Poisson zèbre kératocyte explants d'étudier la migration cellulaire collective et réépithélialisation dans la cicatrisation cutanée plaies

L’objectif général de cette procédure est d’établir des cultures d’explants de kératocytes de poisson-zèbre pour une utilisation dans des études de migration cellulaire collective et de cicatrisation des plaies épithéliales. Ceci est accompli en retirant d’abord les écailles avec le tissu épithélial attaché du poisson-zèbre adulte anesthésié. Les écailles avec le tissu attaché sont placées dans une boîte de culture pour permettre aux cellules d’adhérer.

Ensuite, le milieu de culture est ajouté avec tous les traitements indiqués par le plan expérimental. Enfin, les cellules sont incubées et observées par vidéomicroscopie pendant la période souhaitée. En fin de compte, une variété de tests peuvent être utilisés pour mettre en évidence des changements dans la migration ou la morphologie cellulaire, ainsi que l’expression de protéines ou d’autres marqueurs au fil du temps.

Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode existante, comme la méthode de culture cellulaire transformante, est que la culture d’explants est primaire, qui se réassemble étroitement aux propriétés de la cellule in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cicatrisation des plaies épithéliales, telles que le rôle de la migration collective et de la transition épithéliale à mésenchymateuse. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les écailles peuvent ne pas se fixer à la surface de croissance ou ne pas se développer dans une boîte de culture donnée.

La démonstration de cette procédure sera assurée par Jose Rap PanIN, étudiant en médecine, Chana TI et Agnes Pasquale, toutes deux associées de recherche principales dans mon laboratoire. Pour vous préparer à cette expérience, déchlorez environ 1,5 litre d’eau du robinet à l’aide d’un agent de déchloration commercial ou en laissant l’eau reposer pendant 24 heures, puis utilisez 500 millilitres pour remplir chacun des trois béchers d’un litre. Étiquetez un bécher pour tenir le poisson avant toute procédure, et un deuxième pour le récupérer dans le troisième bécher.

Ajouter 100 microgrammes par millilitre de trica. Pour anesthésier le poisson, remplissez un plateau peu profond de glace. Réchauffez le milieu de culture à température ambiante et rassemblez des pinces à épiler propres.

Nettoyez la pince à épiler en immergeant les pointes dans de l’éthanol à 70 % et en les passant dans un bec Bunsen, ce qui permet à l’éthanol de brûler. Attrapez le nombre souhaité de poissons et placez-le dans un bécher de maintien. Transférez un seul poisson dans le bécher d’anesthésie.

Après avoir anesthésié le poisson selon le protocole de texte, transférez-le sur de la glace et placez-le horizontalement avec la queue tournée vers la main tenant la pince à épiler. Pour retirer les écailles, placez la pince à épiler parallèlement au poisson. Avec la pointe sur le bord d’une écaille, enfoncez légèrement le côté plat de la pince à épiler sur le côté du poisson pour faire surélever l’écaille du corps du poisson.

Utilisez la pince à épiler pour saisir l’écaille, puis cueillez-la et, sans l’inverser, placez-la dans la boîte de culture tissulaire. Répétez la procédure, en retirant un maximum de 12 écailles d’un grand adulte, en évitant la région des branchies, la ligne latérale et les nageoires. Placez le poisson dans le bécher de récupération et surveillez-le pour vous assurer qu’il se remet des effets de l’anesthésie.

Transférez ensuite le poisson dans un réservoir individuel et laissez-le récupérer pendant 21 jours pour permettre une régénération complète de l’écailles. Selon l’expérience, placez jusqu’à 20 écailles par plastique. Boîte traitée pour culture tissulaire de 35 millimètres, soit quatre à six écailles par verre.

