Name: Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Découvrez l'isolement et la culture de neurones dopaminergiques mésencéphaliques primaires à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs. Cette méthode permet d'étudier la neurodégénérescence dans la maladie de Parkinson.

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Ce travail a été réalisé à l’aide des fonds de démarrage de la Division des sciences du cerveau, du Département de médecine, de l’Imperial College de Londres pour K.N.A.

REMARQUE: Les animaux ont été maintenus et manipulés en conformité avec les directives institutionnelles et toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés par la protection des animaux de l&#39;Imperial College et le Home Office et de l&#39;Université Harvard institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité (IACUC) examen éthique du corps (de AWERB) et, en conformité avec les règlements fédéraux et étatiques. 1. réactif et le matériel Setup <ol><li> Thaw, aliquote et stocker 1 mg / ml solution à -80 ºC laminine. Dissoudre 2 pi dans 1 ml de DMEM / F12, résultant en une concentration de revêtement de 1-2 mg / cm 2. REMARQUE: Thaw laminine lentement sur la glace et se dissoudre dans le froid DMEM / F12 et immédiatement ajouter aux plaques / lamelles. </li><li> Diluer 75 ml de 0,01% Poly-L-ornithine dans 425 ml de PBS et conserver à 4 ºC. REMARQUE: La durée de conservation de la solution de travail est à un mois. </li><li> Dissoudre 25% (poids / volume) de BSA dans du PBS, pH 7,4, et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à un year. </li><li> Préparer 50% de FBS (dans HBSS) Moyens de désactivation. </li><li> Préparer un milieu complet par addition de 50 U / ml de pénicilline et de la streptomycine, 1x supplément N2, 5% (vol / vol) de FBS, 0,36% de D - (+) - glucose (poids / volume), 0,25% de SAB (poids / volume) de DMEM / F12 et conserver à 4 ºC. REMARQUE: La durée de conservation est de 10 jours. </li><li> La place des lamelles à 70% (vol / vol) d&#39;éthanol bouillant pendant au moins 30 minutes pour éliminer toute trace de graisse et autoclave. </li><li> La place des lamelles dans des plaques à 24 puits et ajouter 500 ul de solution de poly-L-ornithine à chaque puits. Incuber 1 h sous le capot de culture de tissus à la température ambiante puis, laver 3 fois avec 500 pi d&#39;eau. Ajouter la solution de laminine 500 ul à chaque plaque et incuber O / N dans le humidifié incubateur de culture tissulaire à 37 ° C. REMARQUE: si aucune lavages sont nécessaires après le traitement de la laminine, en lavant les poly-L-ornithine moins de trois fois entraîne la mort des cellules 24 h après la mise en culture. </li><li> Essuyez les conseils de pipettes en verre plus de gaz naturel ou torche fboiteux. NOTE: Après cette étape, le diamètre de la pointe devrait être d&#39;environ la moitié de sa taille normale. </li><li> Couper les bouchons de 1,5 ml microtubes, en utilisant un autoclave ciseaux et autoclave. </li></ol> 2. Dissection du mésencéphale embryonnaire ventral <ol><li> Narcotiser chronométré enceintes (E12.5) barrages par inhalation de CO 2 puis euthanasier par dislocation cervicale. </li><li> Pulvériser l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol et de faire une incision abdominale jusqu&#39;à ce que les sacs de l&#39;utérus sont tous exposés. Aide d&#39;une pince coupe l&#39;attachement vaginale et supprimer utérus. Placez l&#39;utérus glacée HBSS, dans une boîte de Pétri de 100 mm. </li><li> Retirer embryons de l&#39;utérus et le sac amniotique, en utilisant une pince (figure 1C). La place embryons dans HBSS glacée fraîche. NOTE: Le rectangle dans la figure 1D indique l&#39;emplacement du mésencéphale ventral embryonnaire. </li><li> Placez les embryons sous un microscope de dissection (10x de grossissement) et disséquer le mésencéphalearc en coupant le cerveau à l&#39;isthme et la région frontière mésencéphalique-diencéphalique, en utilisant la bioscissor et pince (figure 1E, se il vous plaît se référer à la figure 1A pour les lignes de l&#39;incision). </li><li> Après avoir sorti l&#39;ensemble du mésencéphale, faire une coupe dans le mésencéphale médiodorsal (figure 1F). </li><li> Retirer méninges, en utilisant deux pinces (figure 1H). REMARQUE: ÉTAPE CRITIQUE: Cette étape est essentielle pour un rendement optimal et la survie neuronale. Étant donné que les conditions de culture sont optimales pour les cellules du cerveau, la plupart des cellules du tissu environnant meurent après l&#39;étalement et le signal apoptotique à partir de ce tissu peut endommager l&#39;intégrité des cultures. </li><li> Aplatir le tissu mésencéphale sur la boîte de Pétri pour observer la forme de papillon et couper environ la moitié de chaque aile, à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir stérilisé (Figure 1 H, I). REMARQUE: la figure 1J représente le mésencéphale ventral isolé. </li><li> Transférer lemorceau de mésencéphale ventral dans glacée HBSS