Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80

L’objectif global de cette procédure est de détecter la simulation et l’ubiquitination des protéines cinétiques de la levure bourgeonnante, NDC 10 et NDC 80. Pour ce faire, il faut d’abord récolter des cellules de levure qui expriment un drapeau de sifflement marqué SMT trois et MT marqué NDC 10 ou NDC 80, et fabriquer des extraits de protéines à partir de ces cellules. La deuxième étape consiste à purifier les trois conjugués SMT marqués par un drapeau de sifflement pour la détection de la sommation ou à immunoprécipiter les protéines cinétiques mik tagg pour la détection de l’ubiquitination.

Par la suite, la somme ou l’ubiquitination est détectée par l’analyse par transfert de Western. En fin de compte, la présence d’un modèle d’échelonnement pour NDC 10 et NDC 80 confirme que ces protéines sont simulées et ubiquitinées. La méthode de purification des protéines décrite permet de détecter à la fois la simulation et l’ubiquitination des protéines connico ND C 10 et NDC 80 dans le sacro de levure bourgeonnante.

Mon cci. Le principal avantage de cette technique est que la souche que nous avons créée a deux attaques d’épitopes, l’une sur la protéine test, et l’autre qui permet la détection de la simulation. L’utilisation de ces étiquettes réduit le bruit de fond en raison de la réactivité croisée qui est fréquemment observée lors de l’utilisation de sérum polyclonal.

La démonstration de cette procédure sera faite par Canero Uni, un chercheur de mon laboratoire. Les protéines d’intérêt seront extraites de granules de cellules de levure préparées préalablement et stockées à moins 20 degrés Celsius. Resus, suspendez les cellules dans 0,5 millilitres de tampon glacé.

Utilisez un tampon de guine si l’extrait est destiné à un dosage par tirage utilisant du nickel-nitrile, de l’acide triacétique ou des billes de nickel NTA superflow. Utilisez le tampon A si l’extrait est destiné à l’immunoprécipitation. Gardez les tubes sur la glace en tout temps.

Transférez les suspensions cellulaires à deux millilitres. Vissez deux bouchons à chaque tube. Ajoutez un volume de billes de verre égal au volume de la bille de suspension de la cellule.

Battez les cellules dans un mini batteur à billes pendant deux minutes à température ambiante, puis placez les tubes sur de la glace pendant deux à trois minutes. Répétez le battage des perles et le glaçage trois fois. Vortex à grande vitesse à quatre degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes.

Vérifiez les cellules par visualisation au microscope pour vous assurer qu’elles sont lysées. Les cellules lysées apparaîtront comme des fantômes sombres et n’auront pas de limite ou de forme définie. Idéalement, au moins 80 % des cellules doivent être couchées.

Ensuite, utilisez une punaise pour percer un trou au fond du tube. Placez le bouchon à vis sans serrer et placez le tube dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger à 1000 fois G pendant une minute.

Pour recueillir le lysat, transférez-le dans une centrifugeuse à micro-tube de centrifugation à 15 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour recueillir les protéines extraites. Après avoir mesuré la concentration des protéines extraites à l’aide d’un kit de dosage des protéines, normalisez tous les extraits afin que chacun contienne la même quantité de protéines. Portez le volume total à un millilitre avec le tampon approprié.

Environ cinq milligrammes de protéines totales sont obtenus à partir de 50 OD 600 de cellules. Conservez 50 microlitres de la protéine extraite sous forme d’extrait de cellule entière. Les 950 microlitres restants d’extrait de protéines seront utilisés ultérieurement pour la purification des protéines ou l’immunoprécipitation des protéines marquées MT.

Ajoutez 50 microlitres de tampon d’échantillon deux x laly aux 50 microlitres d’extrait de cellules entières. Incuber les échantillons à 100 degrés Celsius dans un bloc de chaleur pendant trois à cinq minutes avant de les analyser par western blot. Commencez cette procédure en préparant les billes de nickel NTA superflow nécessaires à la purification.

Obtenez la quantité de billes nécessaire par centrifugation à basse vitesse pendant une minute. Retirez le surnageant et lavez les billes avec du PBS. Ajoutez un millilitre de PBS et retournez le tube de haut en bas jusqu’à ce que les billes soient remises en suspension.

Recueillir les billes par centrifugation à basse vitesse et éliminer le surnageant. Lavez les perles de cette manière cinq fois au total. Suspendez les billes dans un millilitre de tampon de guine et aliquotez-les dans le nombre de tubes correspondant aux échantillons à traiter.

Prélever les billes par centrifugation à basse vitesse et prélever le surnageant pour chaque échantillon. Ajoutez 950 microlitres de l’extrait de cellule entière. Préparé plus tôt à 100 microlitres de perles.

