Name: Manipulation et In Vitro Maturation du Xenopus laevis ovocytes, Suivi par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, pour étudier le développement embryonnaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Apprenez à manipuler et maturer des ovocytes de Xenopus laevis in vitro pour étudier le développement embryonnaire. Cette méthode permet d'injecter des spermatozoïdes et d'analyser les effets sur la fécondation et la formation des têtards.

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Nous sommes reconnaissants envers les membres du laboratoire Gurdon pour la discussion utile. K.M. est chercheur au Wolfson College et est soutenu par la bourse postdoctorale Herchel Smith et la Fondation Sasakawa de Grande-Bretagne. Le laboratoire Gurdon est soutenu par des subventions du Wellcome Trust (RG69899) et du MRC à J.B.G.

<ol><li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyamoto%2C+K+%22Biology+and+Pathology+of+the+Oocyte%3A+Role+in+Fertility%2C+Medicine%2C+and+Nuclear+Reprogramming%22">Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming</a>. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).</li>
<li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo%3A+a+novel+antisense+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li>
<li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+the+Spemann+organizer+transplantation+phenomenon+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos.</a> Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).</li>
<li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Heasman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+cadherins+and+underexpression+of+beta-catenin+inhibit+dorsal+mesoderm+induction+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos.</a> Cell. 79 (5), 791-803 (1994).</li>
<li>Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+antisense+oligonucleotides+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes.</a> Methods. 51 (1), 75-81 (2010).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Wave1+is+required+for+reprogramming+transcription+in+oocytes+and+for+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development.</a> Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).</li>
<li>Halley-Stott, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+nuclear+transplantation+to+Germinal+Vesicle+stage+Xenopus+oocytes+-+a+method+for+quantitative+transcriptional+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming.</a> Methods. 51 (1), 56-65 (2010).</li>
<li>Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+characterizes+chromatin+presetting+by+NF1+and+Oct1+and+enhances+glucocorticoid+receptor+binding+to+the+MMTV+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter.</a> Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li>
<li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li>
<li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+%27autocatalytic%27+nature+of+the+maturation+promoting+factor+%28MPF%29+in+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li>
<li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).</li>
<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+RNA%2FCas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous ici en détail une nouvelle méthode pour épuiser les facteurs maternels ou surexpression des facteurs exogènes avant la fécondation. Ce système exige deux micro-injections, mais au lieu saute l&#39;opération de grenouilles, utilisé dans le procédé de transfert de 7,17 hôte. Il est optimal pour supprimer l&#39;étape de la chirurgie de la grenouille en termes de soins aux animaux. En outre, nous ne avons pas à prendre en compte pour la qualité de l&#39;hôte femmes grenouilles pour les expériences de transfert, ce qui signifie que nous pouvons nous débarrasser d&#39;un facteur biologique qui affecte le succès d&#39;expériences. Par conséquent, dans ce système, la qualité des ovocytes obtenus à partir de grenouilles PMSG amorcées est un facteur biologique majeur qui est la clé pour les expériences réussies. La qualité des ovocytes peut être jugé après la collecte des defolliculation ovaire ou après. Si aucune anomalie ne est observée lors de ces étapes, il est optimal pour recueillir un autre ovaire d&#39;une nouvelle grenouille. Un autre point quand vous pouvez vérifier la qualité de l&#39;ovocyte est après la maturation des ovocytes. Si moins de 80% de la progestéroneovocytes e-traités montrent des signes de maturation, vous ne pouvez pas être en mesure d&#39;obtenir le nombre suffisant d&#39;embryons pour d&#39;autres analyses. L&#39;utilisation de defolliculation enzymatique lieu de defolliculation manuel est également un autre avantage de l&#39;utilisation de ce système afin de réduire le travail nécessaire pour defolliculation. Cependant, il est encore possible que defolliculation manuel peut donner un meilleur développement que le traitement enzymatique. Comme le montre la figure 3, près de 10% des ovocytes in vitro mûri peut atteindre le stade de têtard piscine. Ces données sont recueillies auprès de 13 expériences indépendantes, y compris ceux présentés dans huit et de nouvelles expériences d&#39;injection. méthode de transfert de l&#39;hôte a besoin de 75 à 150 ovocytes dans chaque traitement pour obtenir des données significatives depuis 30-60% des ovocytes transférés peut atteindre le stade neurula 17. Notre méthode commence normalement par 200 à 300 ovocytes dans chaque groupe expérimental depuis environ 40-60% des embryons clivés peut atteindre lestade de la réponse musculaire. Ces données suggèrent que les deux méthodes prennent en charge un taux de développement raisonnable. Nous avons jusqu&#39;ici obtenu 10 grenouilles vivant de contrôle ARNm injecté et le contrôle antisens ovocytes oligo-injecté à l&#39;aide de cette technique, indiquant que cette approche favorise le développement par la métamorphose. Notre méthode de manipulation des ovocytes-ICSI fournit l&#39;occasion de tester le rôle des facteurs maternels pendant le développement embryonnaire très tôt, dès après la fécondation. En outre, la surexpression de facteurs modificateurs de la chromatine avant la fécondation peut permettre de remodeler la chromatine maternelle avant la fécondation pour comprendre États chromatine maternelle nécessaire pour le développement. Cette stratégie peut aussi bien travailler avec les systèmes d&#39;édition de gènes actuels tels que la transcription activateur comme effecteur nucléase (TALEN) 18,19 CRISPR et / CAS9 20,21 puisque ceux-ci peuvent être exprimées avant même la fécondation. Par conséquent, notre nouvelle approche a un potential à être utilisé pour de nombreuses applications à l&#39;avenir.