dans un tube conique de 15 ml et procéder à la prochaine embryon. REMARQUE: les étapes 2.1 à 2.8 ne devrait pas prendre plus d&#39;une heure. Garder les embryons au-delà de ce laps de temps sur la glace diminue de manière significative la viabilité des cellules. </li></ol> 3. La dissociation des cellules ventrale Mésencéphale <ol><li> Transférer les morceaux de mésencéphale ventral sous une hotte à flux laminaire. Retirez le HBSS et ajouter 1 ml préchauffé (37 ºC) 0,05% de trypsine-EDTA dans le tube conique (volumes assez pour jusqu&#39;à 12 morceaux de mésencéphale ventral). Incuber le tissu à 37 ° C pendant 5 à 10 min. </li><li> Retirer la trypsine-EDTA sous le capot et ajouter du milieu de désactivation de 1 ml (le sérum désactivera la trypsine) pour le tissu. </li><li> Éliminer le milieu de désactivation et laver le tissu dans 1 ml de milieu complet deux fois. REMARQUE: Evitez de retirer tout le milieu du tube et pipetage le tissu, pour éviter de jeter les cellules dissociées. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu complet et triturate le tissu avec une pipette en verre poli-le-feu. Eviter la formation de bulles et de continuer jusqu&#39;à ce trituration suspension cellulaire unique est atteint. Note: Habituellement, 8-10 traverse la pointe restreint sont obligatoires pour la dissociation complète. </li><li> Centrifuger les cellules à 400 g pendant 5 min à température ambiante et retirez le support. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu complet en pipettant doucement de haut en bas jusqu&#39;à quatre fois. </li></ol> 4. Les cellules Placage ventrale Mésencéphale <ol><li> Mélanger 10 ul de la suspension cellulaire avec une solution de bleu Trypan 90 pi et de compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre. NOTE: La viabilité des cellules peut également être vérifiée à ce stade. </li><li> Placez stérilisés bouchon d&#39;un tube à centrifuger de 100 mm boîtes de Pétri et de transférer les poly-L-ornithine / laminine lamelles, en utilisant une pince, un à la fois au-dessus des bouchons. REMARQUE: Ne pas laver les lamelles et éviter le séchage de la laminine, car cela pourrait provoquer uneven cultures et diminution de la capacité de survie des cellules. </li><li> Ajuster le volume à 1 500 cellules par ul de 1 par addition de milieu complet et ajouter 100 ul (total de 150 000 cellules) de la suspension de cellules au-dessus de chaque lamelle (le volume est optimale pour couvrir la surface de la lamelle couvre-objet sans déversement). Fermez les boîtes de Pétri et incuber pendant 1 h dans un incubateur de culture de tissu humidifié (37 ° C, 5% de CO 2). REMARQUE: étape critique: Cette étape est nécessaire pour améliorer la fixation et la viabilité des cellules et pour augmenter le nombre de lamelles par embryon. Alternativement, les cellules peuvent être transférés directement dans les puits (contenant lamelles couvre), mais le nombre de cellules devrait être porté à 350 000 par puits (au lieu de 150 000). En d&#39;autres termes, en utilisant cette méthode, 8-10 lamelles peuvent être acquis, tandis que le transfert direct donne environ 3-4 lamelles en raison des cellules, qui se fixent sur les plaques (à côté ou au-dessous des lamelles). La moyenne viabilité des cultures, en utilisant cette méthode était d&#39;environ 90%. </li></ol> 5. Culture croissance et l&#39;entretien <ol><li> Après 1 h d&#39;incubation, transférer soigneusement les lamelles y compris le milieu dans des plaques à 24 puits contenant 400 ul préchauffé (à 37 ° C) du milieu complet (volume total: 500 ul). Incuber les cellules O / N à 37 ºC. </li><li> De 24 h après l&#39;incubation des puits, ajouter doucement 500 pi de milieu complet dans chaque puits. REMARQUE: Les premières heures est l&#39;étape la plus critique pour la survie des neurones dopaminergiques et le nombre de cellules survivantes ne change pas de façon significative au-delà de ce point. </li><li> Ne ajoutez pas supplémentaire pour les cultures pour les deux premières semaines ou jusqu&#39;à ce que le milieu devient jaune. Si la culture depuis plus de deux semaines ou des changements de couleur moyennes au jaune, l&#39;échange de la moitié des médias (500 pi) avec frais milieux complets préchauffées (généralement toutes les deux semaines). NOTE: les neurones dopaminergiques au sein de lacultures seraient survivre pendant plus de six semaines dans ces conditions. </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Les neurones dopaminergiques dans le mésencéphale sont la principale source de la dopamine dans le système nerveux central. Ils sont divisés en trois groupes, substantia nigra pars compacta (SNPC), Surface tegmentale ventrale (VTA) et sur ​​le terrain retrorubral (RRF) 10, 11. Les neurones dans SNPC et VTA donnent lieu à des grandes voies dopaminergiques, mésocorticales, mésolimbiques et nigro-striée, impliquées dans les fonctions telles que le contrôle de l&#39;émotion, la motivation et le comportement moteu...

