Name: Transsynaptique génétique conditionnelle traçage dans le cerveau embryonnaire de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Découvrez le traçage transsynaptique génétique conditionnel pour visualiser les circuits neuronaux dans le cerveau embryonnaire de souris. Cette méthode permet d'analyser la connectivité neuronale à résolution cellulaire unique.

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Nous remercions Michael Candlish pour ses commentaires critiques sur le manuscrit. Ce projet a été soutenu par les subventions BO1743/6 et SFB/TRR 152 P11 et Z02 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft à Ulrich Boehm.

NOTE: Éthique Déclaration: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le comité de protection des animaux de l&#39;Université de Hambourg et l&#39;Université de la Sarre. 1. Préparation et fixation du tissu embryonnaire <ol><li> Disposer tout l&#39;équipement nécessaire pour disséquer les embryons et préparer des solutions pour la fixation ultérieure du tissu avant de sacrifier les animaux. REMARQUE: Toujours préparer une nouvelle paraformaldéhyde 4% (PFA) solution (PFA 4% dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS), ajuster le pH à 7,4). </li><li> Euthanasier chronométré souris femelle enceinte avec une procédure éthique approuvé. </li><li> Transférer la souris sur une plate-forme. Mouiller la face ventrale de l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol et faire une incision verticale à l&#39;aide des ciseaux bien aiguisés pour exposer la cavité abdominale. </li><li> Identifier la chaîne embryonnaire et tirez-le soigneusement à l&#39;aide de pince émoussée et le placer dans PBS glacé. </li><li> Retirez les embryons individuels dela chaîne embryonnaire avec des ciseaux et des pinces fines. Retirer le tissu supplémentaire autour des embryons et les laver dans PBS glacé. </li><li> Prenez une petite queue biopsie (avant de transférer l&#39;embryon dans PFA) et incuber dans la queue du tampon de lyse pour l&#39;identification de genre et le traceur allèle génotypage PCR. </li><li> À partir de l&#39;embryon au côté le plus latérale et transférer chaque embryon séparément dans un tube contenant glacée PFA 4% sur de la glace sur un agitateur. </li><li> Faire tremper les embryons à l&#39;âge de E13.5 ou moins pendant 1,5 heure sur la glace avec une agitation constante. Faire tremper les embryons à E14,5 d&#39;âge et E15.5 pendant 2,5 heures sur la glace avec une agitation constante. </li><li> Pour E16,5 embryons d&#39;âge ou plus, décapiter et enlever la peau extérieure avant de tremper la tête dans une solution PFA. Chefs d&#39;embryons E16,5 peuvent être trempées pendant 4,5 heures sur la glace avec une agitation constante. </li><li> Après fixation échéant, laver les embryons trois fois avec PBS glacé. Transférer les embryons dans 30% de saccharose dans une solution PBS à 4 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils coulentvers le bas. </li></ol> 2. congélation <ol><li> Disposer tous les matériaux nécessaires avant de commencer le processus de congélation: cryo-moules, cryo-gants, pinces plume d&#39;entomologie, stylo marqueur et composés de température de coupe optimale (OCT) </li><li> Etiqueter le cryo-moule avec un marqueur résistant à l&#39;alcool permanent (mentionner l&#39;orientation du tissu, la date et le génotype). Préparer une bouillie de glace sèche pilée et 100% d&#39;éthanol dans un seau à glace. Placez un récipient en verre à l&#39;intérieur contenant isopentane. Attendez 10 min pour le isopentane refroidir. </li><li> Pendant ce temps retirer le tissu de la solution de saccharose, essuyer l&#39;excès de saccharose dans le tissu en utilisant des lingettes de laboratoire. Transférer le tissu dans un cryo-moule pré-étiquetés avec suffisamment octobre pour