Dans le plat du bas, laissez les écailles adhérer au plat avant d’ajouter délicatement 1,2 millilitres de milieu complet à chaque plat de culture. Incuber les cultures X explan à 28 degrés Celsius pendant la période de temps souhaitée avec ou sans traitement pour effectuer la microscopie. Après avoir retiré de l’incubateur une boîte contenant des feuilles de cellules, placez-la dans la platine du microscope.

Utilisez un objectif quatre x pour faire la mise au point initiale afin de faciliter la prise d’image au fil du temps. Marquez l’emplacement de chaque feuille de cellule et/ou l’orientation de l’antenne sur la platine. Photographiez les feuilles cellulaires à différents moments selon le protocole expérimental, et si seulement des images fixes sont nécessaires pour l’expérience, remettez-les dans l’incubateur.

Pour fixer des échantillons pour la microscopie à immunofluorescence, préparer et préchauffer des solutions à température ambiante. Pour voir les sites OSE sous fluorescence, utilisez des boîtes de culture en verre de 35 millimètres pour faire pousser des aubergines comme décrit plus tôt dans cette vidéo, sans retirer le milieu de culture, ajoutez 0,8 millilitre de paraldéhyde à 4 % dans 1,1 XPBS à chaque boîte. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes.

Aspirez ensuite la solution. Ajoutez 0,8 millilitre supplémentaire de fixateur dans chaque plat et, après une deuxième incubation de cinq minutes, aspirez la solution. À moins d’utiliser des ligands externes ou des épitopes, perméez les cellules en ajoutant 0,5 millilitre de 0,2 % TRITTON X 100 dans une incubation XPBS pendant cinq minutes.

Avant de retirer la solution, ajoutez 0,5 millilitre de BSA à 1 % dans un XPBS et incubez à température ambiante pendant une heure ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit après l’incubation, aspirez la solution et procédez à la coloration des anticorps. Vous pouvez également ajouter un à deux millilitres de BSA à 1 % dans un XPBS et conserver à quatre degrés Celsius pendant trois à quatre semaines. Effectuer l’immunofluorescence.

Selon le protocole textuel illustré ici, on peut observer des feuillets de kératocytes migrer sous l’échelle dans les heures qui suivent l’établissement de la culture EXPLAN. De temps en temps, on peut observer un kératinocyte migrant individuellement, qui s’est détaché de la nappe en migration collective. Le taux initial d’avancement de la feuille est extrêmement rapide, mais ce taux ralentit rapidement à mesure que les cellules se propagent au cours des 48 premières heures de culture.

L’augmentation rapide n’est pas associée à la prolifération cellulaire puisqu’après un marquage de 24 heures avec l’EDU fluorescent, environ 10 % des cellules montrent des signes de division cellulaire, un taux bien inférieur à celui observé dans les lignées cellulaires transformées. Lorsque le traitement est ajouté au moment où X explans sont établis, certains composés modifient la migration cellulaire collective. Par exemple, comme indiqué ici, certains inhibiteurs de MMP diminuent la surface de la feuille cellulaire après 24 heures.

En culture, lorsque du peptide soluble contenant du RGD est ajouté au milieu de culture pour perturber la formation d’adhésion, le lamellement sur le bord d’attaque de la feuille se rétrécit rapidement et par la suite le bord d’attaque de la feuille se détache et se rétracte et moins de deux minutes pour évaluer la localisation des protéines dans la feuille ou dans les cellules d’un litre et suiveuses, La feuille entière peut être fixée et teintée comme indiqué sur cette figure. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 à 15 minutes si elle est bien exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’ajouter des milieux de culture préchauffés uniquement après avoir laissé le temps aux cytes d’adhérer à la boîte de culture Après cette procédure.

D’autres méthodes comme la QPCR peuvent être effectuées pour répondre à toute question supplémentaire, telle que les changements dans l’expression des gènes en fonction du temps et/ou des conditions de traitement. Après avoir regardé cette procédure, vous devriez avoir une bien meilleure idée de la façon d’établir des cultures EXPLAN IDE pour une utilisation dans une variété de procédures.