Suivi moelle osseuse de souris monocytes In Vivo

L’objectif global de cette procédure est de visualiser le trafic de monocytes dans la moelle osseuse du crâne d’une souris vivante à l’aide de l’imagerie à deux photons. Tout d’abord, la souris est anesthésiée et injectée avec une solution de pourriture, rumine dextran pour marquer le système vasculaire. La souris est ensuite placée dans un support métallique personnalisé, et le cuir chevelu de l’arrière de l’os pariétal à l’os frontal est retiré.

Un anneau en caoutchouc est ensuite appliqué directement sur le crâne avec de la colle chirurgicale et les réservoirs sont remplis de solution saline liquide. Enfin, la microscopie multiphotonique est utilisée pour suivre le développement des cellules fluorescentes au fil du temps dans la moelle osseuse du crâne. Ce moi peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de l’immunohématologie, comme le mécanisme de mobilisation des monocytes à l’état d’équilibre ou après une chimiothérapie.

Cette méthode peut donc donner un aperçu du comportement des monocytes modulaires. Il peut également être appliqué à l’étude d’autres sous-ensembles de cellules de la moelle osseuse en fonction de la spécificité du rapporteur de la grippe utilisé. Le protocole suivant utilise un microscope multiphotonique couplé à un laser en cristal de saphir de titane et à un modulateur op pour le contrôle de la puissance laser.

Pour permettre l’enregistrement simultané de trois canaux fluorescents, la configuration doit inclure trois détecteurs de balayage externes non DS ou nds avec une combinaison de miroirs dichroïques de 565 nanomètres et 690 nanomètres, de 565, 610 nanomètres et de 500 à 550 nanomètres, ainsi qu’un filtre passe-court de 485. Notez que dans cette configuration, la génération de seconde harmonique ou SHG et la protéine fluorescente cyan ou CFP sont détectées par le NDD après le filtre passe-court 485. La CFP est également détectée par le NDD.

Après le filtre passe-bande 500 550 et la tige Domine Dextran sont détectés par le NDD. Après le filtre passe-bande 565 610, plusieurs heures avant l’imagerie, réglez la chambre de chauffe à 32 degrés Celsius. Cette température maintiendra la souris à une température corporelle optimale tout au long de l’expérience.

Notez que la chambre de chauffe utilisée ici est sombre et recouvre les objectifs et la plaque motorisée du système. Cela permet d’éviter la contamination par la lumière externe. Pour allumer le système en premier, allumez le laser saphir titane, puis allumez le reste du système de microscope.

Lancez le logiciel d’acquisition. Ici, le logiciel Zeiss Zen est utilisé. Réglez la gamme de longueurs d’onde du laser sur 870 nanomètres.

Sélectionnez ensuite le NDD approprié pour l’enregistrement. La souris utilisée dans cette expérience est une souris transgénique appelée Mac blue, qui exprime la protéine fluorescente cyan sous le contrôle du promoteur du récepteur du LCR. La méthode d’anesthésie recommandée dépend de la durée de l’imagerie, il est donc préférable de consulter le document d’accompagnement pour plus de détails.

Un aspect difficile de cette procédure est l’injection de la veine T, car il est assez facile de manquer la veine. Si cela se produit, effectuez plutôt une injection rétroorbitale. Une fois la souris anesthésiée, utilisez des pinces pour vérifier l’inconscience en stimulant le coussinet plantaire. Prochain.

Pour colorer le système vasculaire, injectez 200 microlitres de bâtonnet domine dextran dans la veine de la queue, ou pour la coloration des neutrophiles. Injecter 100 microlitres de solution saline contenant LY six GPE. Après l’injection, placez la tête de la souris entre les plaques de retenue d’un support stéréotaxique sur mesure adapté au microscope et à l’inhalateur de gaz anesthésique.

Cela garantit que les mouvements respiratoires n’affecteront pas l’imagerie. Serrez les plaques de maintien pour étirer la peau entre les oreilles et la tête. Vérifiez la stabilité.

En appuyant doucement sur la tête avec des pinces, la tête ne doit pas bouger. Assurez-vous ensuite que l’animal respire normalement. Pour préparer la souris à l’imagerie à deux photons, utilisez un doigt pour appliquer de l’éthanol à 70 % sur les cheveux du cuir chevelu, en prenant soin d’éviter les yeux.

Placez ensuite un drapé avec une découpe pour exposer le cuir chevelu. Ensuite, à l’aide de ciseaux et de pinces stériles, coupez la peau et retirez complètement le cuir chevelu de l’arrière de l’os pariétal vers l’os frontal. Maintenez une distance de trois millimètres avec les yeux et les oreilles pour éviter des saignements importants.

Retirez le tissu conjonctif lâche ou le périoste qui recouvre le crâne. Ensuite, à l’aide d’une serviette en papier chaude imbibée de PBS, lavez les cheveux restants comme indiqué ici. À l’aide d’une aiguille de petit calibre, appliquez de la colle chirurgicale sur toute la périphérie d’un anneau en caoutchouc de 10 millimètres de diamètre.

Placez ensuite l’anneau en caoutchouc directement sur le crâne avec une autre serviette en papier imbibée de PBS. Nettoyez une dernière fois l’intérieur de l’anneau. Ajoutez du PBS chaud pour immerger complètement le crâne.

