Analyser les effets des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes de débit

L'objectif général de cette procédure est d'examiner comment les cellules résidentes du tissu influencent la capacité des cellules endothéliales vasculaires à favoriser le recrutement des leucocytes pendant l'inflammation. Cet objectif est atteint en établissant d'abord des co-cultures de cellules endothéliales avec des cellules souches mésenchymateuses, à l'aide de l'un des deux modèles vasculaires in vitro, le modèle de lame microscopique et le modèle à filtre. Ces cultures sont ensuite traitées avec une cytokine avant l'essai d'écoulement.

Le système d'adhérence basé sur l'écoulement est ensuite assemblé étape par étape, avec des modifications apportées en fonction du modèle utilisé. La dernière étape consiste à perfuser des leucocytes sur les cellules endothéliales et à observer leur recrutement à partir de l'écoulement ainsi que leur comportement ultérieur. En fin de compte, ces tests d'adhérence multicellulaires basés sur l'écoulement ont montré qu'une communication croisée entre les cellules souches mésenchymateuses et les cellules endothéliales supprime le recrutement des neutrophiles durant l'inflammation.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du trafic des leucocytes, telles que : comment les cellules résidentes des tissus, par exemple les cellules souches mésenchymateuses, modifient-elles ce processus ? Ce processus change-t-il dans des maladies telles que l'inflammation chronique ou le cancer ? Pouvez-nous utiliser ces connaissances pour aider à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ? Pour commencer, établissez des cocultures de cellules endothéliales avec des cellules souches mésenchymateuses en utilisant le modèle de lame à microcanaux ou le modèle à filtre, comme décrit dans le protocole du texte, afin de monter le système de flux.

Commencez par allumer le chauffage et réglez-le à 37 degrés Celsius. Ensuite, fixez une seringue de 20 millilitres sans piston, ainsi qu'une seringue de cinq millilitres à un robinet à trois voies. Puis mesurez et coupez un long morceau de tube de 2,4 millimètre dont la longueur correspond approximativement à la distance entre le robinet et le raccord à trois voies.

Coupez un morceau de tube de 1,3 mm de diamètre mesurant entre huit et dix millimètres de longueur, puis insérez-le à une extrémité du tube épais. Fixez l'extrémité du tube épais sur le robinet trois voies et reliez le tube fin à un orifice du micro-robinet électronique trois voies afin de former le réservoir de lavage.

Ensuite, fixez le robinet à la chambre en plexiglas à l’aide de ruban micropore. Puis, préparez un morceau de tuyau épais et un morceau de tuyau fin mesurant six à huit millimètres de longueur, et insérez le tuyau fin dans une extrémité du tuyau épais. Fixez l’extrémité du tuyau épais à une seringue de deux millilitres dont le piston a été retiré.

Connectez maintenant l'extrémité du tube fin de la seringue de deux millilitres à un port du micro-électrovanne électronique afin de constituer le réservoir d'échantillon. Ensuite, mesurez et coupez un long morceau de tube fin correspondant à la distance entre la micro-électrovanne et le centre de la platine du microscope. Pour le modèle de lame microscopique, fixez un morceau de tube épais de huit à dix millimètres à l'extrémité du tube fin.

Ensuite, placer un raccord en forme de L à l'extrémité du tube épais. Ce dernier sera relié à la lamelle microscopique ou au modèle de filtre. Fixer un morceau de tubulure manométrique bleue Portex de huit à dix millimètres à l'extrémité du tube fin.

Placez ensuite l'extrémité du tube fin sur la microvalve. Le tube devient la sortie commune pour les réservoirs de lavage et d'échantillons. Remplissez les réservoirs avec du chlorure de sodium tamponné au phosphate contenant de l'albumine sérique bovine.

Amorcer le tube en faisant circuler du PBSA afin d'éliminer toutes les bulles d'air, puis fixer le tube du manomètre à une seringue en verre de 50 millilitres. Sur le modèle de micro-lame, fixer uniquement un morceau de tube épais de 10 à 12 millimètres à l'extrémité du tube manométrique menant à la seringue en verre. Placer un raccord en forme de L à l'extrémité du tube épais.

Préparez la seringue en la remplissant avec 10 millilitres de PBSA. Retournez la seringue de manière à ce que l'extrémité reliée au tube soit orientée vers le haut, puis expulsez toutes les bulles d'air avant de la recharger avec cinq millilitres de PBSA. Enfin, placez la seringue en verre dans une pompe à seringue pour l'infusion et le retrait.

Régler le débit de remplissage et le diamètre de la seringue en verre pour configurer les micro-lames en vue de l'écoulement. Placer la micro-lame sur la platine d'un microscope à contraste de phase inversé. Tourner le robinet à trois voies pour permettre à la PBSA de circuler à travers le tube d'entrée.

Connectez le raccord en forme de L au port d'entrée d'un canal de lame microscopique. Ensuite, placez le raccord en forme de L provenant de la pompe à seringue dans le port de sortie du canal. Nettoyez tout PBSA qui a coulé sur la lame microscopique.

Alternativement, pour le modèle de filtre, découpez d'abord un morceau de film parafilm à la même taille que la lame de verre à l'aide d'un gabarit métallique. Ensuite, découpez une fente de 20 par quatre millimètres dans le film parafilm à l'aide d'un gabarit métallique afin de créer le canal d'écoulement. Utilisez le joint en paraform pour marquer le canal d'écoulement sur la lame de verre.