couvrir le tissu. Éviter les bulles d&#39;air dans les PTOM; en particulier autour du tissu. </li><li> Orientez le tissu dans l&#39;OCT aide d&#39;une pince d&#39;entomologie plume pour éviter des dommages aux tissus. Un début de congélation en transférant la cryo-moled dans le bain isopentane pré-refroidi. Ne pas éclabousser isopentane dans les PTOM comme il ne gèlera pas correctement. Envelopper les échantillons dans du papier d&#39;aluminium et conserver à -80 ° C. </li></ol> 3. Cryosectioning <ol><li> Couper 14 sections um série minces en série »de cinq utilisant un cryostat et de recueillir sur des lames de verre SuperFrost® Plus pour immunofluorescence (IF) analyse. Conserver les diapositives à -80 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol> 4. Tracer la visualisation Utilisation du (TSA) Protocole tyramide amplification du signal <ol><li> Préparer les tampons et les réactifs nécessaires pour la coloration. Toujours fraîchement préparer le tampon Tris-NaCl-Tween (TNT), le jour de l&#39;utilisation. <ol><li> Préparer du tampon TNT en utilisant 100 ml de 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M et ddH 2 O jusqu&#39;à un volume final de 1 L. Ajouter 500 pi de Tween 20 en utilisant une pipette de 1 ml. Ajoutez le Tween 20 lentement et rincer la pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour se assurer que tous Tween 20 est ensolution. </li><li> Préparez Tris-NaCl-blocage (TNB) tampon en utilisant 100 ml de 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M et ddH 2 O jusqu&#39;à un volume final de 1 L. Ajouter 5 g de réactif de blocage (fourni avec le kit) lentement par petits incréments à la mémoire tampon, tout en agitant. Chauffer la solution progressivement à 55 ° C avec agitation continue pour dissoudre complètement le réactif de blocage (cela ne devrait pas prendre plus de 30 à 60 min). Pour obtenir un chauffage homogène utiliser un bain d&#39;eau à 55 ° C. La solution apparaît laiteux. Porter la solution à la température ambiante avant l&#39;utilisation. Aliquoter et conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme. </li><li> Reconstituer la biotine réactif tyramide (fourni avec le kit) dans Molecular Biology / HPLC DMSO. En fonction du kit est utilisé, la quantité appropriée de DMSO peut varier. Conserver la solution d&#39;achat d&#39;actions à 4 ° C. NOTE: Les sections des animaux hétérozygotes pour les allèles CRE et R26 respectifs peuvent être utilisés pour l&#39;analyse des circuits. Utilisation sréflexions à partir de la même portée transportant une Cre ou un allèle R26, respectivement, comme témoins négatifs. Traiter lames de contrôle négatives exactement comme diapositives provenant d&#39;animaux doubles hétérozygotes. En outre, inclure une lame de contrôle d&#39;un animal à double hétérozygote mais laisse de côté le réactif TSA (contrôle non amplifiée). </li></ol></li><li> Avec un scalpel frais forte enlever l&#39;excès octobre entourant les coupes de tissu et marquer la frontière autour de sections avec un stylo de PAP. </li><li> Sécher les diapositives pendant 2-3 min à température ambiante (RT). Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 minutes chacun. Incuber les lames à la température ambiante pendant 30 minutes dans 0,3% de H 2 O 2 solution dans du methanol glacé à étancher activité de peroxydase endogène. </li><li> Laver 3x avec du PBS pendant 5 min chacun à RT. Incuber pendant 10 minutes dans 0,5% de Triton X-100 dans du PBS pendant perméabilisation des tissus. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 minutes chacun. </li><li> Bloc avec TNB (solution de blocage, 200-300 pi par diapo) pour 30min à température ambiante dans une chambre humidifiée. Assurez-vous que toutes les sections sont complètement couverts par TNB. Ne laissez pas les diapositives sécher entre les étapes. </li><li> Égoutter l&#39;excès de tampon de blocage et d&#39;appliquer l&#39;antisérum primaire reconnaissant le traceur (1: 1000 de chèvre anti-WGA pour BL, 1: 15,000 de lapin anti-GFP pour GTT) dilué dans TNB pendant 2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Veillez à utiliser un volume suffisant pour couvrir complètement la section de tissu (200-300 pi par diapositive). NOTE: Les dilutions d&#39;antisérums primaires recommandés ici peuvent être ajustés. </li><li> Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation. </li><li> Incuber les sections avec un antisérum biotinylé secondaire reconnaissant l&#39;hôte du premier antisérum (1: 500 cheval anti-IgG de chèvre anti-WGA, 1: 5000 de chèvre anti-IgG de lapin anti-GFP dans TNB pendant 1 heure à température ambiante). </li><li> Laver 3x avec TNT à température ambiante pendant 5 min chacun avec agitation. Incuber dans 1: 100 streptavidine (SA) conjugué à la peroxydase de raifort (SA-HRP, à condition with le kit) dans TNB pendant 30 min à température ambiante dans une chambre humidifiée. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 minutes chacun. Pendant ce temps dégeler la TSA. </li><li> Diluer TSA 01h50 dans le CST amplification diluant (fourni avec le kit; utiliser le kit TSA pour la visualisation de BL et le kit TSA + pour GTT). Incuber les coupes de tissus dans dilué TSA précisément pour 10 min à température ambiante. Diluer TSA juste avant l&#39;utilisation, idéalement au cours de l&#39;étape de lavage précédente, ne pas utiliser de réactif dilué TSA restant pour de futures expériences; toujours se préparer frais. </li><li> Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation. Incuber à 1: 500 Alexa Fluor® 546 de la streptavidine conjugué à TNB pendant 30 min à température ambiante. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation. </li><li> Incuber pendant 10 min dans une solution bisbenzimide 5% dans du PBS à température ambiante pendant une coloration nucléaire. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation. Montez avec Fluromount G et effectuer épifluorescence ou microscopie confocale. <em&gt; Dépannage: Efficacité de transfert de traceur dépendra du niveau du locus ROSA26 dans les cellules productrices (déterminée par la ligne du pilote Cre utilisé) d&#39;expression et sur ​​le circuit neuronal analysé (par exemple nombre de neurones produisant le traceur, la convergence etc.). Par conséquent, les dilutions de antisérums primaires recommandés ici peuvent être ajustés pour empêcher signal basse ou d&#39;excès. Le fond doit toujours être analysé en utilisant des lames de contrôle appropriées (voir ci-dessus). </li></ol> 5. τlacZ coloration pour les sections embryonnaires <ol><li> Préparer les tampons et les réactifs nécessaires pour la coloration. Toujours fraîchement préparer le tampon LacZ C avant utilisation. <ol><li> Préparation de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) de solution stock (40 mg / ml) en ajoutant 40 g de X-gal à 1 ml de 70% de diméthylformamide (DMF). Couvrir de papier d&#39;aluminium et conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme. </li><li> Préparer nitro bleu de tétrazolium (NBT) stock solution (50 mg / ml) en ajoutant 50 g de NBT à 1 ml de 70% de DMF. Couvrir de papier d&#39;aluminium et conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme. </li><li> Préparez LacZ fixateur en utilisant 80 ul de glutaraldéhyde à 25%, 5 ml de PFA 4%, 20 pl de 1 M de MgCl2, 100 ul de 500 mM d&#39;EGTA, 1 ml de 1 M de tampon phosphate pH 7,4 et ddH 2 O jusqu&#39;à une finale volume de 10 ml. </li><li> Préparez LacZ en utilisant le tampon A 1 ml de 1 M de MgCl2, 5 ml de 500 mM d&#39;EGTA, 50 ml de 1 M de tampon phosphate pH 7,4 et ddH 2 O jusqu&#39;à un volume final de 500 