Génération de tissu adipeux humain cellules souches par dédifférenciation des adipocytes matures dans les cultures de plafond
7 mars 2015
Les adipocytes matures peuvent représenter une source abondante de cellules souches par dédifférenciation, ce qui conduit à une population homogène de cellules de type fibroblaste. La digestion par la collagénase est utilisée pour isoler les adipocytes matures de la graisse humaine. L’objectif de notre protocole est d’obtenir des cellules graisseuses multipotentes et dédifférenciées à partir d’adipocytes matures humains.
Les dépôts matures ont la capacité de se différencier en cellules progénitrices in vitro. Ce résultat est obtenu par la culture sous scellement, une technique dans laquelle les cellules matures sont cultivées dans un flacon complètement rempli de milieu, puis retourné. Les cellules flottantes adhèrent au flacon et modifient leur morphologie, passant d'une cellule ronde chargée de lipides à une cellule allongée de type fibroblastique. Homogène.
Des populations de cellules allongées peuvent être obtenues et traitées après réception des échantillons de tissu au laboratoire. Pesez les tissus adipeux, en fonction du nombre d'adipocytes nécessaires, et placez un volume approprié d'échantillon dans un tube de 50 ml. Deux pour la digestion, vous pouvez vous attendre à obtenir environ 1 million de cellules par gramme de tissu.
Les cultures en plafond sont réalisées avec 500 000 cellules par flacon de 25 centimètres cubes et 50 000 cellules pour chaque puits d'une plaque à six puits, en ajoutant du tampon de travail KRH supplémenté en collagénase, en hachant le tissu avec des ciseaux et en incubant le prélèvement à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Pendant l'incubation, préparez le dispositif de tubulure et de seringue. Versez la solution translucide à travers un tamis en nylon dans un bécher en plastique à l'aide de pinces.
Frottez la préparation cellulaire à travers la maille et rincez avec cinq ml de tampon de travail KRH délicatement. Transférez la suspension cellulaire filtrée dans un ensemble de 50 ml composé d'un tube et d'une seringue. Laissez reposer les adipocytes matures pendant environ 10 minutes.
Les cellules atteindront le haut du tampon par flottaison. Aspirez lentement le tampon par le bas. À l’aide d’une seringue et d’un tube, ajoutez 20 ml de tampon KRH de travail pour effectuer un lavage.
Répétez les étapes de lavage deux fois. Récupérez le tampon afin d'amener la suspension d'adipocytes à un volume final de cinq ml, puis procédez au comptage des cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Remplissez un flacon T25 aux trois quarts de son volume avec du D-M-E-M-F12 supplémenté en 20 % de sérum de veau ; transférez 500 000 adipocytes matures dans le flacon. Complétez le flacon avec le milieu et éliminez les bulles d'air présentes à la surface supérieure.
Vissez un bouchon inventé sur le flacon. Incubez le flacon à l’envers pendant une semaine dans une étuve à culture cellulaire contenant 5 % de dioxyde de carbone. Évitez tout déplacement du flacon, car les bulles résiduelles pourraient perturber l’adhérence des cellules.
Placez un coverslip au fond des puits. Insérez la douille en plastique dans le puits, puis remplissez-le avec huit ml de milieu. Veillez à ce qu'il n'y ait aucune bulle.
Placez une lame couvre-objet sur le manchon, en laissant un espace pour insérer la pointe de votre pipette. Prélève 50 000 cellules et injecte-les en plaçant la pointe entre la lame couvre-objet et le manchon. Incubez la plaque dans une étuve à culture cellulaire avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une semaine ou moins.
En fonction de la conception de l'expérience, au moins trois jours sont nécessaires pour que les cellules adhèrent à la lamelle dans une plaque différente. Retournez les lamelles dans deux millilitres de milieu. Ensuite, lors d'une culture continue, les lamelles peuvent être fixées dans du formol pour des expériences d'immunofluorescence ou pour des extractions d'ADN-ARN et de protéines.
La dédifférenciation des adipocytes matures entraîne des changements majeurs de la morphologie cellulaire. Au cours de ce processus, les adipocytes perdent leur phénotype et réduisent l'expression des transcrits généralement associés à leur fonction de stockage lipidique. Cette image d'immunofluorescence représente des cellules adipeuses à différents stades de dédifférenciation.
Les cellules à morphologie ronde expriment encore FABP4, un marqueur d'adipocyte mature, tandis que les cellules allongées ne l'expriment plus, selon la littérature. Les cellules adipeuses différenciées, souvent appelées cellules adipeuses D, peuvent être obtenues à partir de patients jeunes, âgés, maigres ou atteints de base OB. Leur capacité de culture à long terme et leur multipotence démontrée.
J'aime aussi leur potentiel en ingénierie tissulaire et en thérapie cellulaire. Elles pourraient représenter un nouveau modèle pour l'étude post mortem spécifique de la physiologie des adipocytes.
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Aperçu
Cette étude explore la dédifférenciation d'adipocytes matures en cellules souches multipotentes. En utilisant la digestion par la collagénase et les techniques de culture en anneau scellé, les chercheurs peuvent isoler et cultiver ces cellules afin d'obtenir une population homogène de cellules de type fibroblaste.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Recherche sur les cellules souches
- Biologie des adipocytes
- Techniques de culture cellulaire
Contexte
- Les adipocytes matures peuvent se dédifférencier en cellules précurseurs.
