Name: Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Apprenez une technique de purification protéique pour détecter la sumoylation et l'ubiquitination des protéines kinétochoriennes Ndc10 et Ndc80 chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode utilise l'analyse Western blot pour confirmer ces modifications post-traductionnelles essentielles.

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Nous remercions le Dr Oliver Kerscher pour son soutien et ses conseils, ainsi que les membres du laboratoire Basrai pour leur soutien et leurs commentaires sur l’article. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health.

1. Croissance de cellules de levure <ol><li> Ensemencer les cellules de levure dans 30 ml de YPD (tableau 1) dans un petit flacon. Incuber à 30 ° C pendant la nuit avec agitation. </li><li> Diluer les cellules à une densité optique de 0,2 à 600 nm (DO 600 = 0,2) dans 50 ml de YPD et incuber à 30 ° C avec agitation par secousses. </li><li> Cultiver la culture jusqu&#39;à une densité optique de 1,0 à 600 nm (DO 600 = 1,0). </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 2000 xg et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 40 ml d&#39;eau stérile et centrifuger pendant 5 min à 2000 x g pour laver les cellules. Jeter le surnageant et stocker le culot cellulaire à -20 ° C. </li></ol> 2. Extraction des protéines <ol><li> Resuspendre les cellules dans 0,5 ml de tampon guanidine glacée (tableau 1) pour le dosage d&#39;excursion basse à l&#39;aide de Ni-NTA Superflow ou des billes de tampon A (tableau 1) pour immunoprécipitation. Garder les tubes sur la glace en tout temps. </li><li> Transfert à 2 ml tube de bouchon à vis. </li><li> Ajouter le même volume de billes de verre (Table des Matières). </li><li> Bead-a battu les cellules dans un mini cordon batteur (Table des Matières) pendant 2 min à température ambiante, puis le placer sur la glace pendant 2-3 min. Répétez cette opération trois fois. </li><li> Vortex à haute vitesse à 4 ° C pendant 30-60 min. Vérifier les cellules par visualisation au microscope à faire en sorte que les cellules sont lysées. Remarque: Les cellules lysées apparaîtront fantômes sombres et manquent une frontière ou une forme définie. De façon optimale au moins 80% des cellules doivent être lysées. </li><li> Percer un trou dans le fond du tube à l&#39;aide d&#39;une tige de poussée et le lieu dans une collection de 15 ml tube conique (bouchon à vis doit être lâche). </li><li> Centrifuger à 1000 g pendant 1 min à recueillir le lysat. </li><li> Transférer le lysat dans un tube de centrifugeuse micro. </li><li> Centrifuger à 15 000 g pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer les protéines extraites. </li><li> Mesurer la concentration des protéines extraites à l&#39;aide de la protéine assakit y (Table des matières) et de normaliser tous les extraits à contiennent la même quantité de protéines. Porter le volume total à 1 ml avec un tampon approprié. Note: Dans la région de 5 mg de protéine totale est obtenue à partir de 50 OD 600 cellules. </li><li> Enregistrer 50 ul (250 pg de protéine si la protéine totale extraite de l&#39;étape 5 est 2,10 mg) sous forme d&#39;extrait de cellules entières (WCE). Ajouter 50 ul de tampon d&#39;échantillon Laemmli 2x (tableau 1) et incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant à 3-5 min. Charge 10 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l&#39;analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot). </li></ol> 3. Purification de HF SMT3 conjugués <ol><li> Obtenir des billes de Ni-NTA Superflow (Table des Matières) nécessaires pour les expériences (100 ul de billes par exemple) par centrifugation à basse vitesse (800-1,500 xg) pendant 1 min. Retirer le surnageant. </li><li> Laver les perles 5x avec 1 ml de PBS (Table des Matières): Inverser haut-sur-bas jusqu&#39;à ce que les billes sont remises en suspension, de recueillir les perles par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant. </li><li> Suspension de billes dans 1 ml de tampon guanidine (tableau 1) et les aliquoter dans le nombre de tubes qui correspondent à des échantillons à traiter. Recueillir des perles par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant. Mélanger les perles bien en inversant haut sur le bas. Remarque: Mélanger perles bien en inversant bottom top-over. </li><li> Pour chaque échantillon, ajouter 950 ul de la WCE restant (de l&#39;étape 2.11: Extraction de protéines) à 100 ul de billes de Ni-NTA Superflow de. </li><li> Incuber sur une plate-forme à bascule à 4 ° C pendant au moins 4 heures ou toute la nuit. </li><li> Centrifugeuse à 800-1,500 g pendant 1 min à 4 ° C. </li><li> Économisez 50 pi comme surnageant (SUP). Ajouter 