Name: Caractérisation fonctionnelle de Na + / H + Echangeurs de intracellulaire Compartiments utilisant la sélection Proton-tuant les exprimer à la membrane plasmique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Découvrez la caractérisation fonctionnelle des échangeurs Na⁺/H⁺ intracellulaires par sélection proton-tueuse et mesure du pH intracellulaire. Cette méthode permet d'étudier directement la cinétique ionique et les constantes d'affinité.

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Les auteurs sont profondément redevables à tous les membres de la communauté scientifique travaillant sur le pH et le transport des ions, qui ont été à l’origine des mesures décrites ici et les ont améliorées. Ils remercient tout particulièrement le Dr Jacques Pouysségur qui est à l’origine de la technique de sélection H+-kill utilisée ici. Ils remercient l’Université de Nice-Sophia Antipolis, le CNRS, l’ANR (JCJC SVSE1 NHEint) et le Labex ICST pour leur soutien.

1. H + Sélection Tuer <ol><li> Les lignées cellulaires <ol><li> Transfecter des cellules de manière stable NHE-déficients (par exemple, le PS120 lignée de cellules dérivées 16 CCL39) à l&#39;aide d&#39;une combinaison du vecteur d&#39;expression de mammifère et un procédé de transfection qui produira des rendements de transfection efficace et sélection dans une lignée cellulaire de fibroblastes. REMARQUE: Pendant de nombreuses années phosphate de calcium précipitations 19 a été utilisé avec de bons rendements de transfection. Cela a été remplacé par plus récemment réactifs commerciaux tels que Lipofectamine2000, les transfections étant effectuées suivant les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Solutions <ol><li> Préparer trois solutions stériles décrites ci-dessous. Stériliser ces solutions par filtration (0,22 um). <ol><li> Préparer une solution de 4 + NH chargement (pH 7,4) composé de 50 mM de NH 4 Cl, 70 mM de chlorure de choline, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, 5 mM glucose et 15 mM MOPS à pH 7,4. </li><li> Préparer une solution de rinçage (pH 7,0), composé de 120 mM de chlorure de choline, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, 5 mM de glucose et 15 mM de HEPES à pH 7,0. </li><li> Préparer une solution de récupération (pH 7,4) constitué de NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4. </li></ol></li></ol></li><li> Avant de commencer la sélection, l&#39;obtention d&#39;un incubateur de culture de cellules qui peut être utilisé à 37 ° C sans CO supplémentaire 2 du réservoir externe (appelé CO 2 - incubateur «libre»), tel que 5% de CO 2 entraînera tampon qui peut nuire à la acidification. Amplifier la lignée cellulaire exprimant le NHE d&#39;intérêt jusqu&#39;à environ 2 x 10 8 cellules (typiquement d&#39;environ 20 100 plaques confluentes mm). </li><li> H + tuant procédure: <ol><li> Incuber les cellules exprimant le NHE intracellulaire d&#39;intérêt pendant 1 heure dans la solution de charge, à 37 ° C dans l&#39;incubateur à CO2 exempt. </li><li> Aspirer la solution de chargement, puis les rincer deux fois dans la solution décrite ci-dessus rinçage. Effectuez cette étape efficace pour éliminer le résidu extracellulaire NH 4 Cl qui porterait atteinte à la création d&#39;un NH 4 + forte pente qui va générer l&#39;acidification. </li><li> Eliminer le milieu de rinçage par aspiration et on incube les cellules pendant une heure dans une solution de récupération de nouveau à 37 ° C dans l&#39;incubateur CO 2 libre. </li><li> Remplacer le moyen de récupération du milieu de culture ordinaire (typiquement du DMEM avec 7,5% de FCS) et faire croître les cellules dans des conditions standard de culture (37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 et 95% d&#39;air). </li></ol></li><li> Répétez ce cycle de la sélection deux fois par semaine jusqu&#39;à ce que des clones stables émergent. NOTE: Faites attention concernant la culture de cellules et les conditions de sélection. Mois de travail peuvent être ruinés par toute contamination qui est plus enclin à oCCur après une longue période de culture et de manipulations répétées de cellules. <ol><li> Ici, choisir d&#39;amplifier les clones et de caractériser individuellement comme décrit dans la dans les sections 2-3, ou les réunir pour générer une population cellulaire avant caractérisation. </li></ol></li><li> Appliquer la sélection occasionnelle (environ une fois toutes les deux semaines) pour conserver les cellules