Incuber sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius pendant au moins quatre heures ou toute la nuit. Centrifugeuse à 800 à 1500 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Économisez 50 microlitres de surnageant.

Ajoutez 50 microlitres de tampon d’échantillon à ce surnageant et incubez à 100 degrés Celsius dans un bloc de chaleur pendant trois à cinq minutes. 10 microlitres de chaque échantillon seront ensuite analysés par western blot. Lavez une fois les billes de nickel NTA superflow avec un millilitre de tampon à guine pendant cinq à 10 minutes sur une plate-forme à bascule à température ambiante.

Ensuite, lavez les billes cinq fois avec un millilitre de tampon de rupture après le lavage final avec le tampon de rupture, remettez les billes en suspension dans 90 microlitres de deux tampons d’échantillon x laly. Ajoutez 10 microlitres d’une molaire pour aider à dissocier la protéine marquée du nickel NT. Une bille incube à 100 degrés Celsius dans un bloc de chaleur pendant trois à cinq minutes. Vortex puis centrifuger à 13 000 fois G pendant 30 secondes.

Transférez le surnageant dans un tube frais. Pour commencer cette procédure, obtenez la quantité nécessaire d’anticorps anti-gel d’affinité aéro chimique par centrifugation à basse vitesse. Retirez le surnageant, lavez la résine avec le tampon A Ajoutez un millilitre de tampon A et retournez le haut vers le bas jusqu’à ce que la résine soit remise en suspension.

Récupérez la résine par centrifugation à basse vitesse et retirez le surnageant. Lavez cinq fois au total. Mettre la résine en suspension dans un millilitre de tampon A et aliquote dans le nombre de tubes correspondant aux échantillons à traiter.

Récupérez la résine par centrifugation à basse vitesse et retirez le surnageant. Ajoutez 950 microlitres d’extrait de cellules entières à 25 microlitres de résine Incuber sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius pendant la nuit du lendemain. Centrifugeuse à 800 à 1500 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius.

Économisez 50 microlitres de surnageant. Ajoutez 50 microlitres de tampon d’échantillon de deux fois plus longtemps à ce surnageant et incubez à 100 degrés Celsius dans un bloc de chaleur pendant trois à cinq minutes. Lavez la résine avec un tampon et ajoutez un millilitre de tampon, puis retournez le haut sur le bas jusqu’à ce que la résine soit remise en suspension.

Récupérez la résine par centrifugation à basse vitesse et retirez le surnageant après l’avoir retiré du lavage final. Remettez la résine en suspension dans 100 microlitres de tampon d’échantillon sume, incubez à 100 degrés Celsius dans un bloc de chaleur pendant trois à cinq minutes. Vortex puis centrifuger à 13 000 fois G pendant 30 secondes.

Transférez le surnageant dans un tube frais. Enfin, chargez tous les échantillons collectés à partir de ce protocole. Dans une page SDS, gel pour l’analyse par transfert Western, des souches de levure qui expriment un drapeau de polyhistamine marqué SMT trois ou HF SMT trois et MT marquées NDC 80 et NDC 10 ont été utilisées pour détecter la simulation des protéines cinétiques.

Les substrats HF SMT trois ont été purifiés par affinité à l’aide de billes de nickel et détectés avec un anticorps anti-drapeau. La NDC 80 synthétisée a été détectée dans les substrats HF SMT trois lorsqu’elle a été sondée avec un anticorps anti-micro. L’absence de protéines modifiées dans les souches témoins sans HF SMT trois indique la spécificité de l’interaction entre HF SMT trois et ses protéines cibles.

De plus, la sommation de NDC 80 et NDC 10 est réduite dans les cellules traitées au désole NOCO pour détecter l’ubiquitination de NDC 80 et NDC 10. Mick a étiqueté ND C 80 ou ND C 10 était immunoprécipité et l’analyse par western blot a été effectuée avec des anticorps anti mic et anti ubiquitine l’analyse de l’extrait de cellule entière et le surnageant a confirmé l’expression de NDC 80 M et NDC 10 M Les échantillons immunoprécipités sondés avec anti MIC ont montré plusieurs bandes de haut poids moléculaire suggérant que NDC 80 et NDC 10 contiennent des modifications post-traductionnelles. Un modèle d’échelonnement d’échantillons immunoprécipités sondés avec de l’anti-ubiquitine a montré que le ND C 80 et le ND C 10 sont ubiquitinés.

Les schémas d’échelonnement de NDC 80 et NDC 10 ont été améliorés par un traitement avec un inhibiteur de protéasome MG 1 32. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la technique de purification des protéines qui permet la détection de l’accouplement et la vaccination de la chauve-souris NN.