ml. </li><li> Préparer LacZ tampon B en utilisant 1 ml de 1 M de MgCl2, 5 ml d&#39;mM d&#39;EGTA 500, 5 ml de 1% de désoxycholate de sodium, 100 ml de 10% de NP-40, 50 ml de 1 M de tampon phosphate pH 7,4 et ddH 2 O jusqu&#39;à un volume final de 500 ml. </li><li> Préparer LacZ tampon C en ajoutant 10 pi de NBT solution stock et 12,5 pi de X-gal solution stock à 1 ml de tampon B. Faire LacZ frais juste avant utilisation et couvrir de papier d&#39;aluminium. </li></ol&gt; </li><li> Sécher les lames à la température ambiante au moins pendant 10-15 min (temps préparer les diapositives avec un stylo PAP). </li><li> Fixer la section avec LacZ fixateur pendant 2 min à température ambiante dans une chambre humidifiée à l&#39;intérieur un produit chimique hotte aspirante. Laver 3 fois avec du PBS supplémenté avec 2 mM de MgCl2. </li><li> Rincer les lames avec LacZ tampon A. laver les lames avec LacZ tampon A 3 fois pendant 10 min chacune à la température ambiante. Laver deux fois avec LacZ tampon B pendant 5 minutes chacun. Incuber les lames dans LacZ tampon C à 30-37 ° C pendant 6 heures ou toute la nuit dans une chambre humidifiée. NOTE: Ajouter un volume suffisant de LacZ tampon C; diapositives ne doivent pas sécher pendant l&#39;incubation. </li><li> Après une incubation appropriée laver les lames avec du PBS additionné MgCl2 2 mM. Rincer les sections brièvement avec ddH 2 O. Lamelle avec la glycine de la gélatine de Mayer. Convient pour un microscope optique équipé d&#39;un contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) imagerie set-up. </li></ol> 6. Gender et Tracer génotypage <ol><li> Préparer du tampon de lyse de queue en utilisant 1 ml de 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 ul d&#39;mM d&#39;EGTA 500, 200 ul de SDS à 10%, 400 ul de NaCl 5 M et ddH 2 O pour obtenir un volume final de 10 ml. </li><li> Ajouter 500 pi de tampon de lyse queue à chaque tube Eppendorf contenant une biopsie de la queue. Ajouter la proteinase K à une concentration finale de 100 mg / ml. Incuber une nuit sur un agitateur à 55 ° C. </li><li> Centrifuger les échantillons à 17 000 g pendant 10 min à température ambiante. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation. Ajouter 500 ul d&#39;isopropanol au surnageant. Mélanger pendant au moins 5 minutes en inversant les tubes de haut en bas. </li><li> Spin dans la centrifugeuse à 17 000 g pendant 5 min à température ambiante. Verser le surnageant. Ajouter 200 ul d&#39;éthanol à 70%. Agiter pendant au moins 5 min. </li><li> Centrifuger à 17 000 g pendant 5 min. Retirer le surnageant avec un Pipetman (ne pas verser off). Sécher la pastille dans une chambre chaude (37 ° C) pendant 15 à 30 min. </li><li> Resuspendre le culot dans 100 pifaible pH 8,0 TE ou de l&#39;eau à l&#39;aide des conseils de gros calibre filtré. Mettre en 55 ° C pendant 1 h et à 37 ° C pendant la nuit pour une bonne dissolution. Conserver à 4 ° C. </li><li> Utiliser une pi d&#39;ADN pour la réaction PCR (mélange réactionnel de 50 pi contenant 1 pi de l&#39;ADN de queue, 2,5 pi de DMSO, 22 heures de chaque amorce, 25 uM de chaque dNTP et 1 M de bétaïne). Amorces de PCR pour le génotypage et l&#39;identification de genre sont énumérés dans le tableau des matériaux. </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Exprimant traceurs transsynaptique comme transgènes pour tracer les circuits neuronaux de populations neuronales génétiquement définies présente plusieurs avantages par rapport à l&#39;injection stéréotaxique de traceurs ou des virus neurotopic. Tout d&#39;abord, le traceur est produit comme une protéine endogène et donc ne provoque pas de réponse immunitaire et une voie neuronale sélective peut être analysé en différents animaux avec une reproductibilité élevée. Deuxièmement, parce que ce est un procédé non invasif, il...