50 ul de tampon d&#39;échantillon Laemmli 2x et incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant à 3-5 min. Charge 10 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l&#39;analyse Western Blot (Section 5: anal Western blotana-). </li><li> Laver les perles une fois avec 1 ml de tampon de guanidine pour 5-10 minutes sur une plate-forme à bascule. </li><li> Laver les perles 5x avec 1 ml de tampon de rupture (tableau 1) pendant 5-10 minutes sur une plate-forme à bascule. </li><li> perles de remettre en suspension dans 90 ul de tampon d&#39;échantillon Laemmli 2x. </li><li> Ajouter 10 pl de 1 M d&#39;imidazole. Note: Imidazole aide à dissocier la protéine marquée par His des Ni-NTA beads due à l&#39;interaction entre concurrence imidazole et les perles. </li><li> Incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 3-5 min. </li><li> Vortex, puis centrifuger à 13 000 g pendant 30 sec. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Charge 10-20 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l&#39;analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot). Remarque: ul 10-20 correspond à 0,5-1,0 mg de l&#39;entrée, si 5 mg de WCE est utilisé. </li></ol> 4. Immunoprécipitation des protéines kinétochoriens marqué par myc <ol><li> Obtenez-c-Myc lutte contre affinité gel d&#39;agarose untibody (Table des Matières) nécessaire pour les expériences (25 ul par échantillon de résine) par centrifugation à basse vitesse (800-1,500 xg). Retirer le surnageant. </li><li> Laver 5x de résine avec 1 ml de tampon A: Inverser haut-over-bas jusqu&#39;à ce que la résine est remis en suspension, recueillent résine par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant. </li><li> Suspension de résine dans 1 ml de tampon A et les aliquoter dans le nombre de tubes qui correspondent à des échantillons à traiter. Recueillir résine par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant. Remarque: Mélanger la résine et en inversant haut-over-bas. </li><li> Ajouter 950 ul de la WCE restant (de l&#39;étape 2.11: Extraction de protéines) à 25 ul de résine. </li><li> Incuber sur un agitateur oscillant à 4 ° C pendant une nuit. </li><li> Centrifugeuse à 800-1,500 g pendant 1 min à 4 ° C. </li><li> Économisez 50 pi comme surnageant (SUP). Ajouter 50 ul de tampon d&#39;échantillon Laemmli 2x et incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant à 3-5 min. Loannonce 10 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l&#39;analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot). </li><li> Laver 5x de résine avec 1 ml de tampon A: Inverser haut-over-bas jusqu&#39;à ce que la résine est remis en suspension, recueillent résine par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension la résine dans 100 ul de tampon d&#39;échantillon de SUMEB (tableau 1). Remarque: un tampon d&#39;échantillon de SUMEB contient 8 M d&#39;urée et 1% de SDS (état dénaturant fort). </li><li> Incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 3-5 min. </li><li> Vortex, puis centrifuger à 13 000 g pendant 30 sec. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Charge 10-20 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l&#39;analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot). Remarque: ul 10-20 correspond à 0,5-1,0 mg de l&#39;entrée, si 5 mg de WCE est utilisé. </li></ol> 5. Analyse Western Blot <ol><li> Charger les extraits de protéines de 4-12% de gels Bis-Tris (Table des Matières) et perfélectrophorèse ORM à 120 V pendant 90 min (tampon de marche: Table des matières). </li><li> Transfert de protéines à partir de gel sur une membrane de nitrocellulose (Table des Matières) en utilisant un appareil de transfert à 30 V pendant 90 minutes (tampon de transfert: Table des Matières). </li><li> Bloquer la membrane dans 5% de lait / 1x TBST (tableau 1) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Incuber la membrane avec l&#39;anticorps primaire (Table des Matières) dans 5% de lait / 1x TBST nuit à 4 ° C. Pour les anticorps primaires, en utilisant une dilution de 1: 1000 (anticorps anti-Flag et anti-Ub) ou 1: 5 000 (anticorps anti-Myc). </li><li> Laver 3x de la membrane pendant 10 min chacun avec 1x TBST. </li><li> Incuber la membrane avec l&#39;anticorps secondaire (Table des Matières) dans 5% de lait / 1x TBST pendant 1 heure à température ambiante. Utiliser une dilution 1: 5000 d&#39;anticorps secondaire. </li><li> Laver 3x de la membrane pendant 10 min chacun avec 1x TBST. </li><li> Incuber membrane avec ECL workisolution ng (Table des Matières) pendant 5 min. </li><li> Exposer la membrane sensible au bleu le film X-Ray (Table des matières) et de développer l&#39;aide d&#39;un développeur automatique (Table des matières). </li></ol>

