Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

L’objectif de cette procédure est d’isoler et de cultiver efficacement les neurones primaires du mésencéphale ventral des rongeurs. Ceci est accompli en disséquant d’abord le mésencéphale d’embryons de rongeurs. La deuxième étape consiste à isoler soigneusement le mésencéphale ventral.

Ensuite, le tissu neuronal doit être dissocié pour produire une suspension unicellulaire. La dernière étape consiste à plaquer les neurones primaires dans un petit volume sur des lamelles avant de transférer les cellules attachées dans une plaque à 24 puits en fin de journée. En fin de compte, la microscopie à anticorps et à immunofluorescence est utilisée pour identifier les neurones dopaminergiques au sein de la culture.

Les neurones dopaminergiques du mésencéphale sont impliqués dans plusieurs fonctions, notamment le contrôle du mouvement et des émotions dans la cognition et la sécrétion de récompense du cerveau. Ils sont également impliqués dans des troubles neurologiques et neuropsychiatriques, notamment la maladie de Parkinson, la toxicomanie et la schizophrénie. La méthode de réparation du mésencéphale ventral.

Les cultures neuronales peuvent être utilisées pour étudier la physiologie et les propriétés cellulaires des neurones dopaminergiques, ainsi que pour comprendre la cause de leur dégénérescence. Au cours de troubles tels que la maladie de Parkinson. Tout d’abord, préparez les bordereaux de protection.

Faites-les bouillir dans de l’éthanol à 70 % pendant au moins 30 minutes pour éliminer toute trace de graisse. Ensuite, autoclavez les lamelles de protection. Transférez les lamelles dans des plaques à 24 puits et ajoutez un demi-millilitre de polyol tout athène à chacune.

Laissez bien les assiettes incuber pendant une heure à température ambiante. Prenez note que la durée de conservation de la solution de polyol ou d’Athène est d’un mois. Ensuite, lavez les lamelles trois fois avec un demi-millilitre d’eau par lavage.

Sans les trois lavages, les cellules cultivées ne survivraient pas 24 heures. Ensuite, réparez la solution de laminine. Assurez-vous d’abord de le décongeler lentement sur de la glace.

Dissoudre ensuite la laminine dans le froid D-M-E-M-F 12, et l’utiliser immédiatement. Maintenant, à un demi-millilitre de solution de laminine de travail fraîchement préparée dans chaque puits et laissez les plaques incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Enfin, lors de la préparation de la pipette en verre, je polit leurs pointes à la moitié de leur taille normale.

Faites une incision abdominale pour exposer les sacs utérins et, à l’aide de pinces, coupez l’utérus. Transférez l’utérus dans un HBSS glacé dans une boîte de 100 millimètres et commencez à retirer les embryons avec des pinces. Transférez les embryons isolés dans une nouvelle boîte de HBSS froide.

Maintenant, sous un microscope de dissection, préparez-vous à accéder à cet emplacement du mésencéphale ventral sous un grossissement de 10 x. Disséquez les meas et l’arc céphalique en coupant le cerveau au niveau de l’isthme et des meas et de la région limite céphalique di céphalique à l’aide de ciseaux biologiques ou de pinces. Après avoir retiré tout le mésencéphale, faites une incision dans le mésencéphale dorsal médial.

À l’aide d’une pince, retirez les méninges. Cette étape est essentielle au succès de la culture neuronale. Les cellules non neuronales mourront en culture et dans des conditions et signaleront négativement les neurones voisins.

Maintenant, aplatissez le tissu du mésencéphale en forme de papillon. Coupez environ la moitié de chaque aile avec une lame stérile en laissant le mésencéphale ventral. Transférez le mésencéphale ventral dans un HBSS glacé dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, procédez à la dissection de l’embryon suivant, traitez autant d’embryons que possible en une heure. Les embryons conservés sur la glace pendant plus d’une heure ont une faible viabilité cellulaire. Pour assurer une grande viabilité des neurones dopaminergiques, le temps entre la dissection et la mise en plaques ne doit pas dépasser une heure.

De plus, l’ablation des méninges est cruciale pour la survie des neurones sous une capuche. Retirez le HBSS de la collection du mésencéphale ventral. Ajoutez ensuite un millilitre de tripsin A DTA tiède à 0,05 %, suffisamment de solution pour 12 morceaux de tissu.

Incuber le tissu à 37 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes. Sous le capot, remplacez le tripsin A DTA par un millilitre de désactivation. Le milieu gonfle doucement pour mélanger, puis retire le milieu de désactivation, mais laisse suffisamment de milieu derrière soi pour que les cellules dissociées ne soient pas jetées.

Ensuite, lavez les tissus avec un milieu complet deux fois sans perdre les cellules. Ajoutez maintenant un millilitre de milieu complet. Triturez ensuite le tissu avec la pipette polie au feu sans former de bulles jusqu’à l’obtention d’une suspension unicellulaire.

Environ huit à 10 passages devraient suffire. Après la durée, centrifugez les cellules de 400 G pendant cinq minutes. Retirez le milieu et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu complet.

Pipetez les cellules jusqu’à quatre fois pour obtenir une suspension. Commencez par compter et évaluer l’état des cellules de la suspension. Utilisation de l’exclusion triam blue avec un hémocytomètre.

Ajustez maintenant la suspension des cellules à 1500 cellules par microlitre. Transférez ensuite les capuchons stérilisés des microtubes de centrifugation dans des boîtes de 100 millimètres. Placez les lamelles préparées sur les capuchons à l’aide d’une pince.

Ne lavez pas les lamelles et essayez de ne pas les laisser sécher. Chargez 100 microlitres de suspension sur chaque lamelle. Cette méthode quelque peu inhabituelle offre une viabilité de culture de 90 % et constitue une étape essentielle au succès.

Fermez ensuite la boîte de Pétri et transférez-la dans l’incubateur pendant une heure après l’incubation, transférez soigneusement les lamelles avec le milieu vers des plaques à 24 puits contenant 400 microlitres de milieu complet chaud à 37 degrés Celsius dans chaque puits, puis incubez les cellules pendant la nuit. Les premières heures sont les plus critiques pour la survie cellulaire dans les 24 heures. Ajouter délicatement un demi-millilitre de milieu complet à chaque puits.

Toutes les deux semaines. Changez la moitié des supports. Si la culture devient jaune, le changement de demi-milieu peut être effectué plus tôt, mais le changement doit encore être peu fréquent.

Les neurones dopaminergiques survivront plus de six semaines dans ces conditions. Après deux semaines de culture, l’immunohistochimie contre la tyrosine, l’hydroxylase et les marqueurs neuronaux montre que 1 % des cellules sont dopaminergiques. Les projections neuronales apparaissent dans les deux heures suivant le placage.

À la fin du premier jour de culture, les axones et les dendrites sont distinguables. En fin de compte, les neurones survivent pendant plus de six semaines et montrent une excroissance extensive à la suite de cette procédure. D’autres méthodes comme la transduction virale, l’immunofluorescence ou l’électrophysiologie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions mécanistes dans les neurones dopaminergiques.