La perte de neurones dopaminergiques de la substantia nigra pars compacta conduit à des symptômes moteurs cardinal de la maladie de Parkinson (MP), le deuxième trouble neurodégénératif le plus répandu. La cause sous-jacente de la disparition de cette population neuronale mésencéphalique ne est pas connu. Pour étudier les voies biochimiques responsables du développement et de moduler les propriétés neurophysiologiques et la survie des neurones MESDA, plusieurs culture cellulaire et des systèmes de modèles animaux ont été utilisés. Les lignées cellulaires immortalisées, y compris la dopaminergique chez le rat lignée cellulaire 1RB 3 AN 27 (N27), le dopaminergique humain lignée cellulaire de neuroblastome SH-SY5Y, la lignée cellulaire hybride dopaminergique de la souris MN9D et mésencéphalique humaine LUHMES cellules ont été utilisées pour des études mécanistiques biochimiques et limitées 1 -5. Pour l&#39;étude de la perte spécifique de neurones MESDA, plusieurs neurotoxine-fondées et les modèles génétiques ont été développés 6-8. Cultures mésencéphale ventrales primaires, Fournir un outil indispensable pour étudier les propriétés neuronales et synaptiques des neurones dopaminergiques et les voies impliquées dans la pathogenèse de cette maladie fréquente. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l&#39;isolement des neurones dopaminergiques mésencéphaliques, qui contient des modifications résultant en la capacité de survie plus élevé et un rendement accru de lamelles par embryon. L&#39;utilisation de la souris E12.5 mésencéphale pré-mature (E14.5 chez le rat) améliore la survie. À cet âge neurones ne ont pas encore développé axones, ce qui laisse des cellules intactes lors de la dissection et minimise la contrainte augmentant ainsi considérablement la viabilité. En outre, dissection minutieuse du mésencéphale ventral, tel que décrit dans l&#39;article 2 de ce protocole, améliore encore la capacité de survie. Pour augmenter le nombre de lamelles par embryon, une méthode de placage de remplacement est présenté dans la section 4 de ce protocole. Cela conduit à un rendement allant jusqu&#39;à 10 lamelles par embryon par rapport aux lamelles de moins de 4conditions de placage classiques réduisant ainsi la quantité d&#39;animaux par expérience. Neurones en culture exposition excroissance des axones et des dendrites, forment des connexions synaptiques et révèlent la présence de marqueurs neuronaux et synaptiques faisant ces cultures appropriée pour l&#39;imagerie de cellules vivantes, immunocytochimique et des études électrophysiologiques. En outre, l&#39;utilisation de cultures de neurones facilite la manipulation génétique et pharmacologique. Excroissance de neurites de deux jours in vitro permet d&#39;études sur le développement. En outre, la survie à long terme des cultures (jusqu&#39;à six semaines) les rend appropriés pour l&#39;étude de la lente, de la dégénérescence progressive de ces neurones.