Chemin tracé anatomique est l&#39;un des outils les plus couramment utilisés pour déchiffrer la relation entre le cerveau et le comportement 1. Progrès dans les technologies de circuits neuronaux traçage a accordé neuroscientifiques avec la capacité de retracer les circuits neuronaux de populations de neurones génétiquement identifiés chez la souris deux. En dépit de ces progrès techniques, il reste difficile de démêler la formation des circuits neuronaux en particulier pendant la maturation embryonnaire. Ce est parce que la plupart des méthodes de traçage développées à ce jour sont basées sur l&#39;injection de traceurs transsynaptique stéréotaxique ou des virus neurotropes génétiquement modifiés (Figure 1) 2,3. Bien que ces techniques d&#39;atteindre la résolution spatiale et temporelle de la connectivité, plusieurs limitations inhérentes telles que les injections traçantes techniquement difficiles dans le cerveau en développement, la reproductibilité du point d&#39;injection, inflammation au potentiel du point d&#39;injection et le plus imporcytotoxicité tantly causée par des virus neurotropes limiter leur utilisation 4. Une méthode alternative consiste à exprimer que les traceurs transsynaptique transgènes dans des souris génétiquement modifiées. Nous avons récemment modifié cette technique et développé un système binaire de transsynaptique génétique traçage de cartographier les circuits neuronaux de toute population neuronale génétiquement identifié cinq. Notre stratégie expérimentale est basée sur deux nouvelles souches de souris knock-in, qui expriment soit la bidirectionnel traceur orge lectine (BL) 6 ou le traceur rétrograde toxine tétanique fragment C fusionnée à la GFP (GTT) 7 à partir du locus ROSA 26 après à médiation par Cre recombinaison. Ici, nous avons utilisé ces souches de souris pour exprimer sélectivement et BL GTT dans les neurones qui produisent kisspeptin, un neuropeptide qui est impliquée dans la régulation de la maturation de l&#39;axe de reproduction 8,9. Nous démontrons que cette technique est apte à visualiser le développement et la maturation des bisoucircuits neuronaux peptine pendant le développement embryonnaire du cerveau de la souris femelle 5. Stratégie d&#39;élevage Le R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) et les R26-GFP-TTC (GTT) lignes de traçage sont knock-in 5 souches qui portent allèles ROSA26 recombinantes. La R26-BIZ et les allèles R26-GTT sont transcriptionnellement silencieux en raison de la présence d&#39;un signal d&#39;arrêt de transcription fort, qui est flanquée par deux sites loxP 5. L&#39;expression du transgène et BIZ GTT est activé par l&#39;élimination médiée par Cre du signal d&#39;arrêt de la transcription. Les allèles R26 et R26-BIZ-GTT peuvent être utilisés indépendamment par simple croisement avec une ligne de pilote Cre. Pour les animaux d&#39;analyse hétérozygotes pour les allèles Cre et R26 respectifs peuvent être utilisés. Chiens d&#39;un souche portant un allèle Cre ou une R26, respectivement, devraient être utilisés comme témoins. En variante, il est également possible de générer des triple knock-in animaux porteurs des allèles Cre, R26 et R26-BIZ-GTT, mais cela nécessitera une croix supplémentaire.

<table><tbody><tr><td>Bisbenzimide (colorant Hoechst 33258)</td><td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cryo moule (Peel-a-way)</td><td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylformamide (DMF)</td><td>VWR Chemicals</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Sigma</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane (Méthyl 2-butane)</td><td>Sigma</td><td>M32631-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine glycine Kaiser’s</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Sigma</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 substitut</td><td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Parafarmaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glissières Superfrost</td><td>Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>kit TSA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>Kit TSA plus</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>na</td> Microscope optique équipé de l’imagerie <td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 équipé du logiciel</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>Microscope fluroscence</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 équipé du logiciel</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-WGA (reconnaît BL)</td><td>Vector Laboatories</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>Cheval biotinylayé anti-chèvre</td><td>IgG Vector Laboatories</td><td>BA-9500</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre biotinylée anti-lapin IgG</td><td>Vector Laboatories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti-GFP (reconnaît GTT)</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti-GnRH</td><td>Affinity Bio Réactif</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488-donkey anti-lapin IgG Thermo</td><td>Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Amorces</td></tr><tr><td>BL Fwd (pour le génotypage BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAGATGAGCACCAGGGC</td></tr><tr><td>BL Rev (pour le génotypage BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre Fwd (pour le génotypage Cre)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGAGGTGTTCG</td></tr><tr><td>Cre Rev (pour le génotypage Cre)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC Fwd (pour le génotypage GTT)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT</td></tr><tr><td>TTC Rev (pour le génotypage GTT)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY Fwd (pour le génotypage par sexe)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY Rev (pour le génotypage du sexe)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 Fwd</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAAAT</td></tr><tr><td>SA Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

transsynaptique génétique conditionnelle traçage dans le cerveau embryonnaire de souris

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Le traçage du chemin anatomique est d’une importance cruciale pour déchiffrer la relation entre le cerveau et le comportement. Cependant, il est techniquement difficile de démêler la formation des circuits neuronaux au cours de la maturation embryonnaire du cerveau, car la plupart des méthodes de traçage transsynaptique développées à ce jour dépendent de l’injection de traceur stéréotaxique. Pour surmonter ce problème, nous avons développé une stratégie génétique binaire pour le traçage génétique transsynaptique conditionnel dans le cerveau de la souris. À cette fin, nous avons généré deux souches de souris knock-in complémentaires pour exprimer sélectivement le traceur transsynaptique bidirectionnel lectine d’orge (BL) et le fragment C de la toxine tétanique transsynaptique rétrograde à partir du locus ROSA26 après recombinaison médiée par Cre. La production de traceurs spécifiques aux cellules chez ces souris est codée génétiquement et ne dépend pas de l’injection mécanique de traceurs. Par conséquent, notre approche expérimentale est adaptée pour étudier la formation des circuits neuronaux dans le cerveau murin embryonnaire. De plus, étant donné que le transfert de traceurs entre les synapses dépend de l’activité synaptique, ces souches de souris peuvent être utilisées pour analyser la communication entre des populations neuronales génétiquement définies pendant le développement du cerveau à une résolution cellulaire unique. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour le traçage transsynaptique dans les embryons de souris à l’aide des nouveaux allèles recombinants ROSA26. Nous avons utilisé cette technique expérimentale afin de délimiter les circuits neuronaux sous-jacents à la maturation de l’axe reproducteur dans le cerveau de souris femelle en développement.

Cette section montre des résultats représentatifs qui peuvent être obtenus en collaboration avec le R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) et la R26-GTT (G FP TT C) allèles. Ici, nous utilisons la R26-BIZ et les allèles R26-GTT pour analyser la maturation des circuits neuronaux qui régissent l&#39;axe de la reproduction. Reproduction chez les vertébrés est centralisé par un petit sous-ensemble de neurones dans l&#39;hypothalamus, qui sécrètent l&#39;hormone de libérati...

Capitalisant sur une stratégie génétique binaire, nous fournissons un protocole détaillé pour le traçage des circuits neuronaux chez les souris qui expriment des traceurs transsynaptiques complémentaires après recombinaison médiée par Cre. Parce que la production de traceurs spécifiques aux cellules est codée génétiquement, notre approche expérimentale convient pour étudier la formation et la maturation des circuits neuronaux au cours du développement du cerveau embryonnaire murin à une résolution cellulaire unique.