Xenopus laevis est largement utilisé, puissant organisme modèle pour étudier le développement 1. Ce est parce que les œufs de Xenopus sont inhabituellement élevé (environ 1/2 à 1/4 mm, par rapport à leurs homologues de mammifère étant d&#39;environ 0,1 mm) et abondante. Les œufs contiennent des composants mère synthétisés et stockés, qui sont suffisants pour conduire le développement embryonnaire jusqu&#39;à la mi-blastula transition (MBT, commise au stade 8-8,5 avec 4,000-8,000 cellules). MBT est accompagné par l&#39;activation du génome zygotique, qui produit alors des produits de gènes embryonnaires qui dirigent le développement. De nombreuses études visant à identifier les facteurs maternels importants pour le développement. De nombreuses études se appuient sur ​​l&#39;injection d&#39;oligonucléotides antisens (oligos), y compris des oligonucléotides morpholino dans embryons fécondés, dans lesquels la dégradation des protéines maternels de cas peut être observé au stade de la gastrula 2-4. Alternativement, les ARNm sont injectés pour em fécondébryons de perturber les fonctions des gènes ou de retracer destins de protéines surexprimés. Cependant, l&#39;injection dans les embryons au stade une cellule-normalement ne affecte pas les niveaux de protéines d&#39;expression maternelle à des stades embryonnaires précoces très avant MBT. Heasman et Wylie établi la méthode de transfert de l&#39;hôte de surmonter ce problème 5. Dans leur méthode, défolliculés manuellement ovocytes sont injectés avec des oligos antisens et transférés dans des femelles hôtes 6. Les protéines sont régulés à la baisse avant la fécondation afin que les rôles de protéines réprimés dans le développement embryonnaire précoce peuvent être examinées. Cette méthode de déplétion maternelle a conduit à l&#39;identification de plusieurs rôles de développement uniques de protéines maternelle, tel que révisé à 7. Dans ce rapport, nous détaillons notre méthode développée récemment, dans lequel l&#39;épuisement maternel ou la surexpression de l&#39;ARNm avant la fécondation est réalisée sans defolliculation manuel et le transfert de l&#39;hôte8. Defolliculation manuel nécessite beaucoup de temps et le transfert de l&#39;hôte doit souvent techniques habiles et la licence spécifique pour la chirurgie des animaux, entravant ainsi l&#39;usage fréquent de la méthode de l&#39;épuisement maternel. Defolliculation et le transfert de l&#39;hôte sont substitués par defolliculation enzymatique 9,10 et injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) 11-13, respectivement. ICSI aux œufs a été utilisé pour produire des grenouilles transgéniques 12. Sperme et embryons noyaux ont également été transplantés dans des ovocytes in vitro amphibiens mûri 11,14,15. Ici, nous montrons notre méthode étape par étape pour injecter des spermatozoïdes in vitro ovocytes maturés qui ont été pré-injecté avec oligos antisens ou ARNm.