Placez ensuite le support stéréotaxique sous l’objectif. Une fois la souris en place, utilisez le microscope oculaire à transmission directe pour voir le crâne et le positionner grossièrement dans le champ de vision du microscope. Dans le coin supérieur gauche de la fenêtre du logiciel d’imagerie, cliquez sur acquisition en direct.

Un scan en direct du tissu apparaîtra au milieu de la fenêtre à l’aide de la commande directionnelle du microscope dans le logiciel. Localisez une région avec le signal CFP et le signal de domination de tige pour ajuster la mise au point. Réglez ensuite la puissance laser au minimum pour obtenir le meilleur rapport signal/bruit avec un minimum de dommages photo.

Ensuite, dans le logiciel, cliquez sur l’onglet du canal et augmentez la puissance de gain sur les PMT pour chaque NDD afin de réduire le blanchiment des photos et les dommages causés aux photos, puis cliquez sur l’onglet approprié pour régler les paramètres d’acquisition sur un seul balayage avec un temps de séjour des pixels de 1,58 microseconde et une résolution de 512 par 512 pixels avec un grossissement de 1,5. Une fois les paramètres d’enregistrement définis, cliquez sur la commande d’acquisition en direct et examinez le tissu pour choisir un champ x, y, Z souhaité à surveiller en temps réel. Ici, un champ comprenant à la fois des zones vasculaires et parenchymateuses est choisi.

Ensuite, pour enregistrer ou enregistrer les coordonnées X, Y, Z du champ affiché dans l’onglet positions. Cliquez sur ajouter. Répétez ce processus avec jusqu’à trois champs supplémentaires pour enregistrer toutes les coordonnées qui vous intéressent.

Les coordonnées apparaîtront sur l’onglet des positions à côté pour indiquer au logiciel les instructions. Pour capturer une pile de trois images DZ, cliquez sur déplacer vers dans l’onglet des positions du logiciel pour aller à la première position enregistrée et sélectionnez Zack dans la case supérieure gauche du logiciel. Cela ouvrira l’onglet de la pile Z, se déplacera vers la position Z la plus élevée et ajustera la puissance laser en conséquence.

Cliquez sur régler en dernier, puis passez à la position la plus profonde. Ajustez la puissance du laser. Cliquez ensuite sur définir en premier.

L’épaisseur de l’analyse de la pile doit être adaptée rapidement à la cellule étudiée. Les cellules en mouvement sortiront rapidement de la France, vous devrez donc acquérir une pile plus épaisse. Ensuite, vous acquérez pour les cellules lentes.

Dans la zone supérieure gauche, sélectionnez la commande série chronologique pour ouvrir l’onglet Séries chronologiques. Définissez le nombre de cycles et l’intervalle de temps. Ici, un volume sera acquis toutes les 30 secondes pendant 60 cycles.

Cela représente 30 minutes en temps réel. Pour commencer l’imagerie en accéléré dans la fenêtre principale, sélectionnez démarrer l’expérience tout au long de la procédure, continuez à surveiller l’animal pour vous assurer qu’il est inconscient. Assurez-vous également que l’objectif est correctement immergé.

Une fois la séquence capturée, utilisez une pipette pour ajouter du PBS chaud. Entamez ensuite une deuxième acquisition de 30 minutes. Si une disparition progressive du signal est observée lors de l’acquisition, vérifiez qu’il n’y a pas de fuite PBS.

Une fois que toutes les vidéos requises ont été enregistrées, que l’analyse des données a été effectuée comme décrit dans le document d’accompagnement pour étudier la physiologie de la moelle osseuse par imagerie intra-vitale, une souris transgénique Mac bleue a été injectée avec 2 millions de bâtonnets de Dalton domine dextran et imagée par microscopie à balayage laser à deux photons. Comme démontré dans cette vidéo, dans la micrographie résultante, le système vasculaire coloré avec 2 millions de bâtonnets de Dalton domine dextran est montré en os rouge, montré en bleu est visualisé par la génération de seconde harmonique. Les monocytes positifs à l’ECFP représentés en cyan sont situés dans des niches parenchymateuses, qui sont considérées comme des zones sombres entre le système vasculaire et l’os, et à l’intérieur des vaisseaux.

Pour calculer la trajectoire de chaque cellule, une imagerie en accéléré a été effectuée. Cette vidéo montre le comportement migratoire des monocytes parenchymateux. Le signal ECFP est en cyan et les voies migratoires de chaque point rouge apparaissent en vert.

Ici, le comportement migratoire des monocytes vasculaires peut être observé. Ces données peuvent être utilisées pour calculer à la fois la vitesse moyenne et le déplacement carré moyen des cellules. Notez que les monocytes vasculaires présentent à la fois un déplacement accru et une vitesse accrue par rapport aux monocytes parenchymateux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de suivre les monocytes de moelle osseuse de souris in vivo à l’aide de deux images photo Après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer la migration cellulaire et l’interaction dans la moelle osseuse, qui représentent un site très important de l’hématopoïèse, mais aussi d’autres fonctions fondamentales telles que l’amorçage de l’antigène et la mémoire immunologique.