Alignez les bords des six filtres sur la lame de verre. Veillez à ce que le filtre recouvre les marques du canal d'écoulement. Découpez soigneusement le filtre à l’aide d’un scalpel de type 10.

Ensuite, recouvrez soigneusement le filtre avec un joint en paraforme, en veillant à ce que la fente du canal d'écoulement soit au milieu du filtre. Utilisez un morceau de papier propre et chassez toutes les bulles d'air. Placez maintenant la lame couvre-objet dans l'encoche de la plaque inférieure de la chambre d'écoulement en plexiglas.

Positionnez la plaque supérieure en plexiglas au-dessus du joint et vissez les plaques ensemble. Tournez le robinet trois voies pour permettre au tampon de lavage PBSA de circuler à travers la vanne. Ensuite, reliez le tube du manomètre au port d'entrée de la plaque supérieure en plexiglas.

Faites circuler du PBSA dans le canal d'écoulement pour permettre aux bulles de passer. Ensuite, reliez le tube du manomètre provenant de la pompe à seringue à l'orifice de sortie de la plaque en plexiglas. Éliminez tout PBSA qui aurait pu couler sur la plaque supérieure de la chambre.

Enfin, placer la chambre sur la platine d'un microscope inversé à contraste de phase et régler la mise au point afin de visualiser les cellules endothéliales situées au-dessus des filtres pour perfuser les leucocytes sur les cellules endothéliales. Régler la pompe à seringue sur le mode de remplissage et appuyer sur « exécuter » une fois la mise au point effectuée. Pour visualiser la monocouche de cellules endothéliales, introduire deux millilitres de neutrophiles purifiés dans le réservoir d'échantillon et laisser réchauffer pendant deux minutes.

Ensuite, lavez l'endothélium avec du PBSA pendant deux minutes. Ouvrez le robinet pour perfuser les neutrophiles sur l'endothélium. Administrez la bolus de neutrophiles pendant quatre minutes.

Fermer le robinet et perfuser du PBSA à partir du réservoir de lavage pour la durée restante de l'expérience. Pendant la réalisation de l'expérience, s'assurer que des bulles d'air ne traversent pas le système à aucun moment du dosage, car cela perturberait la monocouche de cellules endothéliales et entraînerait le détachement des neutrophiles adhérents. Enregistrer le recrutement des neutrophiles soit pendant l'écoulement des neutrophiles, soit après la perfusion, à l'aide d'un logiciel de capture d'images numérique.

Identifier le centre du canal en déplaçant l'objectif vers le bord du canal au niveau du port d'entrée et en repérant le milieu du port. Effectuer tous les enregistrements numériques sur au moins cinq à dix champs situés au centre du canal d'écoulement ou pendant l'enregistrement de l'écoulement des neutrophiles. Prendre des images d'un seul champ toutes les 10 secondes pendant une minute, puis avancer le long du canal et enregistrer un autre champ pendant une minute.

Répéter ce processus pendant toute la durée du bolus afin d'enregistrer les données post-perfusion. Effectuer un enregistrement de dix secondes sur cinq à dix champs situés au centre du canal d'écoulement pour évaluer le comportement des leucocytes. Prendre des images chaque seconde durant l'intervalle de dix secondes.

Cela permet un temps suffisant pour la capture en flux et l'analyse du comportement des neutrophiles adhérents. Enregistrez un seul champ contenant au moins 10 neutrophiles ayant traversé la membrane pendant cinq minutes, en prenant des images toutes les 30 secondes. Ces données peuvent servir à calculer la vitesse des cellules migrées ; enregistrez également une autre série de champs de dix secondes.

Cela permet aux neutrophiles de migrer à travers la monocouche endothéliale. Enfin, arrêtez la pompe à perfusion et retirez le tube de sortie, puis le tube d'entrée, démontez la chambre d'écoulement et rincez le réservoir d'échantillon avec du PBSA. Répétez l'opération pour les filtres et les canaux de micro-lame suivants avant de passer à l'analyse du recrutement et du comportement des leucocytes, comme décrit dans le protocole textuel. Dans le modèle de micro-lame, la stimulation par cytokine avec le facteur de nécrose tumorale alpha a significativement augmenté l'adhésion des neutrophiles à l'endothélium de manière dépendante de la dose.

En outre, une diminution dépendante de la dose de TNF alpha a été observée dans le pourcentage de neutrophiles roulant sur la surface endothéliale. Ceci se reflétait dans l'augmentation dépendante de la dose dans le pourcentage de neutrophiles migrant à travers la monocouche endothéliale et subissant ainsi une migration transendothéliale. Des résultats similaires ont été observés avec le test d'écoulement basé sur un filtre.

Par exemple, la stimulation par le TNF alpha a augmenté l'adhésion des neutrophiles de manière dépendante de la dose. La co-culture de cellules endothéliales avec des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse a réduit de façon significative l'adhésion des neutrophiles par rapport aux cellules endothéliales cultivées seules, comme prévu pour le modèle de lamelle microscopique.

Encore une fois, des effets similaires ont été observés lorsque le modèle basé sur un filtre a été utilisé, avec une adhésion moindre observée en co-culture par rapport à la monoculture. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment étudier la manière dont les cellules stromales communiquent avec les cellules endothéliales pour influencer le recrutement des leucocytes durant l'inflammation.