d&#39;acidification résistant par contre-sélection de ceux qui peuvent être revenu au phénotype sensible à l&#39;acide parentale (figure 1B). </li></ol> 2. Mesures pH intracellulaire 2.1) Fluorescence Imaging pH <ol><li> Utilisez le ratiométrique sensible au pH colorant fluorescent BCECF / AM, qui est sensible au pH lorsqu&#39;il est excité à 490 nm et possède un point isosbestique nm 445, en suivant les protocoles du fabricant. <ol><li> Vous pouvez également utiliser d&#39;autres sondes sensibles au pH, en suivant les protocoles du fabricant. </li></ol></li><li> Utilisez une imagerie mis conune superficie d &#39;un microscope inversé couplé à une caméra vidéo à haute sensibilité. Équipé cet ensemble avec 450 nm et 490 filtres d&#39;interférence à bande étroite nm jumelé avec quartz appropriée des filtres de densité neutre pour l&#39;excitation. <ol><li> Si possible, utilisez l&#39;ensemble approprié des filtres et des conditions d&#39;éclairage de configuration valeurs de fluorescence comparables pour λ1 et λ2 de sorte que le ratio se rapproche de 1. Evitez également les valeurs de fluorescence de base qui sont définies soit saturer ou trop faible, tant pour λ1 et / ou λ2. Cela peut donner des artefacts importants que le ratio peut pas détectable bien pH intracellulaire est en train de changer. NOTE: Ce système doit permettre la perfusion rapide, time-lapse excitation à deux longueurs d&#39;onde mentionnées ci-dessus et l&#39;acquisition à la longueur d&#39;onde d&#39;émission appropriée (535 nm pour BCECF). Équipé du système avec un logiciel permettant l&#39;acquisition automatique des données et le stockage. </li></ol></li></ol> 2.2) Mesure de l&#39;activité NHE Forward (Extrusion duLes protons du cytosol) <ol><li> Acidifier cellules par une incubation de 1 h dans la solution NH 4 + chargement (voir l&#39;étape 1.4) en l&#39;absence de CO 2. </li><li> Ajouter BCECF-AM (5 uM de concentration finale) à la solution pour les cinq dernières minutes, puis rincer avec de NH 4 + solution de charge pour éliminer la sonde extracellulaire. </li><li> Monter les cellules sur le microscope et prendre plusieurs images pour enregistrer une ligne de base stable. Perfuser la solution de rinçage (voir ci-dessus). Il en résulte une chute de la fluorescence correspondant à l&#39;acidification. </li><li> Après stabilisation du pH, perfuser l&#39;une des solutions ci-dessous pour mesurer les taux de récupération de pH médiées par Li + / H +, Na + / H + ou K + / H + échange. Chaque solution contient un cation de couplage pourrait être testé pour l&#39;échange de H +. Si l&#39;un de ceux qui est transporté, cela se traduira par une augmentation de la fluorescence à 495 nm qui correspond à une augmentation du pH intracellulaire: 120 mM de LiCl, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4 NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4 125 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4 </li></ol> 2.3) Mesure de NHE inverse Activité NOTE: Le principe ici est d&#39;inverser les gradients ioniques transmembranaires. <ol><li> Avant la mesure, charger les cellules avec le cation intracellulaire d&#39;intérêt (voir ci-dessous). </li><li> Incuber pendant 5 min avec BCECF / AM (voir l&#39;étape 2.2.2); rincez-les, montez-les sur le microscope vidéo. </li><li> Perfuser la solution de chargement et de prendre plusieurs images pour enregistrer une ligne de base stable. </li><li> Après la stabilisation de base, l&#39;image les variations de pH lorsque les cellules sont perfusées avec un milieu acide extracellulaire contenant 120 mM de chlorure de choline, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et 15 mM de MES à pH 6,5. </li><li> Pour LiCl chargement, incuber les cellules pendant 2 heures dans une solution composée de 120 mM de LiCl, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4. Lithium intracellulaire mesuré par spectroscopie d&#39;absorption atomique donne une valeur d&#39;environ 60 mM. </li><li> Pour le chargement Na +, les cellules incuber pendant deux heures dans une solution composée de 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 5 mM de glucose et 15 mM de HEPES à pH 7,4 en présence de 1 mM d&#39;ouabaïne de bloquer la Na / K ATPase. Dans ces conditions, la concentration intracellulaire de Na + est de l&#39;ordre de 40 mM. REMARQUE: K + chargement ne est pas nécessaire que K + cytosolique concentration est dans la gamme de 140 mM et un gradient K + dirigée