Mise en place d'épithéliales humaines Enteroids et Colonoids de tout le tissu et la biopsie

L'objectif général de cette procédure est de générer des entéroïdes humains à partir de tissus intestinaux. Cela est réalisé en disséquant d'abord la muqueuse intestinale à partir du tissu sous-muqueux sous-jacent. La deuxième étape consiste à incuber la muqueuse avec du EDTA afin de favoriser la dissociation de l'épithélium du tissu conjonctif.

Ensuite, les cryptes intestinales sont séparées de l'épithélium dissocié. Enfin, les cryptes intestinales sont cultivées dans une matrice de membrane basale. En définitive, des techniques d'immunohistochimie sont utilisées pour montrer l'organisation épithéliale ainsi que des marqueurs épithéliaux spécifiques des ODI cultivés.

Les implications de cette méthode résident dans le fait que nous pouvons désormais générer des OID à partir de biopsies spécifiques aux patients, ce qui signifie que nous pouvons maintenant utiliser ce tissu en laboratoire pour étudier les maladies intestinales et poser des diagnostics, chose que nous n'avions jamais pu faire auparavant. Après avoir préparé les tampons et les réactifs conformément au protocole écrit, décongeler la membrane basale sur de la glace et pré-incuber une plaque de 24 puits dans une étuve à dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius dès la réception du tissu. Utiliser le PBS sans calcium ni magnésium ou le DPBS pour laver le tissu jusqu'à ce que le DPBS devienne limpide.

Placez le tissu dans une boîte de Pétri en verre revêtue de silicone, remplie de DPBS glacé, avec le côté muqueux orienté vers le haut. À l’aide d’épingles minucieuses, fixez le tissu en l’étirant. Ensuite, sous un microscope stéréo, utilisez des ciseaux de dissection microfins et une pince courbe à pointe fine pour détacher la muqueuse du tissu sous-muqueux et du tissu conjonctif. Puis, avec le côté muqueux toujours orienté vers le haut, étirez la muqueuse disséquée et fixez-la à plat sur la boîte de Pétri en verre revêtue de silicone.

À l’aide de pinces courbes, gratter doucement la surface de la muqueuse. Cette étape est nécessaire pour améliorer la qualité de la préparation. Recouvrir la muqueuse avec un tampon de chélation EDTA à deux millimolaire fraîchement préparé.

Ensuite, après avoir lavé le tissu sur de la glace trois à quatre fois selon le protocole décrit dans le texte sous un microscope stéréo, utilisez des pinces courbes pour gratter délicatement la muqueuse afin de libérer les cryptes intestinales à l’aide d’une pipette. Retirez délicatement la suspension de cryptes de la boîte de Pétri et transférez-la dans un tube conique de 50 millilitres. Vérifiez ensuite le tissu pour vous assurer que presque tous les cryptes ont été retirés de la muqueuse.

Filtrer la suspension de cryptes à travers un filtre de 150 micromètres deux fois et utiliser un microscope pour vérifier le passage. Après avoir lavé la suspension de cryptes et transféré le nombre de cryptes nécessaire dans un tube rond de cinq millilitres, selon le protocole décrit, centrifuger la fraction de cryptes pendant 10 minutes à 150 G et 4 degrés Celsius. Ensuite, retirer le surnageant à l’aide de pipettes prérefroidies et du matrice de la membrane basale. Resuspendre le culot de cryptes.

Appliquer 50 microlitres de suspension de cryptes dans la matrice de membrane basale par puits sur la plaque préchauffée en éjectant lentement la matrice de membrane basale au centre du puits. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes afin de permettre une polymérisation complète de la matrice de membrane basale. Ensuite, recouvrir la matrice de membrane basale avec 500 microlitres de milieu complet pour mini-intestin humain, supplémenté avec 2,5 micromolaire de CHIR 9 0 2 2 1 chacun.

Et Thien incube le tissu en changeant le milieu après deux jours, puis tous les deux jours par la suite. Cette figure montre un exemple typique de cryptes fraîchement isolées à partir d'un tissu entier. Le nombre de cryptes isolées à partir d'une biopsie est plus faible que dans le tissu entier.

Deux prélèvements biopsiques sont généralement effectués lors d'un seul passage. Chaque prélèvement biopsique donne une surface de 10 millimètres carrés, avec une moyenne de 50 à 100 criptes par biopsie. Après culture sur matrice de membrane basale pendant cinq à six jours, les cryptes s'arrondissent pour former des entéro-sphéroïdes pour l'intestin grêle et des colono-sphéroïdes pour le côlon, puis sont repiquées après sept jours.

Les entéroïdes ou OIG établis à partir de biopsies illustrés ici subissent le même développement, mais à une densité plus faible lors du semage. Par conséquent, l'ensemencement est généralement effectué après 10 à 12 jours de culture. Comme illustré ici, les OIG et les OIG présentent tous deux un côté luminal et sont tapissés d'un épithélium.

Des cellules prolifératives peuvent être observées à l'intérieur des OIDs et se situent au niveau des extrémités des bourgeons. L'imagerie confocale d'OID colorés avec l'e-cadherine, ici en vert, montre les cellules épithéliales. Cette image montre des entéroïdes en croissance provenant d'un patient atteint de mucoviscidose et d'une entéropathie en touffe due à une mutation congénitale du gène de la molécule d'adhésion des cellules épithéliales.

Après avoir suivi cette procédure ou une méthode comme la PCR en temps réel ou le Western blot, on peut répondre à des questions supplémentaires concernant un gène ou une sonde d'intérêt. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler de manière reproductible les cellules humaines Crips afin de pouvoir générer efficacement des entérites dans votre laboratoire pour répondre à des questions spécifiques à vos patients.