<ol><li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-1%3A+Ubiquitin+gains+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li>
<li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li>
<li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li>
<li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li>
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<li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase-promoting+complex%2Fcyclosome+controls+HEC1+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li>
<li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIZ1%2FSIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li>
<li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158(2007).</li>
<li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+assembly%3A+if+you+build+it%2C+they+will+come%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

marqueurs d&#39;épitopes tels que HA, Myc, Drapeau, et la TPS sont largement utilisés pour l&#39;analyse biochimique des protéines. Construction de souches avec HF-Smt3 et protéines kinétochoriens marqué par myc, comme Ndc10 et Ndc80, facilite la détection des PTM tels que la sumoylation et ubiquitination. HF-Smt3 déroulant test permet la détection de protéines kinétochoriens sumoylated, Ndc10 et Ndc80 (Figure 1). Le protocole de purification par affinité et analyse western blot en utilisant un anticorp...

L&#39;ubiquitination et sumoylation permettent la conjugaison de l&#39;ubiquitine et le modificateur de petite ubiquitine (SUMO; Smt3 dans S. cerevisiae 1) à une protéine cible, respectivement. PTM de protéines kinétochoriens affectent leurs niveaux cellulaires et des interactions protéine-protéine au cours des différentes phases du cycle cellulaire afin d&#39;assurer la ségrégation des chromosomes fidèle. Par exemple, les niveaux cellulaires de CSE4 / CENP-A et la protéine de kinetochore extérieure DSN1 sont réglementés par protéolyse ubiquitine pour assurer la stabilité du génome 2-5. La déstabilisation de équipements kinétochoriens-microtubules incorrectes nécessite la kinase B IPL1 / Aurora, qui phosphoryle et complexes Dam1 Ndc80 qui interagissent directement avec les microtubules 8.6. Malgré l&#39;identification de plus de soixante-dix protéines kinétochoriens, il ya très peu d&#39;études qui examinent les modifications de ces protéines avec PTM, par exemple, l&#39;ubiquitine et SUMO. Une limitation importante est la capacité à préserver la PTMs pendant la purification et la rareté des anticorps sur mesure pour la détection de la sumoylation PTM tels que, la phosphorylation, la méthylation, et d&#39;autres. Caractérisation des protéines kinétochoriens sumoylated Ndc10, CEP3, BIR1 et Ndc80 utilisé un anticorps personnalisé 9. En outre, Ndc10 a été impliquée en tant que substrat pour l&#39;ubiquitination 10. HEC1 humain (Ndc80 chez S. cerevisiae) est également substrat pour ubiquitination, réglementé par APC / C-hCdh1 ligase E3 11. Par conséquent, Ndc10 et Ndc80 sont de bons candidats pour l&#39;optimisation du protocole de détecter à la fois la sumoylation et ubiquitination en S. cerevisiae. Pour faciliter l&#39;identification de la sumoylation, nous avons construit des souches qui expriment HF-Smt3 et Myc-tagged Ndc10 ou Ndc80. L&#39;utilisation de marqueurs d&#39;epitope (HF: His6-Flag) minimise le bruit de fond dû à la réactivité croisée qui est fréquemment observé dans le sérum polyclonal dirigé contre une protéine candidate. Nous avons élaboré un protocole d&#39;affinitépurifier les conjugués HF-SMT3 commercial et ensuite utilisé des anticorps anti-Myc et anti-Flag pour détecter la présence de sumolyated Ndc10 et Ndc80 dans la préparation purifiée Smt3. Pour ubiquitination, nous avons conçu un protocole d&#39;immunoprécipitation modifiée qui conserve ubiquitination des protéines kinétochoriens marqué par myc et effectué une analyse western blot avec un anticorps commercial anti-Ub pour détecter ubiquitination de Ndc10 et Ndc80.