vers l&#39;extérieur est donc facile à réaliser. </li></ol> 2.4) Le traitement des données et d&#39;étalonnage: NOTE: Cette étape se applique à la fois pour les mesures avant et arrière. <ol><li> A la fin de chaque expérience, perfuser les cellules avec une solution de KCl 140 mM, HEPES 20 mM et 5 uM nigéricine ajustée à des valeurs de pH entre 6,5 et 7,4. </li><li> Recueillir des données que des mesures de fluorescence à partir des images (niveaux de gris représentant niveaux d&#39;intensité) et l&#39;exportation sous format texte et traiter comme il est expliqué ci-dessous à l&#39;aide d&#39;un tableur. </li><li> Calculer les valeurs de pH intracellulaire pour chaque cellule ou d&#39;une région d&#39;intérêt en utilisant l&#39;équation suivante individuelle: pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) </li><li> Utiliser le F min (de λ2) / F x MA (λ2) se il existe rapport blanchiment de sonde ou de fuite, ce qui entraîne une diminution de la fluorescence de 450 nm tout au long des expériences. Ce ne est cependant très rarement observée dans les conditions utilisées dans le DEScribed expériences. </li><li> Comme les données d&#39;étalonnage sont présents à la fin de chaque mesure de pH, de vérifier si les valeurs calculées correspondantes diffèrent des valeurs de pH utilisées pour l&#39;étalonnage. Si ce est le cas, puis réglez toutes les valeurs de pH déterminé de manière expérimentale à l&#39;étalonnage en utilisant la procédure suivante: <ol><li> Calculer le quotient suivante (Q, la différence entre la valeurs mesurées / Différence entre les valeurs d&#39;étalonnage). Multipliez l&#39;ensemble des données par Q. Faire l&#39;ajustement final par addition ou soustraction de sorte que les valeurs calculées seront égales les valeurs d&#39;étalonnage correspondantes. </li></ol></li></ol> 3. Mesures de taux initiaux de NHE7 par Fast Li + Absorption <ol><li> cellules de semences sur des plaques à puits multiples (6 à 24 puits) et acidifier les utiliser soit la technique NH 4 + de chargement décrit ci-dessus ou alternativement le nigéricine / sérum albumine bovine (BSA) acidification décrite dans 20. </li><li&gt; Rincer les plaques deux fois rapidement en utilisant la solution de rinçage décrit ci-dessus et ensuite incuber les cellules dans des solutions contenant de 1 à 10 mM absorption lithium (légèrement en dessous de valeurs de Km) et les concentrations désirées de cations et / ou des inhibiteurs d&#39;intérêt pour la quantité souhaitée de temps. </li><li> Maintenir courtes et cohérentes durées d&#39;absorption (généralement une minute ou ci-dessous) afin de se assurer que le transport fonctionne dans des conditions de taux initiaux. Assurez-vous également que toutes les solutions utilisées pour l&#39;absorption sont isotoniques. </li><li> A la fin du temps d&#39;absorption, éliminer soigneusement le milieu d&#39;absorption et laver les cellules à quatre reprises avec une solution saline phosphate glacée tamponnée (PBS). Effectuez ces lavages aussi vite que possible (moins de 10 secondes pour les quatre d&#39;entre eux est idéal) pour empêcher lithium efflux. </li><li> Lyse des cellules dans 25% d&#39;acide nitrique. Appliquer 250 pi par puits de 25% d&#39;acide nitrique et laisser reposer pendant au moins 1 h, puis la ferraille chaque puits avec l&#39;extrémité de la pointe de la pipette et transférer la suspension de l&#39;ensemble ainsi dans une nouvelle kmTube crocentrifuge. </li><li> Transférer le lysat dans 1,5 ml microtubes, centrifuger les pendant 5 minutes à 15 000 xg (à température ambiante) pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Mesurer la teneur en lithium des surnageants par spectroscopie d&#39;absorption atomique 21. NOTE: Différentes entreprises offrent spectromètres d&#39;absorption atomique, qui doivent être équipé d&#39;une lampe à cathode creuse au lithium. Suivez les instructions du fabricant, car ces machines sont très précises mais aussi très délicate. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit la manière de sélectionner les cellules exprimant intracellulaire de Na + / H + échangeurs à la membrane plasmique sans modification de leur séquence primaire par mutagenèse dirigée. Ces échangeurs peuvent maintenant être caractérisés. Cette méthode est basée sur la toxicité cellulaire des protons intracellulaires pour sélectionner des lignées cellulaires qui expriment vésiculeuse Na + / H + échangeurs à la membrane plasmique. I...

