En trois dimensions modèle de co-culture tumeur stromale-Interaction

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les interactions cellulaires entre les cellules de cancer du poumon et les fibroblastes associés au cancer selon une méthode de co-culture tridimensionnelle. Cela est réalisé par la culture primaire de fibroblastes humains associés au cancer du poumon à partir de tissu pulmonaire prélevé, découpé en morceaux d'un millimètre de taille. La deuxième étape consiste à préparer des gels de collagène contenant des fibroblastes en mélangeant une solution de collagène à l'aide des cellules oculaires de trypsine, puis à transférer le mélange dans une plaque de six puits pour permettre la gélatinisation.

Ensuite, les cellules de carcinome pulmonaire adénocarcinomateux sont ensemencées à la surface de chaque gel pour préparer une co-culture tridimensionnelle de cellules cancéreuses et de fibroblastes, et le gel est détaché du bord du puits pour générer une culture en suspension. La dernière étape consiste à réaliser une culture à l'interface air-liquide et un test d'envahissement en exposant les gels rétractés à l'air en les plaçant sur une membrane située dans une plaque de six puits. Enfin, des examens histologiques sont utilisés pour évaluer l'envahissement des cellules cancéreuses et les modifications morphologiques.

L'avantage principal de cette procédure par rapport aux méthodes existantes, telles que la culture en monocouche bidimensionnelle, est que les interactions multicellulaires peuvent être étudiées en culture tridimensionnelle dans des conditions contrôlées. Cette procédure commence par la culture primaire de fibroblastes à partir de tissu pulmonaire collecté, comme décrit et référencé dans le protocole textuel. Dans cette vidéo, des poumons de souris sont utilisés à la place de tissus pulmonaires humains atteints de cancer.

Placer l'échantillon de tissu pulmonaire sur une boîte de culture de 10 centimètres de diamètre sans milieu de culture. Couper le tissu en petits fragments d'environ un millimètre de taille à l'aide de pinces stériles et d'un scalpel. Pendant cette opération, veiller à ne pas laisser les fragments sécher, car cela compromettrait l'efficacité de l'expansion cellulaire. Disposer les petits fragments de tissu pulmonaire à distance les uns des autres afin de préserver une zone vide autour de chaque morceau.

Réalisez des rayures sur la surface de la boîte de culture tissulaire à l’aide d’une lame de scalpel. Alternativement, la couverture par des fragments de tissu améliore l’efficacité de l’expansion cellulaire et de la propagation cellulaire après plusieurs passages. Placez d’abord de la graisse de silicone en deux points distants de 1,5 centimètre dans chaque puits.

Placez ensuite individuellement les morceaux de tissu haché au centre de chaque puits. Fixez alors la lamelle sur la surface de la plaque à l’aide de graisse de silicone. Ajoutez délicatement le milieu de culture dans la boîte ou la plaque à six puits avant que les sections de tissu ne s’assèchent.

La prolifération cellulaire efficace est en grande partie perdue. Si les échantillons s'assèchent, ne versez pas le milieu trop rapidement afin d'éviter le détachement des sections de tissu lors de la formation du gel de collagène. Lavez les fibroblastes avec une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS et ajoutez de la trypsine pour détacher les cellules en expansion après une action de la trypsine d'environ cinq minutes.

À 37 degrés Celsius, détacher les cellules en utilisant neuf millilitres de DMEM supplémenté avec 10 % de FBS, recueillir les cellules en suspension dans le milieu dans un tube de 10 millilitres et centrifuger à 200 à 300 ×g pour former des culots cellulaires. Ressuspendre les culots obtenus dans du FBS à 100 % à une densité de 500 000 cellules par millilitre. Refroidir les réactifs, les pipettes et les tubes destinés à la préparation du gel de collagène dans un réfrigérateur avant la préparation du gel de collagène.

Ensuite, préparez le gel de collagène en mélangeant vigoureusement par pipetage la suspension de fibroblastes dans du collagène de type I A en FBS, du DMEM 5× et du tampon de reconstitution, afin d'obtenir un mélange homogène, en évitant la formation de bulles pendant le pipetage. Ajoutez ensuite trois millilitres du mélange dans chaque puits d'une plaque à six puits et laissez gélatiner dans l'incubateur à 37 degrés Celsius sans perturbation pendant 30 à 60 minutes, pour la culture de cellules cancéreuses sur le gel de collagène Resus. Suspendez les cellules cancéreuses dans le milieu de co-culture 3D à une densité de un fois dix puissance cinq cellules par millilitre.

Verser délicatement deux millilitres de la solution de cellules de carcinome pulmonaire A549 resuspendue à la surface de chaque gel. Modifier le nombre de cellules cancéreuses ou de fibroblastes en co-culture selon les conditions expérimentales afin d'effectuer la contraction du gel. Incuber les gels toute la nuit à 37 degrés Celsius pour permettre aux cellules cancéreuses d'adhérer au gel de collagène.

Ensuite, détachez chacun et générez une culture en suspension dans chaque puits. De la plaque à six puits, utilisez une aiguille biseautée de calibre 21 ou une petite spatule pour séparer chaque gel du bord du puits toutes les deux à trois journées. Renouvelez le milieu dans les puits avec deux millilitres de milieu de co-culture 3D.

Mesurez la taille de chaque gel chaque jour pendant cinq jours. Enfin, consultez le protocole écrit pour l'analyse des gels de collagène. Après avoir cultivé les gels de collagène à 37 degrés Celsius pendant cinq jours.

Exposer les gels rétractés à l'air en les plaçant sur une maille. Dans de nouvelles plaques à six puits, fabriquer la maille à partir de filtres à cellules commerciaux utilisés pour la cytométrie en flux. Remplir délicatement chaque puits avec 11 millilitres de milieu de co-culture en 3D.

Positionnez les gels sur la membrane à l’aide d’une cuillère stérile et retirez tout milieu résiduel présent sur les gels dans cette condition. Les gels sont immergés dans le milieu tout en laissant leur surface supérieure exposée à l’air. Définissez cette condition de culture comme une interface air-liquide.

Cette méthode de co-culture, qui imite le microenvironnement tumoral, constitue un outil utile pour étudier les interactions entre les cellules cancéreuses et les fibroblastes inclus dans des gels de collagène. Des cellules A549 ont été mises en co-culture sur un gel de collagène contenant les fibroblastes, et la couche de cellules A549 a été exposée à l'air en plaçant le gel sur une membrane en milieu de culture. On observe ici une image représentative du gel placé sur la membrane, dans un puits d'une plaque à six puits, destinée à des analyses histologiques avec l'hématoxyline, l'éosine et l'Eoin.

La coloration de coupes transversales d'un gel cultivé en trois dimensions a révélé l'envahissement du gel de collagène, enrichi de fibroblastes associés au cancer du poumon, par des cellules 5 49. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'expression génique ou l'extinction d'expression peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la fonction spécifique d'un gène dans l'interaction tumeur-stroma.