<table><tbody><tr><td>Gonadotrophine sérique de jument gestante (PMSG)&nbsp ;</td><td>MSD Animal Health</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu poudre et solvant pour solution injectable</td></tr><tr><td>Sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>Liberase TM Research</td><td>Grade Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>Pour la défolliculation des ovocytes. Magasin à -20&nbsp ; &#176 ;C.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td><td>Pour microinjection</td></tr><tr><td>capillaire en verre&nbsp ;</td><td>Laboratoires Alpha</td><td>7" Drummond #3-000-203-G/XL</td><td>Pour micro-injection</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes&nbsp ;</td><td>Instrument SUTTER</td><td>Modèle D-97</td><td>Pour la micro-injection</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Pour la maturation in vitro et le</td></tr><tr><td>tube à centrifuger ultra-transparent ICSI 14 ml&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter Royaume-Uni Ltd</td><td>344060</td><td>Pour la purification des spermatozoïdes</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>Pour la purification des spermatozoïdes</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Réactif de perméabilisation cellulaire</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Hybaid&nbsp ;</td><td>HB-SHK-1</td><td>Pour la défolliculation des ovocytes</td></tr><tr><td>Microscope de dissection (microscope stéréo zoom)</td><td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>Pour le prélèvement et la microinjection d’ovocytes</td></tr><tr><td>50 &mu ; Filtre à pores</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>Pour la purification des spermatozoïdes</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100XP</td><td>Pour la purification des spermatozoïdes</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 50 ml Cellstar</td><td>Greiner Bio-One 227261</td><td>ou 210261</td><td>Collecte d’ovocytes et réaction de défolliculation</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 15 ml</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>Pour la purification des spermatozoïdes</td></tr><tr><td>90 mm Petri plat&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire facile à saisir, 60&nbsp ; x&nbsp ; Boîte</td> de culture cellulaire <td>FALCON</td><td>353004</td><td></td>de 15 mm</tr><tr><td>, 35 cm ; x&nbsp ; FALCON 351008</td><td></td><td></td><td></td> 15 mm</tr></tbody></table>

manipulation et<em&gt; in vitro</em&gt; maturation du<em&gt; xenopus laevis</em&gt; ovocytes, suivi par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, pour étudier le développement embryonnaire

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Les œufs d’amphibiens ont été largement utilisés pour étudier le développement embryonnaire. Le développement embryonnaire précoce est déterminé par les facteurs stockés par la mère et accumulés pendant l’ovogenèse. Afin d’étudier les rôles de ces facteurs maternels dans le développement embryonnaire précoce, il est souhaitable de manipuler leurs fonctions dès le tout début du développement embryonnaire. Les méthodes conventionnelles d’interférence génique sont obtenues par l’injection d’oligonucléotides antisens (oligos) ou d’ARNm dans des œufs fécondés, permettant respectivement la sous-expression ou la surexpression de protéines spécifiques. Cependant, ces méthodes nécessitent normalement plus de plusieurs heures avant que l’expression des protéines ne soit affectée et, par conséquent, l’interférence des fonctions des gènes n’est pas efficace pendant les premiers stades embryonnaires. Ici, nous introduisons un système expérimental dans lequel les niveaux d’expression des protéines maternelles peuvent être modifiés avant la fécondation. Les ovocytes de Xenopus laevis obtenus à partir d’ovaires sont défolliculés par incubation avec des enzymes. Les oligo-sens ou ARNm sont injectés dans les ovocytes défolliculés au stade de la vésicule germinale (GV). Ces ovocytes sont transformés in vitro en ovules au stade de métaphase II (MII), suivi d’une injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI). De cette façon, jusqu’à 10 % des embryons ICSI peuvent atteindre le stade de têtard nageur, permettant ainsi des tests fonctionnels de knockdown ou de surexpression de gènes spécifiques. Cette approche peut être un moyen utile d’étudier les rôles des facteurs stockés par la mère dans le développement embryonnaire précoce.