La plupart des compartiments intracellulaires afficher un luminale pH acide, qui est un paramètre clé pour la maturation, le trafic, le recyclage des protéines ou des hormones et des neurotransmetteurs chargement. Il a été montré que le gradient de pH entre le cytosol et vésiculaire contenu est généré par vacuolaire H + ATPases 1, couplé transporteurs vésiculaires de chlorure ClC 2. Tant dans knock-out (KO) chez la souris et des patients humains, l&#39;importance de ces transporteurs a été soulignée par les phénotypes lourds causés par des mutations dans leurs gènes 3-6. Les membres de la famille de SLC9A échangeurs sodium-hydrogène, aussi appelés NHE pour Na + / H + échangeurs, ont été montré pour être effecteurs clés du pH intracellulaire et la régulation du volume cellulaire, ainsi que dans le transport vectoriel d&#39;équivalents acide-base à travers l&#39;épithélium . Outre les NHE de la membrane plasmique, trois hautement conservée Na + / H + échangeurs NHE 6, 7et 9 sont exprimés dans le réseau trans-Golgi et les endosomes précoces 7. Des mutations dans leurs gènes ont été associés à Angelman-like ou Christianson Syndromes 8-9, l&#39;autisme en milieu familial et 10 Attention Deficit Hyperactivity Disorder 11-12. Ces échangeurs ont également été impliqués dans des problèmes neurodégénératives telles que la maladie d&#39;Alzheimer 13 et la susceptibilité des gènes contigus retard mental lié à l&#39;X syndromes 14. Pris ensemble, ces études mettent en évidence l&#39;importance de ces NHE intracellulaires dans le développement et / ou le fonctionnement du cerveau. La localisation intracellulaire de ces échangeurs empêche des mesures précises de leur sélectivité d&#39;ions, la direction de transport, les paramètres cinétiques et la réglementation. Comme ce est le cas pour tous les transporteurs exprimées dans des compartiments intracellulaires, il est extrêmement difficile d&#39;évaluer leurs activités biochimiques et donc de comprendre pleinement leurs rôles physiologiques et l&#39;Mechanismes qui sous-tend leurs implications pathologiques. Basé sur la concentration élevée K + cytosolique, l&#39;hypothèse la plus communément admise était-qu&#39;ils travaillaient comme K + couplés protons transporteurs d&#39;efflux. L&#39;existence d&#39;une telle fuite de protons a été émis l&#39;hypothèse, car il peut contrebalancer protons pompage par les V-ATPases afin de maintenir un pH vésiculaire état stable. Le but de cet article visuelle est (i) de démontrer une méthode qui permet la sélection génétique de lignées cellulaires qui expriment ces transporteurs vésiculaires à leur membrane plasmique, et (ii) montrent deux approches indépendantes pour mesurer les fonctions de ces transporteurs. Il ya trois décennies, Pouyssegur et Franchi ont mis au point une approche génétique qui a permis le clonage moléculaire et la caractérisation des membres de la famille NHE 15. Cela était basé sur la toxicité des protons intracellulaires en tant que procédé de criblage. La première étape a consisté à obtenir des lignées cellulaires déficientesdans ne importe quel / H échange de Na + + exprimé à la membrane de plasma, en utilisant la réversibilité de ce transporteur. Les fibroblastes (lignée cellulaire de CCL39) ont été préchargées avec Na + ou Li + et ensuite placées dans un milieu extracellulaire acide (pH 6,5) pendant 2 heures. Cela a conduit à la mort des cellules exprimant un Na + / H + échange fonctionnel et à la sélection des cellules déficientes en antiport (lignée cellulaire de 16 PS120). Lorsque cultivées dans un milieu sans bicarbonate, ces cellules sont très sensibles à l&#39;acidification intracellulaire aiguë. Par conséquent, l&#39;expression de tout mécanisme d&#39;efflux de protons fonctionnelle à la membrane plasmique sera sélectionné positive (voir 17) si ces cellules sont soumises à acidifications intracellulaires aigus. De telles techniques d&#39;acidification peuvent être utilisées pour isoler des lignées de cellules de trafic de défauts permettant l&#39;expression forcée de NHE intracellulaires WT à la membrane plasmique. Comme eucaryote Na + / H+ Échangeurs sont électroneutre, ils ne sont pas mesurables par les approches électrophysiologiques qui ont été utilisés avec succès pour mesurer canaux. Ce manuscrit montre donc comment mesurer l&#39;activité de cet échangeur par des mesures de pH intracellulaires et une cinétique rapide de l&#39;absorption de lithium. Comme les concepts sous-jacents sont les mêmes, il est intéressant de remarquer que la plupart des procédés mis au point pour la section de sélection sont également utilisés directement pour les mesures fonctionnelles. Chose intéressante, nous avons observé que le défaut de traite présent dans les lignées cellulaires sélectionnées en utilisant l&#39;approche décrite dans ce manuscrit conduit à une plus grande expression d&#39;autres protéines vésiculaires à la membrane plasmique, comme le canal potassique 18 TWIK1 vésiculaire. Ceci souligne vers la sélection d&#39;un mécanisme général de défauts de conservation des protéines transmembranaires vésiculaires. Ce est pourquoi cette procédure de sélection et les cellules qu&#39;elle génère maiconstituent un outil prometteur pour la communauté scientifique travaillant sur les protéines membranaires de compartiments intracellulaires. Ainsi les techniques de mesure présentées ici pourraient être applicables pour l&#39;étude d&#39;autres transporteurs non-électrogènes.

