Transsynaptique génétique conditionnelle traçage dans le cerveau embryonnaire de souris

Le but de l’expérience suivante est de visualiser le développement des circuits neuronaux dans le cerveau embryonnaire de la souris à l’aide de trois systèmes de marquage cellulaire distincts en utilisant un traceur transsynaptique qui se déplace de manière bidirectionnelle, un deuxième traceur qui ne se déplace que de manière rétrograde et un troisième marqueur qui ne se déplace pas à partir de la cellule cible. Il est possible d’identifier le neurone cible, les neurones en amont et les neurones en aval. Les résultats démontrent que ce protocole expérimental peut être utilisé pour analyser la formation de circuits neuronaux dans le cerveau embryonnaire de souris femelle à une résolution de cellule unique.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences du développement, telles que quand des circuits neuronaux spécifiques sont formés et comment sont-ils organisés au cours du développement embryonnaire. Cette méthode peut également être utilisée pour tracer les circuits neuronaux chez les souris adultes. Plus précisément, il peut être utilisé pour analyser l’activité synaptique entre des neurones génétiquement identifiés, et il peut être utilisé pour analyser comment différentes conditions expérimentales peuvent moduler un circuit neuronal au fil du temps.

Commencez par une souris enceinte qui vient d’être euthanasiée. Nettoyez la face ventrale de son abdomen avec de l’éthanol à 70 %, puis faites une incision verticale pour exposer les embryons. Retirez la chaîne d’embryons et transférez-les dans un plat de PBS glacé dans le bol.

Retirez les embryons individuels à l’aide d’une pince émoussée. Séparez les embryons individuels en solution à l’aide de ciseaux fins et de pinces, en enlevant le tissu supplémentaire dans le processus lorsque les embryons sont complètement nettoyés. Faites une petite biopsie de la queue de chaque embryon et placez-la dans un tube de tampon de lyse pour recueillir de l’ADN pour l’identification du sexe et le génotypage.

Transférez ensuite l’embryon dans de la glace fraîchement préparée, 4 % PFA sur de la glace. Après le traitement de chaque embryon, laissez-les incuber dans le PFA avec agitation pendant au moins 1,5 heure, en fonction de leur taille. Lorsque l’incubation est terminée.

Lavez les mouchoirs fixes trois fois avec du PBS glacé pendant au moins cinq minutes par lavage. Transférez ensuite les embryons dans une solution à 30 % de saccharose, maintenue à quatre degrés Celsius. Lorsque les tissus sont complètement enfoncés dans la solution, procédez à la cryosection.

Tout d’abord, commencez par étiqueter un moule cryogénique à l’aide d’un marqueur permanent résistant à l’alcool. Ensuite, préparez une boue de glace carbonique pilée à 100 % éthanol dans un seau à glace à l’aide de la boue et refroidissez un bécher en verre d’isop pentane pendant environ 10 minutes. Pendant ce temps, retirez les tissus de la solution de saccharose et essuyez l’excès de saccharose avec une lingette de laboratoire standard.

Transférez ensuite le tissu dans un moule cryogénique pré-étiqueté. Avec suffisamment d’OCT pour couvrir les tissus. Ne formez pas de bulles d’air dans l’OCT, en particulier autour des tissus.

Ensuite, orientez le tissu à l’aide d’une pince d’entomologie poids plume pour causer un minimum de dommages. Congelez les moules cryogéniques dans le bain d’iso pentane refroidi sans provoquer d’éclaboussures si nécessaire. Les moules congelés peuvent être emballés et stockés à moins 80 degrés Celsius pour sectionner les moules.

Coupez-les en sections en série de 14 microns d’épaisseur en séries de cinq. Collectez chaque série de cinq tranches sur une diapositive en verre super frost plus. Lors de la préparation de la solution pour ce protocole, assurez-vous d’ajouter lentement le tween 20 au tampon TNT, qui doit être préparé frais.

Ensuite, rincez lentement la solution de haut en bas pour mélanger. Lors de la préparation du tampon TNB, ajoutez lentement le réactif de blocage par petits incréments tout en remuant. Ensuite, chauffez la solution à 55 degrés Celsius à l’aide d’un bain-marie.

La solution deviendra laiteuse. Maintenant, pour commencer à travailler sur les tissus, utilisez d’abord un scalpel pour enlever l’excès d’OCT entourant les sections de tissus. Marquez ensuite les limites de chaque section à l’aide d’un stylo Pap.