Le développement embryonnaire des embryons ICSI utilisant dans des ovocytes in vitro mûri a été examiné (figure 3A). taux d&#39;ovocytes GV à la phase de maturation MII sont variables et dépendent en grande partie sur la qualité de l&#39;ovocyte. Dans de bonnes expériences, presque 100% des ovocytes GV répondre à la progestérone et montrent des signes de maturation ovocytaire, devenant finalement des œufs au stade MII. Tous les ovocytes ont été soumis à mûri ICSI et environ 25% des œufs injectés clivé (figure 3A, n = 13 pour le contrôle brouillés ovocytes oligo-injectée et n = 7 pour aucun des ovocytes oligo-injectée). Environ 60% ou 80% des embryons clivés, produites à partir d&#39;ovocytes oligo-injecté contrôle ou ovocyte non-injecté, respectivement, ont atteint le stade blastula / gastrula. Parmi les embryons blastula / gastrula, environ la moitié des embryons dans des échantillons d&#39;oligo-injecté étaient de bonne qualité (presque aucun signe de division anormale et l&#39;apoptose), tandis que 82% des embryons blastula / gastrula étaient de bonne qualité nsur-injection des échantillons (figure 3A). Enfin, 41% et 11% des embryons clivés dans des échantillons d&#39;oligo-injecté a atteint la réponse musculaire natation et les étapes de têtards, respectivement, tandis que 60% ​​et 29% des embryons clivés dans des échantillons non injectée ont fait (figure 3A). Ces embryons ICSI sont le mélange d&#39;embryons normaux et anormaux (figure 3B). Certains d&#39;entre eux subissent une métamorphose et développer à mûrir grenouilles 8. Ces résultats suggèrent que l&#39;injection d&#39;oligonucléotides antisens dans des ovocytes de GV, suivis par l&#39;IVM et ICSI, permet le développement embryonnaire précoce efficace. Bien que l&#39;injection de antisens se oligos diminue développement embryonnaire, nous sommes toujours en mesure d&#39;obtenir suffisamment d&#39;embryons pour de nombreuses fins expérimentales telles que la vérification des taux de développement, RT-PCR, western blot et ainsi de suite. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> Figue<html> ure 1: Des exemples typiques de Xenopus laevis ovocytes de bonne qualité ou de mauvaise qualité pour des expériences de maturation in vitro. (A) Un exemple de mauvaises ovocytes de qualité. Par exemple, les ovocytes montrant la pigmentation inégale ne sont pas utilisés pour des expériences ultérieures. Chaque ovocyte de Xenopus laevis est d&#39;environ 1.2 à 1.4 mm de diamètre. (B) Une partie de l&#39;ovocyte défolliculés. La moitié droite de l&#39;ovocyte est recouverte par les cellules de follicules, ce qui peut être perçue que par la présence de vaisseaux sanguins. Une flèche indique une zone exempte de cellules folliculaires et dans lequel l&#39;aiguille d&#39;injection est injecté. (C) Un exemple de bonnes ovocytes de qualité, qui sont de même taille et montrent hémisphères animales uniformément pigmentés avec un contraste évident entre l&#39;hémisphère animal et de l&#39;hémisphère végétatif. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figure 2:. Xenopus laevis ovocytes avant et après la maturation Après la maturation des ovocytes, des taches blanches claires apparaissent en haut des hémisphères animales et les cellules folliculaires sont décollée. Chaque ovocyte de Xenopus laevis est d&#39;environ 1 mm de diamètre. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> Figure 3: Développement d&#39;embryons ICSI, produites à partir dans des ovocytes in vitro mûri. (A) le développement d&#39;embryons ICSI à chaque étape est résumée. Les ovocytes ont été injectés avec contrôle brouillé oligonucléotides antisens (injection d&#39;oligo de contrôle) ou sans injection (non injection), suivis par l&#39;IVM et ICSI. Le nombre correspondant d&#39;embryons à chaque étape est indiqué ci-dessus les barres. Moyenne ± SEM est indiquée. N = 4-13 expériences indépendantes / f différenteemales. (b) des exemples de survie des embryons ICSI. Ces embryons au stade de bourgeon caudal ont été produits dans une expérience, dans laquelle environ 200 ovocytes ont été utilisés en tant que matériau de départ.

Nous décrivons les méthodes de manipulation des ovocytes immatures de Xenopus laevis, de maturation in vitro des ovocytes en ovules et d’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes. Ce protocole permet la dégradation de certaines protéines maternelles et la surexpression des gènes d’intérêt lors de la fécondation, et est donc précieux pour étudier les rôles de facteurs spécifiques dans le développement embryonnaire précoce.

