Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

L'objectif de cette procédure est d'isoler et de cultiver efficacement des neurones primaires à partir du mésencéphale ventral de rongeur. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant le mésencéphale d'embryons de rongeur. La deuxième étape consiste à isoler soigneusement le mésencéphale ventral.

Ensuite, le tissu neuronal doit être dissocié afin d'obtenir une suspension monocellulaire. La dernière étape consiste à ensemencer les neurones primaires en petit volume sur des lamelles avant de transférer les cellules attachées dans une plaque de 24 puits plus tard. Enfin, un anticorps et la microscopie par immunofluorescence sont utilisés pour identifier les neurones dopaminergiques au sein de la culture.

Les neurones dopaminergiques du mésencéphale interviennent dans plusieurs fonctions, notamment le contrôle du mouvement et des émotions dans les processus cognitifs ainsi que dans la sécrétion de récompense du cerveau. Ils sont également impliqués dans des affections neurologiques et neuropsychiatriques, telles que la maladie de Parkinson, les troubles liés à la dépendance et la schizophrénie. La méthode de réparation du mésencéphale ventral.

Les cultures neuronales peuvent être utilisées pour étudier la physiologie et les propriétés cellulaires des neurones dopaminergiques, ainsi que pour comprendre les causes de leur dégénérescence au cours de troubles tels que la maladie de Parkinson. Commencez par préparer les lamelles.

Les faire bouillir dans de l'éthanol à 70 % pendant au moins 30 minutes afin d'éliminer toute trace de graisse. Ensuite, stériliser les lamelles en autoclave. Transférer les lamelles dans des plaques de 24 puits et ajouter un demi-millilitre de polyol all athene à chacune.

Bien, laissez les plaques incuber pendant une heure à température ambiante. Notez que la durée de conservation de la solution polyol ou Athene prête à l'emploi est d'un mois. Ensuite, lavez les lamelles trois fois avec un demi-millilitre d'eau par lavage.

Sans les trois lavages complets, les cellules cultivées ne survivraient pas plus de 24 heures. Ensuite, préparez la solution de laminine. Assurez-vous de la décongeler lentement sur de la glace.

Ensuite, dissoudre la lamine dans du D-M-E-M-F 12 froid et l'utiliser immédiatement. Ajouter maintenant 0,5 mL de solution working de lamine fraîchement préparée dans chaque puits et laisser les plaques incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Enfin, lors de la préparation de la pipette en verre, polir leurs extrémités à la moitié de leur taille normale.

Effectuez une incision abdominale pour exposer les poches utérines et, à l’aide de pinces, détachez l’utérus. Transférez l’utérus dans du HBSS glacé contenu dans une boîte de 100 millimètres et commencez à prélever les embryons à l’aide de pinces. Transférez les embryons isolés dans une nouvelle boîte contenant du HBSS froid.

Maintenant, sous un microscope stéréo, préparez-vous à accéder à cette région du mésencéphale ventral avec un grossissement de 10 x. Disséquez le mésencéphale et l'arc céphalique en coupant le cerveau au niveau de l'isthme et de la région frontière entre le mésencéphale et le diencéphale céphalique à l’aide de ciseaux chirurgicaux ou de pinces. Après avoir retiré l’ensemble du mésencéphale, effectuez une incision dans la région médiale dorsale du mésencéphale.

À l’aide de pinces, retirez les méninges. Cette étape est cruciale pour la réussite de la culture neuronale. Les cellules non neuronales mourront en culture dans ces conditions et émettront des signaux néfastes pour les neurones voisins.

Applatissez maintenant le tissu du mésencéphale en forme de papillon. Coupez environ la moitié de chaque aile avec une lame stérile, en laissant le mésencéphale ventral. Transférez le mésencéphale ventral dans du HBSS glacé dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, passez à la dissection du processus suivant sur autant d'embryons que possible en moins d'une heure. Les embryons conservés sur glace pendant plus d'une heure présentent une faible viabilité cellulaire. Pour garantir une viabilité élevée des neurones dopaminergiques, le temps écoulé entre la dissection et le semis ne doit pas dépasser une heure.

En outre, la suppression des méninges est cruciale pour la survie des neurones sous hotte. Retirer le HBSS du prélèvement de mésencéphale ventral. Puis ajouter un millilitre de trypsine 0,05 % chaude A DTA, une quantité suffisante de solution pour 12 fragments de tissu.

Incuber le tissu à 37 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes. Sous la hotte, remplacer la tripsine A DTA par un millilitre de milieu de désactivation. Agiter doucement pour mélanger, puis éliminer le milieu de désactivation, mais laisser suffisamment de milieu pour que les cellules dissociées ne soient pas perdues.

Ensuite, lavez les tissus deux fois avec le milieu complet sans perdre les cellules. Ajoutez maintenant un millilitre de milieu complet. Puis, triturez le tissu avec la pipette à embout arrondi sans former de bulles, jusqu'à l'obtention d'une suspension de cellules individuelles.

Huit à dix passages devraient suffire. À l'issue de cette durée, centrifuger les cellules à 400 G pendant cinq minutes. Éliminer le milieu et resuspendre les cellules dans un millilitre de milieu complet.

Pipetez les cellules jusqu'à quatre fois pour obtenir une suspension. Commencez par compter et évaluer la viabilité des cellules dans la suspension. Utilisez l'exclusion au bleu de tripan avec un cytomètre sanguin.

Réglez maintenant la suspension cellulaire à 1500 cellules par microlitre. Ensuite, transférez les bouchons de tubes microcentrifuge stérilisés dans des boîtes de 100 millimètres. Placez les lamelles préparées sur les bouchons à l’aide de pinces.

Ne pas laver les lamelles et éviter qu'elles ne s'assèchent. Déposer 100 microlitres de suspension sur chaque lamelle. Cette méthode quelque peu inhabituelle assure une viabilité de la culture de 90 % et constitue une étape cruciale pour la réussite.

Ensuite, fermer la boîte de Pétri et la transférer à l’incubateur pendant une heure. Après l’incubation, transférer soigneusement les lamelles avec le milieu vers des plaques de 24 puits contenant chacun 400 microlitres de milieu complet préchauffé à 37 degrés Celsius, puis incuber les cellules toute la nuit. Les premières heures sont les plus critiques pour la survie cellulaire dans les 24 heures. Ajouter doucement un demi-millilitre de milieu complet dans chaque puits.

Toutes les deux semaines. Renouvelez la moitié du milieu. Si le milieu devient jaune, le renouvellement de la moitié du milieu peut être effectué plus tôt, mais il doit tout de même rester peu fréquent.

Les neurones dopaminergiques survivront plus de six semaines dans ces conditions. Après deux semaines de culture, une immunohistochimie dirigée contre la tyrosine hydroxylase et les marqueurs neuronaux montre que 1 % des cellules sont dopaminergiques. Les prolongements neuronaux apparaissent dans les deux heures suivant la mise en culture.

À la fin de la première journée en culture, les axones et les dendrites sont distinguables. En définitive, les neurones survivent plus de six semaines et présentent une prolifération extensive suite à cette procédure. D'autres méthodes telles que la transduction virale, la fluorescence immunologique ou l'électrophysiologie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions mécanistiques dans les neurones dopaminergiques.