<table><tbody><tr><td>Perles de verre</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>0,5 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Mini beadbeater</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8 cell disrupter</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produit chez le lapin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-Flag M2 produit chez la souris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Anticorps primaire, dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Anticorps c-Myc (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Anticorps primaire, dilution 1:5 000</td></tr><tr><td>Anticorps de souris purifié monoclonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Anticorps primaire, dilution 1:5 000</td></tr><tr><td>Ubiquitine (P4G7) anticorps monoclonal</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Anticorps primaire, dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>ECL IgG de lapin, AB entier lié à la HRP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Anticorps secondaire, dilution 1:5 000</td></tr><tr><td>ECL IgG de souris, HRP Ethique entier AB</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Anticorps secondaire, dilution 1:5 000</td></tr><tr><td>DC dosage des protéines</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0,45 mm taille des pores</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Protein Gels</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1,0 mm, 10 puits</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrat chimiluminescent</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Film radiographique sensible au bleu</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Révélateur automatique</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

protein purification technique qui permet la détection de sumoylation et ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines ndc10 et ndc80

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Les modifications post-traductionnelles (PTM), tels que la phosphorylation, la méthylation, l&#39;acétylation, l&#39;ubiquitination, et sumoylation, régulent la fonction cellulaire de nombreuses protéines. PTM de protéines kinétochoriens qui associent avec l&#39;ADN centromérique médiation ségrégation des chromosomes fidèle à maintenir la stabilité du génome. Approches biochimiques telles que la spectrométrie de masse et analyse western blot sont les plus couramment utilisés pour l&#39;identification des PTM. Ici, un procédé de purification des protéines est décrite qui permet la détection à la fois de la sumoylation et ubiquitination des protéines kinétochoriens, Ndc10 et Ndc80, dans Saccharomyces cerevisiae. Une souche qui exprime polyhistidine-marquage Flag Smt3 (HF-Smt3) et marqué par myc Ndc10 ou Ndc80 a été construit et utilisé pour nos études. Pour la détection de la sumoylation, nous avons conçu un protocole pour purifier par affinité les protéines His-étiqueté sumoylated à l&#39;aide de billes de nickel et utilisé une analyse western blot avec un anticorps anti-Myc pour détecter une sumoylated Ndc10e Ndc80. Pour la détection de l&#39;ubiquitination, nous avons élaboré un protocole pour l&#39;immunoprécipitation des protéines Myc-marqués et utilisé l&#39;analyse de western blot avec l&#39;anticorps anti-Ub pour montrer que Ndc10 et Ndc80 sont ubiquitinées. Nos résultats montrent que l&#39;épitope protéine marquée de l&#39;intérêt pour l&#39;His-Drapeau étiqueté souche Smt3 facilite la détection de plusieurs PTM. Les études futures devraient permettre une exploitation de cette technique pour identifier et caractériser les interactions entre protéines qui sont tributaires d&#39;un PTM spécifique.