<table><tbody><tr><td>Equipement</td><td></td><td></td> standard de culture cellulaire <td>Utilisé pour la sélection de destruction H+ composé de nombreux appareils avec différents numéros de catalogue</td></tr><tr><td>Incubateur avec CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur sans CO2</td><td>Heraeus Instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire PSM1200NF</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td></td><td></td>52010120</tr><tr><td>DMEM medium</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Péniciline/streptomycine</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre d’absorption atomique avec système de four Zeeman</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Acide nitrique</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Kit de vidéomicroscopie à fluorescence</td><td>Leica</td><td></td><td>Composé de nombreux appareils avec différents numéros de catalogue</td></tr><tr><td>Microscope automatisé inversé</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>support de microscope</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 11505180 <td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence incidente</td><td>Leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>support moteur</td><td>Leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>Feu de transmission LED&nbsp ;</td><td>Leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>plaque motorisée</td><td>Leica</td><td>11522068</td> 11531172 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>11888424</tr><tr><td>sortie de l’appareil photo</td><td>Leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition/analyse d’images</td><td>Leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optique</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243 11506203</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluorescence Lampe au xénon</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>caméra</td><td>Hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td></td> logiciel <td></td><td>métafluor/Mmfluor</td> 11640905 <td></td></tr><tr><td>sonde sensible au pH, BCECF-AM</td><td>technologies de la vie</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation fonctionnelle de na<sup&gt; +</sup&gt; / h<sup&gt; +</sup&gt; echangeurs de intracellulaire compartiments utilisant la sélection proton-tuant les exprimer à la membrane plasmique

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

L&#39;acidification des endosomes est essentiel pour un large éventail de processus, tels que le recyclage des protéines et de la dégradation, désensibilisation des récepteurs, et neurotransmetteur chargement dans les vésicules synaptiques. Cette acidification est décrite être médiée par ATPases de protons, couplés à des transporteurs de chlorure ClC. Hautement conservé protons électroneutres transporteurs, le Na + / H + (NHE) échangeurs 6, 7 et 9 sont également exprimés dans ces compartiments. Des mutations dans leurs gènes ont été liés à des maladies cognitives et neurodégénératives humaines. Paradoxalement, leurs rôles demeurent insaisissables, que leur localisation intracellulaire a empêché la caractérisation fonctionnelle détaillée. Ce manuscrit montre une méthode pour résoudre ce problème. Il se agit de la sélection de lignées cellulaires mutantes, capables de survivre acidification cytosolique aigu en conservant NHE intracellulaires à la membrane plasmique. Il décrit ensuite deux protocoles complémentaires pour mesurer la sélectivité et l&#39;activité d&#39;ionsde ces échangeurs: (i) une basés sur des mesures de pH intracellulaire par microscopie de fluorescence vidéo, et (ii) une base sur la cinétique de l&#39;absorption rapide de lithium. Ces protocoles peuvent être extrapolés à mesurer d&#39;autres transporteurs non-électrogènes. De plus, la procédure de sélection présentés ici génère des cellules avec un phénotype défectueux rétention intracellulaire. Par conséquent, ces cellules vont aussi exprimer d&#39;autres protéines de la membrane vésiculaire dans la membrane plasmique. La stratégie expérimentale représenté ici peut donc constituer un outil potentiellement puissant pour étudier d&#39;autres protéines intracellulaires qui seront ensuite exprimés à la membrane plasmique avec le vésiculaire Na + / H + échangeurs utilisés pour la sélection.