Laissez les diapositives revenir à température ambiante. Ensuite, lavez-les à température ambiante avec un tampon XPBS, trois fois chaque lavage devrait durer cinq minutes. Ensuite, éteignez l’activité de la peroxydase endogène en incubant les lames pendant une demi-heure dans du peroxyde d’hydrogène glacé et à 0,3 % dans du méthanol.

Poursuivez avec trois lavages dans du PBS à température ambiante pendant cinq minutes par lavage. Ensuite, incubez les lames pendant 10 minutes dans du PBST pour perme les tissus. Cette fois, lavez les lames trois fois avec du TNT.

Maintenant, dans une chambre humidifiée, bloquez le tissu dans suffisamment de TNB pour couvrir chaque lame. Laissez le bloc fonctionner pendant une demi-heure à température ambiante. Ne laissez pas les lames se dessécher.

Après avoir vidé complètement le tampon de blocage, couvrez la lame avec l’anticorps primaire dans TNB pour lier le traceur. Incuber pendant deux heures à RT ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Pour éliminer l’anticorps primaire, lavez la lame avec du TNT trois fois à température ambiante pendant cinq minutes par lavage.

Pendant ces lavages, utilisez une agitation douce. Ensuite, incubez les sections dans la solution d’anticorps secondaire pendant une heure. À température ambiante plus tard, utilisez trois lavages de TNT pour éliminer l’anticorps secondaire non lié.

Puis dans une chambre humidifiée, incubez les tissus dans un à 100 hadin conjugué à la peroxydase de raifort décapé dans TNB pendant 30 minutes à température ambiante tout en lavant les lames dans du TNT. Après l’incubation, faites une nouvelle dilution de la solution TSA. Appliquez maintenant la dilution TSA fraîchement préparée sur les mouchoirs pendant exactement 10 minutes à température ambiante.

Le moment précis de l’incubation TSA est essentiel. Par conséquent, n’essayez pas de traiter trop de diapositives à la fois dans notre main. Jusqu’à 10 diapositives peuvent être manipulées en une seule étape.

Les diapositives supplémentaires peuvent attendre dans le tampon de lavage TNT jusqu’à ce qu’elles soient traitées. Incuber les tissus avec un à 500 Alexa floor 5 46 décapés. Mettez-le en conjugué dans TNB pendant 30 minutes.

À température ambiante, retirez le conjugué d’habitant dépouillé avec trois autres bains de TNT. Ensuite, pour la coloration nucléaire, appliquez une solution de benza BIS à 5 % dans du PBS à température ambiante pendant 10 minutes, enlevez la tache de benzo BIS avec trois lavages TNT. Montez ensuite les lames avec le fluoro Mount G et procédez à leur analyse.

À l’aide du protocole décrit, la maturation des circuits neuronaux régulant l’axe reproducteur a été analysée chez des souris porteuses des allèles R 26 BIZ et R 26 GTT. L’expression des transgènes a été activée par recombinaison dépendante de la croyance dans les neurones embryonnaires de kisspeptine dans le noyau arqué à l’aide d’une double immunofluorescence de ligne motrice spécifique de Kisspeptine pour la kisspeptine en vert et BL en rouge à partir d’un baiser. IC R 26 BIZ.

La souris montre l’activation de BL dans le KISS IC R 26 GTT La souris double immunofluorescence montre KISSPEPTINE en vert et GTT activé par le pilote Cree en rouge. Ces diagnostics et d’autres ont démontré que les transgènes étaient fonctionnels dans les embryons expérimentaux E 18.5. Ses neurones pépins dans le noyau arqué communiquaient déjà avec la GNRH.

Les neurones dépourvus de Z étaient confinés à la CRE exprimant les neurones de kisspeptine tandis que BL était trans synaptique transféré aux neurones en amont et en aval. Certains, mais pas tous. Les neurones GNRH contenus dans bl.

Ainsi, seul un sous-ensemble de neurones GNRH embryonnaires est connecté synaptiquement aux neurones kisspeptine à noyau arqué. Les neurones GNRH ne contenaient pas le traceur rétrograde. GTT démontrant que ces neurones sont en aval des neurones de kisspeptine.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée suivant cette procédure. D’autres méthodes, comme la double immunofluorescence, peuvent être utilisées pour identifier la nature biochimique des neurones connectés. Cette technique devrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences et de la biologie du développement pour explorer la connectivité neuronale avec une résolution cellulaire unique à la fois pendant le développement et chez les animaux adultes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser la formation et la maturation des circuits neuronaux chez la souris.