Pour détecter sumoylation de protéines kinétochoriens Ndc80 et Ndc10, les souches avec HF-Smt3 et protéines kinétochoriens marqué par myc (Ndc80 ou Ndc10) ont été construits (tableau 2), comme décrit précédemment 9,12. Conjugués HF-SMT3 ont été purifiés par affinité en utilisant des billes de Ni-NTA. Analyse par Western blot purifié HF-Smt3 avec un anticorps anti-Flag a permis la détection de formes sumoylated de substrats SUMO qui étaient absentes dans la souche de contrôle sans HF-Smt3 <str...

Ce manuscrit décrit la détection de la sumoylation de protéines et ubiquitination kinétochoriens, Ndc10 Ndc80 et, dans le bourgeonnement levure Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter la SUMOylation et l'ubiquitination des protéines du noyau kinétochorien de la levure bourgeonnante, NDC10 et NDC80. Cela est réalisé en premier lieu en récoltant des cellules de levure exprimant SMT3 marqué par un tag His-Flag et NDC10 ou NDC80 marqué par un tag MT, puis en préparant des extraits protéiques à partir de ces cellules. La deuxième étape consiste à purifier les conjugués de SMT3 marqués par un tag His-Flag afin de détecter la SUMOylation, ou à immunoprécipiter les protéines du noyau kinétochorien marquées par un tag Mik afin de détecter l'ubiquitination.Ensuite, la sumoylation ou l'ubiquitinylation est détectée par analyse de type western blot. En fin de compte, la présence d'un patron en échelle pour NDC10 et NDC80 confirme que ces protéines sont sumoylées et ubiquitinylées. La méthode de purification des protéines décrite permet la détection à la fois de la sumoylation et de l'ubiquitinylation des protéines kinétochoriennes NDC10 et NDC80 chez la levure en bourgeonnement saccharomyces cerevisiae.Mon cci. Le principal avantage de cette technique réside dans la souche que nous avons créée, qui possède deux étiquettes épitopiques : l'une sur la protéine témoin, et l'autre permettant la détection de la simulation. L'utilisation de ces étiquettes réduit le bruit de fond dû à la réactivité croisée, fréquemment observée lorsqu'on utilise des sérums polyclonaux.La démonstration de cette procédure sera effectuée par Canero Uni, chercheur associé dans mon laboratoire. Les protéines d'intérêt seront extraites de pastilles de cellules de levure préparées précédemment et conservées à moins 20 degrés Celsius. Resus, suspendez les cellules dans 0,5 millilitre de tampon glacé.Utilisez le tampon guine si l'extrait est destiné à un dosage d'immunoprécipitation par affinité utilisant des billes de nitrile triacétique au nickel ou des billes superflow NTA au nickel. Utilisez le tampon A si l'extrait est destiné à une immunoprécipitation. Gardez les tubes sur de la glace en tout temps.Transférez les suspensions cellulaires à deux millilitres. Vissez un bouchon sur chaque tube. Ajoutez un volume de billes de verre équivalent au volume de la suspension cellulaire.Frapper les cellules dans un broyeur à billes miniaturisé pendant deux minutes à température ambiante, puis placer les tubes sur de la glace pendant deux à trois minutes. Répéter trois fois les cycles de broyage par billes et de refroidissement. Vortexer à grande vitesse à quatre degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes.Observer les cellules au microscope afin de vérifier qu'elles sont lysées. Les cellules lysées apparaîtront comme des fantômes sombres et ne présenteront pas de bordure ni de forme définie. Idéalement, au moins 80 % des cellules devraient être lysées.Ensuite, utilisez une épingle à tête pour percer un trou dans le fond du tube. Placez le bouchon fileté légèrement et insérez le tube dans un tube conique de 15 millilitres. Effectuez une centrifugation à 1000 ×g pendant une minute.Pour recueillir le lysat, transférez le lysat dans un tube de microcentrifugeuse et centrifugez à 15 000 × g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius afin de récupérer les protéines extraites. Après avoir mesuré la concentration des protéines extraites à l’aide d’un kit de dosage des protéines, normalisez tous les extraits de manière à ce que chacun contienne la même quantité de protéine. Ajustez le volume total à un millilitre avec le tampon approprié.Environ cinq milligrammes de protéines totales sont obtenus à partir de 50 OD 600 de cellules. Conservez 50 microlitres des protéines extraites comme extrait total de cellules. Les 950 microlitres restants d'extrait protéique seront utilisés ultérieurement pour la purification des protéines ou l'immunoprécipitation des protéines marquées MT.Ajoutez 50 microlitres de tampon d'échantillonnage 2 x laly aux 50 microlitres d'extrait de cellules entières. Incubez les échantillons à 100 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant trois à cinq minutes avant de les analyser par immunotransfert western. Commencez cette procédure en préparant les billes de nickel NTA superflow nécessaires à la purification.Obtenez la quantité de billes nécessaire par centrifugation à basse vitesse pendant une minute. Éliminez le surnageant et lavez les billes avec du PBS. Ajoutez un millilitre de PBS et retournez le tube plusieurs fois jusqu'à ce que les billes soient resuspendues.Recueillir les billes par centrifugation à basse vitesse et éliminer le surnageant. Laver les billes de cette manière un total de cinq fois. Suspendre les billes dans un millilitre de tampon guine et les répartir en aliquotes dans le nombre de tubes correspondant aux échantillons à traiter.Récupérez les billes par une centrifugation à faible vitesse et éliminez le surnageant pour chaque échantillon. Ajoutez 950 microlitres d'extrait total de cellules, préparé précédemment, à 100 microlitres des billes.Incuber sur une plateforme agitée à quatre degrés Celsius pendant au moins quatre heures ou toute la nuit. Centrifuger à 800 à 1500 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Conserver 50 microlitres du surnageant.Ajouter 50 µL de tampon d'échantillonnage 2 x à ce surnageant et incuber à 100 °C dans un bloc chauffant pendant trois à cinq minutes. Dix microlitres de chaque échantillon seront ultérieurement analysés par immunotransfert western. Laver les billes Ni-NTA Superflow une fois avec un millilitre de tampon guine pendant cinq à dix minutes sur une plateforme agitée à température ambiante.Ensuite, lavez les billes cinq fois avec un millilitre de tampon de lyse. Après le dernier lavage avec le tampon de lyse, resuspendez les billes dans 90 microlitres de tampon d'échantillonnage 2 x laly. Ajoutez 10 microlitres d'une solution d'iole à une molaire pour favoriser la dissociation de la protéine marquée par une étiquette his des billes nickel NT.A. Incubez à 100 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant trois à cinq minutes. Vortexez, puis centrifugez à 13 000 ×g pendant 30 secondes.Transférez le surnageant dans un tube propre. Pour commencer cette procédure, récupérez la quantité nécessaire d'anticorps anti-cmic aero affinity gel par centrifugation à basse vitesse. Éliminez le surnageant, lavez la résine avec le tampon A, ajoutez un millilitre de tampon A et inversez le tube plusieurs fois jusqu'à ce que la résine soit resuspendue.Recueillir la résine par centrifugation à basse vitesse et éliminer le surnageant. Laver un total de cinq fois. Suspendre la résine dans un millilitre de tampon A et aliquoter dans le nombre de tubes correspondant aux échantillons à traiter.Recueillir la résine par centrifugation à basse vitesse et éliminer le surnageant. Ajouter 950 microlitres d'extrait de cellules entières à 25 microlitres de résine. Incuber sur une plateforme agitée pendant la nuit à quatre degrés Celsius, le jour suivant. Centrifuger à 800 à 1500 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius.Conservez 50 microlitres du