<table><tbody><tr><td>Mélange de nutriments moyen Eagle modifié de Dulbecco F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr> Solution <tr><td>saline équilibrée de Hanks (HBSS) (1X), liquide</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin, inactivé par la chaleur (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100X), liquide</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution (45 % (en poids/vol) dans l’eau</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine BSA</td><td>Sigma</td><td>A9430</td><td></td></tr><tr><td>Laminine d’Engelbreth-Holm-Swarm Sarcome murin Membrane basale</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (0,05 % (en poids/vol)</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin culture cellulaire d’albumine (BSA) testée</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-tyrosine hydroxylase (Th)</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P60101-0&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine, solution à 0,01 %</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Map2 (protéines associées aux microtubules-2A et -2B) Anticorps</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Synapsine-1</td><td>Millipore</td><td>AB1543P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-lapin IgG&nbsp ; &nbsp ; sondes</td><td>moléculaires</td><td>d’anticorps A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 âne anti-lapin IgG&nbsp ; &nbsp ; sondes</td><td>moléculaires</td> d’anticorps <td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-mouton IgG&nbsp ; &nbsp ; sondes</td><td>moléculaires</td><td>d’anticorps A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 âne anti-mouton IgG&nbsp ; &nbsp ; sondes</td><td>moléculaires</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 âne anti-souris IgG&nbsp ; &nbsp ; sondes</td><td>moléculaires</td><td>d’anticorps A-21203</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan (0,4 % (poids/vol))</td><td>Biowhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à contraste de phase inversé</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 40 C</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont Outils</td><td>scientifiques fins</td><td>May-45</td><td></td></tr><tr><td>Pince à glissement de couverture &ndash ; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-33</td><td></td></tr><tr><td>Deux pinces Dumont #45 &ndash ; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11245-30</td><td></td></tr><tr><td>Porte-lame/briseur à poignée plate - 11cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris d’étudiant - Droit 11,5 cm</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Illuminateur halogène à fibre optique</td><td>Nikon</td><td>MKII</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes jetables en verre borosilicaté Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Proscitech</td><td>SVZ2NIOU</td><td></td></tr><tr><td>0,2 & micro ; m unités de filtration stérile</td><td>Nalgene</td><td>NL-CE-156-4020</td><td></td></tr><tr><td>100x20 mm Boîtes de Pétri</td><td>BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>Round Cover Slip #1 Epaisseur Verre allemand 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-10012&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement, culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

La dégénérescence des neurones dopaminergiques mésencéphaliques (mesDA) est la caractéristique pathologique de la maladie de Parkinson. L’étude des processus biologiques impliqués dans les fonctions physiologiques et la vulnérabilité et la mort de ces neurones est essentielle pour comprendre les causes sous-jacentes et découvrir le remède à cette maladie neurodégénérative courante. Les cultures primaires de neurones mesDA fournissent un outil pour l’étude des propriétés moléculaires, biochimiques et électrophysiologiques, afin de comprendre le développement, la survie à long terme et la dégénérescence de ces neurones au cours de la maladie. Nous présentons ici une méthode détaillée pour l’isolement, la culture et la maintenance des neurones dopaminergiques du mésencéphale à partir d’embryons de souris E12.5 (ou de rats E14.5). Les conditions de culture cellulaire optimisées dans ce protocole entraînent la présence de projections axonales et dendritiques, de connexions synaptiques et d’autres propriétés morphologiques neuronales, qui rendent les cultures appropriées pour l’étude des caractéristiques physiologiques, biologiques cellulaires et moléculaires de cette population neuronale.

