cellules dans 250 microlitres d’acide nitrique à 25 % par bien pendant au moins une heure. Racler chaque puits avec l’extrémité de la pointe de la pipette à la fin de l’incubation et transférer les suspensions de chaque puits dans de nouveaux tubes de micro-centrifugeuse. Enfin, la centrifugeuse prélève des échantillons pendant cinq minutes à 15 000 G à température ambiante pour éliminer les débris cellulaires, puis mesure la teneur en lithium du snat par spectroscopie d’absorption atomique.

Selon les instructions du fabricant, la sélection de la destruction des protons est basée sur la diffusion de la base faible de l’ammonium. Par exemple, les cellules qui n’expriment pas d’échangeur de protons de sodium fonctionnel au niveau de la membrane plasmique ne peuvent pas retrouver une valeur de pH neutre et présentent donc un aspect acidifié typique avec une forme plate et un cytosol granulaire comme on le voit sur cette image représentative après des cycles de sélection répétés, des cellules qui survivent pleinement et de manière stable. L’activité et la sélectivité ionique des échangeurs de protons de sodium intracellulaires exprimés au niveau de la membrane plasmique peuvent être caractérisées en mesurant les changements du pH intracellulaire induits dans diverses conditions expérimentales comme observé dans ces graphiques après l’acidification de la charge d’Imodium.

En ce qui concerne la cinétique enzymatique, la relation dose-réponse pour les taux d’absorption initiaux peut être utilisée pour calculer les valeurs des constantes d’affinité pour les substrats et pour les valeurs des constantes d’inhibition des inhibiteurs. En effet, une caractéristique intéressante des transporteurs est que différents cations de couplage vont entrer en compétition pour le transport, ce qui permet de mesurer la constante d’affinité pour le sodium par compétition avec l’absorption de lithium, comme le montre cette figure à la suite de cette procédure. D’autres expériences comme la BioInnovation de surface cellulaire couplée au silençage de l’ARN peuvent être réalisées afin de vérifier que le transporteur d’intérêt est bien exprimé au niveau de la membrane plasmique.