- Ce processus peut être réalisé in vitro à l'aide de méthodes de culture spécifiques.
- L'isolement des adipocytes est essentiel pour obtenir des cellules souches.
- La digestion par la collagénase est une méthode standard pour l'isolement cellulaire.
Objectif de l'étude
- Obtenir des cellules adipeuses multipotentes et redifférenciées à partir d'adipocytes matures humains.
- Établir un protocole pour l'isolement et la culture de ces cellules.
- Étudier les changements morphologiques durant la redifférenciation.
Méthodes utilisées
- Digestion par la collagénase pour isoler les adipocytes matures.
- Technique de culture en scellé pour favoriser la dédifférenciation.
- Évaluation de la morphologie cellulaire afin de confirmer la dédifférenciation.
- Quantification du rendement cellulaire en fonction du poids du tissu.
Résultats principaux
- Isolation réussie d'environ 1 million de cellules par gramme de tissu adipeux.
- Les cellules dédifférenciées présentaient une morphologie allongée de type fibroblaste.
- Des populations cellulaires homogènes ont été obtenues par les méthodes décrites.
- Mise en évidence du potentiel des adipocytes matures comme source de cellules souches.
Conclusions
- Les adipocytes matures peuvent être efficacement convertis en cellules souches multipotentes.
- Les méthodes décrites offrent une approche fiable pour la recherche sur les cellules souches.
- Cette étude contribue à la compréhension de la plasticité des adipocytes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La dédifférenciation des adipocytes matures en cellules souches multipotentes offre une nouvelle source pour les applications de médecine régénérative et de génie tissulaire. Cette approche permet une caractérisation spécifique au dépôt des fonctions des adipocytes et de leurs propriétés métaboliques, soutenant ainsi la validation de cibles dans la recherche sur les maladies métaboliques. La méthode fournit une plateforme évolutive pour générer des cellules de type fibroblaste dotées d'une multipotence démontrée, facilitant le développement de modèles précliniques et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de thérapeutiques ciblant les adipocytes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier la plasticité des adipocytes et de tester des hypothèses thérapeutiques dans les voies métaboliques liées aux maladies métaboliques.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système reproductible de validation fonctionnelle des cibles grâce à l'isolement d'adipocytes spécifiques à chaque dépôt graisseux.
- Valeur scientifique : Renforce la fiabilité prédictive en générant des populations homogènes de cellules dédifférenciées pour clarifier les voies biologiques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des procédés en aval grâce à des techniques standardisées de digestion par la collagénase et de culture en plafond.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à un rendement contrôlé d'adipocytes (environ 1 million de cellules par gramme de tissu).
- Valeur scientifique : Permet une évaluation fiable de composés à l'aide de cellules de type fibroblaste présentant une downrégulation confirmée de FABP4, marqueur de dédifférenciation.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet le développement de systèmes pertinents pour l'étude spécifique de la physiologie des adipocytes.
- Valeur opérationnelle : Garantit une continuité translationnelle, de la découverte à la validation préclinique, grâce à la capacité de culture prolongée des cellules adipeuses dédifférenciées.
- Valeur scientifique : Facilite les décisions d'avancement pondérées en risques en démontrant la multipotence et le potentiel en ingénierie tissulaire des cellules D-graisse.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés candidats et les études précliniques, en particulier pour les programmes portant sur les maladies métaboliques et la médecine régénérative.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la réduction des risques biologiques en modélisant la dédifférenciation des adipocytes in vitro.
- Criblage : Assure la disponibilité des tests et fournit des résultats quantitatifs grâce à une isolation cellulaire standardisée et une évaluation de la morphologie.
- Analytique : Fournit des paramètres mesurables, tels que les variations de l'expression de FABP4, permettant de comparer les états de dédifférenciation selon différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Permet une continuité préclinique grâce à la culture à long terme démontrée et à la multipotence des adipocytes dédifférenciés.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une capacité réutilisable de production de cellules souches dérivées des adipocytes dans le cadre de multiples études spécifiques à différents dépôts graisseux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive grâce à la réduction de l'ambiguïté mécanistique dans le changement de phénotype des adipocytes.
- Valeur opérationnelle : Normalisation et évolutivité par le biais de protocoles définis de digestion à la collagénase et de culture inversée.
- Valeur stratégique : Décisions go/no-go améliorées en permettant une caractérisation des propriétés métaboliques spécifiques aux dépôts avant l'optimisation du composé candidat.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque grâce à l'évaluation validée du rendement en cellules souches et de leur potentiel de différenciation.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans l'isolement des adipocytes primaires et les techniques de digestion par la collagénase.
- Requiert une infrastructure de culture cellulaire capable de maintenir des cultures au plafond dans des flacons inversés ou des plaques 6-puits.
- Implique une standardisation interéquipes pour garantir un rendement d'adipocytes et une évaluation de la dédifférenciation cohérents entre laboratoires.
- Suppose des adaptations lors de l'application du protocole à des tissus adipeux provenant de différents dépôts ou présentant des caractéristiques donneur différentes.
- Comprend des limites pratiques, telles que la nécessité d'un remplissage précis des milieux afin d'éviter la formation de bulles perturbant la culture inversée.