Sélection: La sélection + H tuant est basé sur la diffusion de l&#39;ammonium base faible, telle que représentée sur la figure 1A. L&#39;effet des bases faibles et acides diffusion sur le pH intracellulaire a été mis au point par Walter bore et ses collaborateurs 22. L&#39;idée élégante d&#39;utiliser ce phénomène pour produire une acidification mortelle pour la sélection génétique positive a été ensuite développé par Jacques Pouyssegur 17. D...

La première partie de cet article montre comment sélectionner des lignées cellulaires mutantes exprimant des échangeurs vésiculaires Na+/H+ au niveau de leur membrane plasmique. La deuxième partie fournit des protocoles basés sur des mesures de pH intracellulaires et d’absorption rapide d’ions, qui sont utilisés pour déterminer la sélectivité ionique et les paramètres cinétiques de ces échangeurs.

Caractérisation fonctionnelle de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Echangeurs de intracellulaire Compartiments utilisant la sélection Proton-tuant les exprimer à la membrane plasmique

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer l'activité des échangeurs sodium-proton exprimés intracellulairement. Cela est réalisé en premier lieu en sélectionnant les cellules qui expriment les échangeurs sodium-proton intracellulaires au niveau de la membrane plasmique par une sélection basée sur la mort par protons. Dans un deuxième temps, les cellules sélectionnées sont acidifiées, puis la récupération du pH intracellulaire est mesurée afin de confirmer l'activité d'échange sodium-proton des cellules.Les cinétiques rapides du transport ionique sont ensuite mesurées afin de déterminer les constantes d'affinité pour le cation transporté et les inhibiteurs. En fin de compte, le suivi des variations du pH intracellulaire et des cinétiques rapides des cellules somatiques sélectionnées permet la caractérisation fonctionnelle des échanges protéiques intracellulaires. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'expression de transporteurs mutants ou l'utilisation de cellules individuelles, réside dans sa capacité à induire l'expression de transporteurs intracellulaires de type sauvage au niveau de la membrane plasmique, rendant ainsi possible la mesure directe de leur fonction.Le Dr. Mallory Poet, scientifique chercheur de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer la procédure de blocage du proton, incubez d'abord les cellules exprimant l'échangeur sodium-proton intracellulaire d'intérêt dans une solution de chargement à 37 degrés Celsius, dans un incubateur sans dioxyde de carbone, pendant une heure. Ensuite, aspirez la solution de chargement et lavez les cellules deux fois avec un milieu frais.Après le deuxième lavage, aspirez le milieu et incubez les cellules dans une solution de récupération dans un incubateur exempt de dioxyde de carbone. Après une heure supplémentaire, remplacez le milieu de récupération par un milieu de culture ordinaire et faites croître les cellules dans des conditions de culture standard. Répétez ce cycle de sélection deux fois par semaine jusqu'à l'apparition de clones stables afin d'imaginer le pH intracellulaire par fluorescence des cellules.Équipez d'abord un dispositif d'imagerie composé d'un microscope inversé couplé à une caméra vidéo à haute sensibilité, munie de filtres d'interférence à bande étroite de 450 nanomètres et 490 nanomètres, associés aux filtres neutres en quartz appropriés pour l'excitation. Si possible, utilisez le jeu de filtres et les conditions d'illumination adéquates afin d'obtenir des valeurs de fluorescence comparables pour les canaux un et deux, de sorte que le rapport s'approche de un, permettant ainsi de mesurer l'activité directe de l'échangeur sodium-proton. Ensuite, acidifiez les cellules par une incubation d'une heure dans une solution de chargement à l'ammonium.En l'absence de dioxyde de carbone pendant les cinq dernières minutes de l'incubation, colorer les cellules avec un colorant fluorescent sensible au pH de