Transsynaptique génétique conditionnelle traçage dans le cerveau embryonnaire de souris

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

L'objectif de l'expérience suivante est de visualiser le développement des circuits neuronaux dans le cerveau de souris embryonnaire en utilisant trois systèmes distincts d'étiquetage cellulaire : un traceur transsynaptique qui se déplace de manière bidirectionnelle, un second traceur qui se déplace uniquement de façon rétrograde, et une troisième étiquette qui ne migre pas à partir de la cellule cible. Il est ainsi possible d'identifier la neurone cible, les neurones en amont et les neurones en aval. Les résultats montrent que ce protocole expérimental peut être utilisé pour analyser la formation des circuits neuronaux dans le cerveau de souris embryonnaire femelle à une résolution au niveau de la cellule unique.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences du développement, comme à quel moment des circuits neuronaux spécifiques se forment et comment ils s'organisent au cours du développement embryonnaire. Cette méthode peut également être utilisée pour tracer les circuits neuronaux chez des souris adultes. Plus précisément, elle peut être employée pour analyser l'activité synaptique entre des neurones génétiquement identifiés, et elle permet d'étudier comment différentes conditions expérimentales peuvent moduler un circuit neuronal au fil du temps.Commencez avec une souris gravide récemment euthanasiée. Nettoyez la face ventrale de son abdomen avec de l'éthanol à 70 %, puis pratiquez une incision verticale afin d'exposer les embryons. Retirez la chaîne d'embryons et transférez-la dans une boîte de Pétri contenant du PBS glacé.Retirer les embryons individuellement à l’aide de pinces émoussées. Séparer les embryons individuels en solution à l’aide de ciseaux fins et de pinces, en éliminant les tissus excédentaires au cours du processus, une fois que les embryons sont complètement nettoyés. Prélever un petit échantillon de queue sur chaque embryon et le placer dans un tube contenant du tampon de lyse afin de recueillir l’ADN nécessaire à l’identification du sexe et au génotypage.Ensuite, transférez l'embryon dans du PFA à 4 % fraîchement préparé et refroidi sur glace. Après le traitement de chaque embryon, laissez-les incuber dans le PFA avec agitation pendant au moins 1,5 heure, selon leur taille. Lorsque l'incubation est terminée.Laver les tissus fixés trois fois avec du PBS glacé pendant au moins cinq minutes par lavage. Ensuite, transférer les embryons dans une solution de saccharose à 30 %, maintenue à quatre degrés Celsius. Lorsque les tissus sont complètement immergés dans la solution, procéder à la cryoséctionnement.Tout d'abord, commencez par étiqueter un moule cryogénique à l’aide d’un marqueur permanent résistant à l’alcool. Ensuite, préparez une suspension de dioxyde de carbone solide broyé dans de l’éthanol à 100 % dans un seau à glace, puis utilisez cette suspension pour refroidir un bécher en verre contenant de l’isopentane pendant environ 10 minutes. Pendant ce temps, retirez les tissus de la solution de saccharose et essuyez l’excès de saccharose à l’aide d’un essuie-tout de laboratoire standard.Ensuite, transférez le tissu dans un moule cryogénique préalablement étiqueté. Ajoutez suffisamment d'OCT pour recouvrir entièrement le tissu. Veillez à ne former aucune bulle d'air dans l'OCT, en particulier autour du tissu.Ensuite, orientez le tissu à l'aide de pinces entomologiques de poids plume afin de causer un minimum de dommages. Congelez les moules cryogéniques dans le bain d'isopentane refroidi sans provoquer d'éclaboussures, si nécessaire. Les moules congelés peuvent être enveloppés et stockés à moins 80 degrés Celsius pour découper les moules.Les découper en sections séries de 14 micromètres d'épaisseur, par séries de cinq. Déposer chaque série de cinq tranches sur une lame en verre super frost plus. Lors de la préparation de la solution pour ce protocole, veiller à ajouter lentement le Tween 20 au tampon TNT, qui doit être préparé frais.Ensuite, faire circuler lentement la solution vers le haut et vers le bas pour mélanger. Lors de la préparation du tampon TNB, ajouter lentement le réactif bloquant par petites quantités tout en agitant. Puis chauffer la solution à 55 degrés Celsius à l’aide d’un bain-marie.La solution deviendra laiteuse. Maintenant, pour commencer à travailler sur les tissus, utilisez un scalpel pour retirer l'excès de OCT entourant les coupes de tissu. Ensuite, délimitez les contours de chaque coupe à l’aide d’un stylo à pap.Laisser les lames atteindre la température ambiante. Ensuite, les laver trois fois avec du tampon XPBS