Génération de stimulateur cardiaque murin agrégats de cellules fondées sur la ES-Cell-programmation en combinaison avec MYH6-promoteur-sélection

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules ganglionnaires sinusales très pures. Ceci est accompli en induisant d’abord la différenciation cellulaire en modifiant le milieu et en faisant des gouttes suspendues qui entraînent la formation de corps embryonnaires d’une taille définie. Ensuite, les corps embryonnaires sont placés sur une boîte enrobée de gélatine afin qu’ils forment une couche cellulaire.

Ensuite, la sélection d’antibiotiques est initiée et seuls les cardiomyocytes survivent. Enfin, la couche cellulaire est dissociée pour obtenir des cellules ganglionnaires sinusales uniques à battement rapide, ou petits corps ganglionnaires sinusaux. En fin de compte, l’imagerie de cellules vivantes est utilisée pour montrer des fréquences de battement élevées des cellules ganglionnaires sinusales.

Le principal avantage de cette méthode est qu’il est possible de produire des cellules ganglionnaires sinusales très pures, par exemple pour les tests de dépistage de drogues. La méthode peut nous aider à répondre à des questions clés sur la maladie des ganglions sinusaux, car les cellules nous donneront un aperçu des mécanismes sous-jacents. La technologie sera présentée en laboratoire par Julia Yung, notre doctorante qui développe la méthode, en commençant par une lignée cellulaire ES et des cellules souches pluripotentes co-cultivées avec des cellules nourricières irradiées comme décrit dans le protocole textuel deux jours avant que la procédure de différenciation ne retire les PSC des cellules nourricières en aspirant d’abord le milieu.

Utilisez 10 millilitres de PBS pour laver les cellules. Ajoutez ensuite sept millilitres de solution de collagénase quatre et incubez les cellules pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, placez un filtre stérile de 40 micromètres dans un tube de 50 millilitres.

Ensuite, rincez soigneusement les colonies PSC en pipetant la solution de collagénase de haut en bas cinq fois. Transférez la suspension cellulaire dans le filtre et utilisez huit millilitres de PBS pour rincer le filtre trois fois. Retournez ensuite le filtre et placez-le à l’envers dans une boîte de Pétri et pipetez 10 millilitres de PBS au bas du filtre.

Pour éliminer les colonies de PSC, transférez maintenant la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et centrifugez pendant cinq minutes à 300 fois. G.Retirez le PBS, suspendez les cellules dans un millilitre d’Accutane et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajoutez 10 millilitres de PBS.

Mélangez la solution cellulaire en pipetant cinq fois de haut en bas et centrifugez pendant cinq minutes à 300 fois G.Une fois le PBS retiré, utilisez 10 millilitres de milieu de culture cellulaire pour remettre les cellules en suspension et déterminer le nombre de cellules graines. 15 000 cellules par centimètre carré dans une fiole filtrante de 75 centimètres carrés et cultivez-les pendant deux jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone lorsque la fiole doit être à 50 à 70 % confluent. Après avoir récolté les cellules et la suspension de Resus dans un milieu de différenciation conformément au protocole de texte, pipetez 20 millilitres d’eau et cinq millilitres de goutte suspendue ou de solution HD dans une boîte de Pétri quadratique pour éviter de dessécher les hds.

Ensuite, pipetez jusqu’à 50 millilitres de suspension cellulaire dans un plateau. Retournez ensuite le couvercle de la boîte de Pétri et, à l’aide d’une pipette à 12 canaux, placez 180 HDS contenant chacun 20 microlitres de suspension cellulaire sur le couvercle. Retournez délicatement le couvercle et placez-le sur la boîte de Pétri.

Après une incubation de deux jours pour laisser les cellules former des ebs, retournez soigneusement le couvercle de la boîte de Pétri quadratique et transférez l’EBS dérivé de deux boîtes de Pétri dans un tube de 50 millilitres. Attendez 10 minutes pour laisser l’EBS se déposer au fond du tube, puis aspirez autant de fluide que possible. Utilisez 10 millilitres de milieu de différenciation pour suspendre l’EBS et transférer la suspension dans une boîte de Pétri de 10 centimètres.

Une fois que les cellules ont été cultivées en suspension pendant quatre jours, selon le protocole de texte, transférez l’EBS dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres carrés enrobée de gélatine et incubez pendant les deux à six jours suivants sous un microscope, vérifiez que les cellules ne battent pas les foyers et la formation d’une couche cellulaire trois jours après que les cellules ont commencé à battre, Aspirez le milieu et ajoutez 10 millilitres de différenciation fraîche. Milieu contenant 400 microgrammes par millilitre de G quatre 18 aux cellules quatre jours plus tard. Retirez soigneusement le milieu sans aspirer la couche cellulaire.

Ajoutez ensuite 10 millilitres de PBS pour laver les cellules. Après avoir soigneusement retiré le PBS, ajoutez 10 millilitres de solution de collagénase quatre et transférez les cellules dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, après l’avoir incubée à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes, mélangez vigoureusement la suspension en pipetant de haut en bas 10 fois et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes supplémentaires.

Une suspension de petits amas doit être présente. Ajoutez ensuite 20 millilitres de PBS et centrifugez pendant 10 minutes à 300 fois. G, aspirez soigneusement le PBS et si vous générez des corps auriculaires sino-auriculaires induits ou des sabs, utilisez 12 millilitres de milieu de différenciation contenant 400 microgrammes par millilitre de G quatre 18 à Resus, suspendez les cellules et voyez deux millilitres chacun sur six puits d’une plaque recouverte de gélatine de 24 puits pour générer des cellules nodales uniques plutôt que d’ajouter un milieu de différenciation.

Après avoir retiré le PBS, utilisez cinq millilitres d’Accutane pour suspendre les cellules et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pipeter de haut en bas pour vigoureusement. Mélangez la suspension après l’incubation à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ajouter 20 millilitres de PBS et centrifuger pendant cinq minutes à 300 fois G avec 12 millilitres de différenciation. Milieu contenant G quatre 18. Mettez les cellules en suspension et observez deux millilitres chacun sur six puits d’une culture sur plaque recouverte de gélatine à 24 puits et effectuez l’analyse des cellules selon le protocole de texte.

En utilisant le protocole démontré dans cette vidéo, isab S peut être généré à partir de cellules souches pluripotentes avec une fréquence de battement d’environ 450 battements par minute, comme on le voit ici après dissociation d’isab S.Les cellules uniques observées montrent les formes typiques des cellules du nœud sinusal qui comprend les cellules fusiformes et araignées. Ces cellules présentent des niveaux d’expression élevés de protéines essentielles au fonctionnement du nœud sinusal, comme le cation nucléotidique cyclique activé par l’hyperpolarisation. Canal quatre HCN quatre, conexion quatre cinq conexion 30.2 et MYH six.

Lorsqu’elles sont traitées avec l’inhibiteur de canaux ZD 7 2 88, ou l’agoniste des récepteurs muscariniques caracol, les cellules dérivées d’isab présentent une fréquence de battement significativement réduite. L’isoprène, agoniste des récepteurs bêta-surrénaliens, entraîne une fréquence de battement élevée. Dans l’ensemble, notre technique ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la fonctionnalité et des maladies des stimulateurs cardiaques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des cellules ganglionnaires sinusales entièrement fonctionnelles à partir de cellules souches puissantes PLU.