type rapport métrique. À la fin de la période d'incubation, rincer les cellules avec une solution de chargement en ammonium afin d'éliminer la sonde extracellulaire, puis monter les cellules colorées sur le microscope. Sélectionner les régions d'intérêt où les valeurs de fluorescence seront mesurées de manière appropriée.Ensuite, enregistrez plusieurs images pour établir une ligne de base et perfusez les cellules avec la solution RIN pour initier une diminution de la fluorescence. Une fois le pH stabilisé, perfusez les cellules avec la solution d'intérêt afin de mesurer les taux de récupération du pH, médiés par l'échange lithium/hydrogène, sodium/hydrogène ou potassium/hydrogène. Perfusez maintenant les cellules avec la solution d'hippies supplémentée en chlorure de potassium et en gerin.Ensuite, recueillir les mesures de fluorescence à partir des images et exporter les données dans un tableur au format texte afin de mesurer la vitesse initiale de l'échangeur sodium-proton. Sept, par une absorption rapide de lithium, acidifier les cellules et les plaques multi-puits par la technique de chargement en Imodium, comme vient de l'être démontré. Puis, rincer les plaques deux fois rapidement, comme vient de l'être démontré.Ensuite, incuber les cellules dans des solutions d'absorption contenant de un à 10 micromolaire de lithium et les concentrations souhaitées du cation ou des inhibiteurs d'intérêt pendant environ une minute ou moins. À la fin de la période d'absorption, retirer soigneusement le milieu d'absorption et laver rapidement les cellules quatre fois avec du PBS glacé en moins de 10 secondes au total afin d'éviter l'efflux du lithium, puis lyser les cellules dans 250 microlitres d'acide nitrique à 25 % par puits pendant au moins une heure. Racler chaque puits avec l'extrémité du bout de pipette à la fin de l'incubation et transférer les suspensions de chaque puits dans de nouveaux tubes microcentrifuges. Enfin, centrifuger les échantillons pendant cinq minutes à 15 000 ×g à température ambiante pour éliminer les débris cellulaires, puis mesurer la teneur en lithium du surnageant par spectrométrie d'absorption atomique.Conformément aux instructions du fabricant, la sélection par élimination protonique repose sur la diffusion de la base faible ammonium. Par exemple, les cellules qui n'expriment pas d'échangeur sodium-proton fonctionnel au niveau de la membrane plasmique ne peuvent pas retrouver une valeur de pH neutre et présentent donc un aspect typiquement acidifié, avec une forme aplatie et un cytosol granuleux, comme observé sur cette image représentative après plusieurs cycles de sélection. Les cellules qui survivent pleinement et de manière stable forment toutefois des clones cellulaires individuels, comme illustré ici. L'activité et la sélectivité ionique des échangeurs sodium-proton intracellulaires exprimés au niveau de la membrane plasmique peuvent ainsi être caractérisées en mesurant les variations du pH intracellulaire induites dans diverses conditions expérimentales, telles qu'observées sur ces graphiques après l'acidification provoquée par la charge en Imodium.En ce qui concerne la cinétique enzymatique, la réponse dose-dépendante des taux initiaux d'absorption peut être utilisée davantage pour déterminer les valeurs des constantes d'affinité pour les substrats ainsi que les valeurs des constantes d'inhibition pour les inhibiteurs. En effet, une caractéristique intéressante des transporteurs est que différents cations couplés entrent en compétition pour le transport, offrant ainsi la possibilité de mesurer la constante d'affinité pour le sodium par compétition avec l'absorption du lithium, comme illustré sur cette figure selon cette procédure. D'autres expériences, telles que la bioinnovation de surface cellulaire couplée à l'inhibition par ARN, peuvent être réalisées afin de vérifier que le transporteur d'intérêt est effectivement exprimé au niveau de la membrane plasmique.

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