Immunohistochimie contre la tyrosine hydroxylase (Th) montre que, entre 0,5 à 1% des cellules en culture sont dopaminergique. Projections neuronales apparaissent dans deux heures après placage et par le premier jour, les axones et les dendrites se distinguent (Figure 2), en utilisant la tyrosine hydroxylase (TH) et la protéine 2 (carte2) anticorps associée aux microtubules (Figure 3). Les neurones de survivre pendant plus de six semaines, et montrent une vaste excroissance. Le ratio neu...

Les causes de la dégénérescence des neurones dopaminergiques du mésencéphale au cours de la maladie de Parkinson ne sont pas entièrement comprises. Les systèmes de culture cellulaire constituent un outil essentiel pour l’étude des propriétés neurophysiologiques de ces neurones. Nous présentons ici un protocole optimisé, qui peut être utilisé pour la modélisation in vitro de la neurodégénérescence.

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

L'objectif de cette procédure est d'isoler et de cultiver efficacement des neurones primaires à partir du mésencéphale ventral de rongeur. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant le mésencéphale d'embryons de rongeur. La deuxième étape consiste à isoler soigneusement le mésencéphale ventral.Ensuite, le tissu neuronal doit être dissocié afin d'obtenir une suspension monocellulaire. La dernière étape consiste à ensemencer les neurones primaires en petit volume sur des lamelles avant de transférer les cellules attachées dans une plaque de 24 puits plus tard. Enfin, un anticorps et la microscopie par immunofluorescence sont utilisés pour identifier les neurones dopaminergiques au sein de la culture.Les neurones dopaminergiques du mésencéphale interviennent dans plusieurs fonctions, notamment le contrôle du mouvement et des émotions dans les processus cognitifs ainsi que dans la sécrétion de récompense du cerveau. Ils sont également impliqués dans des affections neurologiques et neuropsychiatriques, telles que la maladie de Parkinson, les troubles liés à la dépendance et la schizophrénie. La méthode de réparation du mésencéphale ventral.Les cultures neuronales peuvent être utilisées pour étudier la physiologie et les propriétés cellulaires des neurones dopaminergiques, ainsi que pour comprendre les causes de leur dégénérescence au cours de troubles tels que la maladie de Parkinson. Commencez par préparer les lamelles.Les faire bouillir dans de l'éthanol à 70 % pendant au moins 30 minutes afin d'éliminer toute trace de graisse. Ensuite, stériliser les lamelles en autoclave. Transférer les lamelles dans des plaques de 24 puits et ajouter un demi-millilitre de polyol all athene à chacune.Bien, laissez les plaques incuber pendant une heure à température ambiante. Notez que la durée de conservation de la solution polyol ou Athene prête à l'emploi est d'un mois. Ensuite, lavez les lamelles trois fois avec un demi-millilitre d'eau par lavage.Sans les trois lavages complets, les cellules cultivées ne survivraient pas plus de 24 heures. Ensuite, préparez la solution de laminine. Assurez-vous de la décongeler lentement sur de la glace.Ensuite, dissoudre la lamine dans du D-M-E-M-F 12 froid et l'utiliser immédiatement. Ajouter maintenant 0,5 mL de solution working de lamine fraîchement préparée dans chaque puits et laisser les plaques incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Enfin, lors de la préparation de la pipette en verre, polir leurs extrémités à la moitié de leur taille normale.Effectuez une incision abdominale pour exposer les poches utérines et, à l’aide de pinces, détachez l’utérus. Transférez l’utérus dans du HBSS glacé contenu dans une boîte de 100 millimètres et commencez à prélever les embryons à l’aide de pinces. Transférez les embryons isolés dans une nouvelle boîte contenant du HBSS froid.Maintenant, sous un microscope stéréo, préparez-vous à accéder à cette région du mésencéphale ventral avec un grossissement de 10 x. Disséquez le mésencéphale et l'arc céphalique en coupant le cerveau au niveau de l'isthme et de la région frontière entre le mésencéphale et le diencéphale céphalique à l’aide de ciseaux chirurgicaux ou de pinces. Après avoir retiré l’ensemble du mésencéphale, effectuez une incision dans la région médiale dorsale du mésencéphale.