surnageant. Ajoutez 50 microlitres de tampon d'échantillonnage 2 x lam au surnageant et incubez à 100 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant trois à cinq minutes. Lavez la résine avec le tampon a : ajoutez un millilitre de tampon a, puis inversez le tube plusieurs fois jusqu'à ce que la résine soit resuspendue.Recueillir la résine par centrifugation à basse vitesse et éliminer le surnageant après avoir retiré le surnageant du dernier lavage. Résuspendre la résine dans 100 microlitres de tampon d'échantillon Sume, puis incuber à 100 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant trois à cinq minutes. Vortexer, puis centrifuger à 13 000 ×g pendant 30 secondes.Transférez le surnageant dans un tube neuf. Enfin, chargez tous les échantillons recueillis selon ce protocole. Sur un gel SDS-PAGE destiné à une analyse par immunotransfert, des souches de levure exprimant la protéine SMT3 marquée par un drapeau polyhistidine ou HF-SMT3 ainsi que NDC80 et NDC10 marqués par MT ont été utilisées pour détecter la simulation des protéines kinétiques.Les trois substrats de HF SMT ont été purifiés par affinité à l'aide de billes au nickel et détectés avec un anticorps anti-Flag. La protéine NDC 80 sumoylée a été détectée dans les trois substrats de HF SMT lorsqu'elle a été analysée avec un anticorps anti-mic. L'absence de protéines modifiées dans les souches témoins dépourvues de HF SMT trois indique la spécificité de l'interaction entre HF SMT trois et ses protéines cibles.En outre, la sommation de NDC 80 et de NDC 10 est réduite dans les cellules traitées au desole de NOCO afin de détecter l'ubiquitination de NDC 80 et de NDC 10. ND C 80 ou ND C 10 marqués par Mick ont été immunoprécipités et une analyse par immunobuvardage a été réalisée à l’aide d’anticorps anti-mic et anti-ubiquitine. L’analyse de l’extrait total de cellules et du surnageant a confirmé l’expression de NDC 80 M et de NDC 10 M. Les échantillons immunoprécipités révélés avec l’anticorps anti-MIC ont montré plusieurs bandes de poids moléculaire élevé, suggérant que NDC 80 et NDC 10 présentent des modifications post-traductionnelles. Un profil en échelle des échantillons immunoprécipités révélés avec l’anticorps anti-ubiquitine a montré que ND C 80 et ND C 10 sont ubiquitinés.Les profils en échelle du NDC 80 et du NDC 10 ont été renforcés par un traitement avec l'inhibiteur du protéasome MG 132. Cela confirme davantage qu'il s'agit de polyubiquitination. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la technique de purification des protéines permettant la détection de la mation et de la vaccination du NN de chauve-souris.

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L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Des mutations de gènes impliqués dans cette modification sont associés à différentes pathologies humaines. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en...

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La préparation d'extraits de levure de haute qualité est une première étape nécessaire à l'analyse des protéines individuelles ou protéomes entiers. Nous décrivons ici un protocole d'homogénéisation rapide, efficace et fiable pour les cellules de levure en herbe qui a été optimisé afin de préserver les fonctions des protéines, des interactions et des modifications post-traductionnelles.

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Contrairement à l’ubiquitine ligases, quelques ligase E3 SUMO ont été identifiés. Ce modifié in vitro SUMOylation protocole est capable d’identifier de nouveaux SUMO E3 ligases par un essai de reconstitution in vitro .

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Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80 (Vidéo) | JoVE Journal

Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80

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