à température ambiante, chaque lavage devant durer cinq minutes. Puis, inhiber l'activité peroxydase endogène en incubant les lames pendant une demi-heure dans du méthanol glacé contenant 0,3 % de peroxyde d'hydrogène.Suivez par trois lavages dans du PBS à température ambiante, cinq minutes par lavage. Incubez ensuite les lames pendant 10 minutes dans du PBST pour permeabiliser les tissus. Lavez alors les lames trois fois avec du TNT.Maintenant, dans une chambre humidifiée, bloquer le tissu avec suffisamment de TNB pour recouvrir chaque lame. Laisser le blocage se poursuivre pendant une demi-heure à température ambiante. Ne pas laisser les lames sécher.Après avoir complètement éliminé le tampon de blocage, recouvrez entièrement la lame avec l'anticorps primaire dans le TNB afin de lier le traceur. Incubez deux heures à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius. Pour éliminer l'anticorps primaire, lavez la lame trois fois avec du TNT à température ambiante, cinq minutes par lavage.Pendant ces lavages, appliquez une agitation douce. Incubez ensuite les sections dans la solution d'anticorps secondaire pendant une heure. Par la suite, à température ambiante, effectuez trois lavages TNT pour éliminer l'anticorps secondaire non lié.Ensuite, dans une chambre humidifiée, incuber les tissus dans une solution de streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort diluée de 1 à 100 dans du TNB pendant 30 minutes à température ambiante, tout en lavant les lames dans du TNT. Après l'incubation, préparer une dilution fraîche de la solution TSA. Appliquer alors la dilution fraîchement préparée de TSA sur les tissus pendant exactement 10 minutes à température ambiante.Le moment précis de l'incubation avec le TSA est critique. Par conséquent, n'essayez pas de traiter trop de lames en même temps manuellement. Jusqu'à 10 lames peuvent être manipulées en une seule étape.Des lames supplémentaires peuvent rester dans le tampon de lavage TNT jusqu'à ce qu'elles soient traitées après un autre cycle de lavages. Incuber les tissus avec un Alexa floor 5 46 à une dilution de 1/500, conjugué dans du TNB, pendant 30 minutes.À température ambiante, éliminer le conjugué d'habitant décapé à l'aide de trois bains TNT supplémentaires. Ensuite, pour la coloration nucléaire, appliquer une solution de 5 % de BIS benza dans du PBS à température ambiante pendant 10 minutes, puis retirer la coloration au BIS benzo à l'aide de trois lavages TNT. Monter ensuite les lames avec du fluoro Mount G et procéder à leur analyse.À l'aide du protocole décrit, la maturation des circuits neuronaux régulant l'axe reproducteur a été analysée chez des souris porteuses des allèles R 26 BIZ et R 26 GTT. L'expression des transgènes a été activée par recombinaison dépendante de la créatinine dans les neurones embryonnaires exprimant la kisspeptine du noyau arqué, en utilisant une lignée double transgénique spécifique de la kisspeptine comme système d'expression de la créatinine. Double immunofluorescence pour la kisspeptine en vert et la BL en rouge à partir d'un kiss. IC R 26 BIZ.La souris montre une activation du BL dans la souris KISS IC R 26 GTT. La double immunofluorescence montre la KISSPEPTINE en vert et le GTT activé par le conducteur Cree en rouge. Ces analyses et d'autres diagnostics ont démontré que les transgènes étaient fonctionnels chez les embryons expérimentaux à E 18,5. Des neurones pepin situés dans le noyau arqué étaient déjà en communication avec la GNRH.Les neurones dépourvus de Z étaient limités aux neurones à kisspéptine exprimant le CRE, tandis que le BL était transféré de manière transsynaptique aux neurones en amont et en aval. Certains, mais pas tous, les neurones GNRH contenaient du bl.Ainsi, seul un sous-ensemble de neurones embryonnaires à GnRH est connecté de manière synaptique aux neurones kisspéptinergiques du noyau arqué. Les neurones à GnRH ne contenaient pas le traceur rétrograde. TTT montrant que ces neurones sont en aval des neurones kisspéptinergiques.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée en suivant cette procédure. D'autres méthodes, comme l'immunofluorescence double, peuvent être utilisées pour identifier la nature biochimique des neurones connectés. Cette technique devrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences et de la biologie du développement pour explorer la connectivité neuronale avec une résolution au niveau de la cellule unique, tant pendant le développement que chez les animaux adultes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment visualiser la formation et la maturation des circuits neuronaux chez la souris.

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