À l’aide de pinces, retirez les méninges. Cette étape est cruciale pour la réussite de la culture neuronale. Les cellules non neuronales mourront en culture dans ces conditions et émettront des signaux néfastes pour les neurones voisins.Applatissez maintenant le tissu du mésencéphale en forme de papillon. Coupez environ la moitié de chaque aile avec une lame stérile, en laissant le mésencéphale ventral. Transférez le mésencéphale ventral dans du HBSS glacé dans un tube conique de 15 millilitres.Ensuite, passez à la dissection du processus suivant sur autant d'embryons que possible en moins d'une heure. Les embryons conservés sur glace pendant plus d'une heure présentent une faible viabilité cellulaire. Pour garantir une viabilité élevée des neurones dopaminergiques, le temps écoulé entre la dissection et le semis ne doit pas dépasser une heure.En outre, la suppression des méninges est cruciale pour la survie des neurones sous hotte. Retirer le HBSS du prélèvement de mésencéphale ventral. Puis ajouter un millilitre de trypsine 0,05 % chaude A DTA, une quantité suffisante de solution pour 12 fragments de tissu.Incuber le tissu à 37 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes. Sous la hotte, remplacer la tripsine A DTA par un millilitre de milieu de désactivation. Agiter doucement pour mélanger, puis éliminer le milieu de désactivation, mais laisser suffisamment de milieu pour que les cellules dissociées ne soient pas perdues.Ensuite, lavez les tissus deux fois avec le milieu complet sans perdre les cellules. Ajoutez maintenant un millilitre de milieu complet. Puis, triturez le tissu avec la pipette à embout arrondi sans former de bulles, jusqu'à l'obtention d'une suspension de cellules individuelles.Huit à dix passages devraient suffire. À l'issue de cette durée, centrifuger les cellules à 400 G pendant cinq minutes. Éliminer le milieu et resuspendre les cellules dans un millilitre de milieu complet.Pipetez les cellules jusqu'à quatre fois pour obtenir une suspension. Commencez par compter et évaluer la viabilité des cellules dans la suspension. Utilisez l'exclusion au bleu de tripan avec un cytomètre sanguin.Réglez maintenant la suspension cellulaire à 1500 cellules par microlitre. Ensuite, transférez les bouchons de tubes microcentrifuge stérilisés dans des boîtes de 100 millimètres. Placez les lamelles préparées sur les bouchons à l’aide de pinces.Ne pas laver les lamelles et éviter qu'elles ne s'assèchent. Déposer 100 microlitres de suspension sur chaque lamelle. Cette méthode quelque peu inhabituelle assure une viabilité de la culture de 90 % et constitue une étape cruciale pour la réussite.Ensuite, fermer la boîte de Pétri et la transférer à l’incubateur pendant une heure. Après l’incubation, transférer soigneusement les lamelles avec le milieu vers des plaques de 24 puits contenant chacun 400 microlitres de milieu complet préchauffé à 37 degrés Celsius, puis incuber les cellules toute la nuit. Les premières heures sont les plus critiques pour la survie cellulaire dans les 24 heures. Ajouter doucement un demi-millilitre de milieu complet dans chaque puits.Toutes les deux semaines. Renouvelez la moitié du milieu. Si le milieu devient jaune, le renouvellement de la moitié du milieu peut être effectué plus tôt, mais il doit tout de même rester peu fréquent.Les neurones dopaminergiques survivront plus de six semaines dans ces conditions. Après deux semaines de culture, une immunohistochimie dirigée contre la tyrosine hydroxylase et les marqueurs neuronaux montre que 1 % des cellules sont dopaminergiques. Les prolongements neuronaux apparaissent dans les deux heures suivant la mise en culture.À la fin de la première journée en culture, les axones et les dendrites sont distinguables. En définitive, les neurones survivent plus de six semaines et présentent une prolifération extensive suite à cette procédure. D'autres méthodes telles que la transduction virale, la fluorescence immunologique ou l'électrophysiologie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions mécanistiques dans les neurones dopaminergiques.

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Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal

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