Manipulation et<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturation du<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovocytes, Suivi par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, pour étudier le développement embryonnaire

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

L'objectif de l'expérience suivante est d'éliminer les protéines maternelles stockées dans les ovocytes ou de surexprimer des protéines d'intérêt au moment de la fécondation des œufs de grenouille. Cela est réalisé par injection d'oligonucléotides antisens ou d'ARNm dans des ovocytes immatures dérégulés enzymatiquement afin de dégrader ou de surexprimer une protéine spécifique. Dans un deuxième temps, les ovocytes sont transférés dans un milieu contenant de la progestérone, ce qui induit leur maturation en œufs.Ensuite, les spermatozoïdes sont injectés dans les ovules mûris in vitro afin d'observer l'effet de l'extinction ou de la surexpression sur le développement embryonnaire. Finalement, le développement des ovocytes injectés avec l'oligo jusqu'aux têtards nageurs constitue le test fonctionnel de l'extinction ou de la surexpression du gène. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le transfert chez un hôte, est que nous pouvons omettre l'étape chirurgicale sur les grenouilles en utilisant des protocoles standards.Prélevez un opus sur SAC contenant des cytes saines dans une boîte de Pétri de neuf centimètres de diamètre contenant du MBS plus du ps. Ensuite, séparez délicatement l'ovaire en morceaux carrés d'un à deux centimètres de large. Réunissez environ cinq millilitres de l'ovaire déchiré avec les cytes dans un nouveau tube de 50 millilitres.Ensuite, rincez les tissus plusieurs fois avec du MBS plus PS, et recueillez les œufs dans 15 millilitres de MBS frais plus ps. Ajoutez ensuite sept unités d'enzyme de défollination à la suspension et incubez-la avec un agitation douce jusqu'à ce qu'elle soit partiellement défollinée, au moins. Cela prendra au moins une heure après l'incubation.Remplir le tube avec du MBS plus du Ps pour arrêter la réaction. Appliquer la solution sur la paroi du tube et non directement sur les cytes. Laisser les tissus se déposer, puis jeter la soupe et l'agent.Les cytes petites et immatures flotteront et doivent également être éliminées. Répéter cette étape de lavage un total de 10 fois après les lavages. Transférer les cytes dans une boîte de neuf centimètres contenant du MBS plus du ps.Transférez la boîte vers un microscope stéréo et, à partir de ce moment, maintenez les cytes à une température de 16 à 18 degrés Celsius autant que possible. Sélectionnez les cytes de bonne qualité au stade six selon la classification de Dumont à l’aide d’une pipette en verre, puis rassemblez-les dans une nouvelle boîte contenant du MBS additionné de ps. Un cyte de bonne qualité doit présenter une pigmentation uniforme dans l’hémisphère animal et une séparation nette entre les hémisphères animal et végétatif.Ils devraient également être tous d'une taille à peu près identique, comprise entre 1,2 et 1,4 millimètre de diamètre. Réunissez environ deux à 300 cytes pour chaque injection, soit environ 1000 cytes par expérience. La qualité du site O est essentielle pour la réussite.Si l'ovaire présente une anomalie durant la préparation, je vous recommande de prélever un ovaire issu d'un autre lot et de recommencer. En prévision de l'injection de l'oligonucléotide antisens, placez le piston métallique d'une micropipetteuse en position basse, puis fixez une capillaire en verre remplie d'huile sur le piston métallique. Sous un microscope stéréo, coupez l'extrémité de la capillaire à l'aide de petites ciseaux chirurgicaux.Réalisez une pointe aussi petite que possible. Laser suivant. Déposez une bande de paraforme sur la platine du microscope, puis ajoutez trois microlitres de solution d'acide nucléique à une concentration d'un microgramme par microlitre.Avec cela, remplissez la pointe de l'aiguille. Si de l'air est piégé, l'ouverture doit être agrandie. Faites maintenant une marque visible sur l'aiguille d'injection à environ un demi-millimètre de la pointe.Ensuite, procédez à l'injection des cytes en injectant d'abord un cyte, en repérant une zone dépourvue de cellules folliculaires où l'aiguille peut pénétrer. Insérez la pointe le long de la limite équatoriale en visant le point central situé sous la vésicule germinative. Simultanément, stabilisez le cyte avec une pince du côté opposé.Utilisez maintenant la commande au pied pour éjecter la solution, en délivrant entre 4,6 et 9,2 nanogrammes d'oligonucléotides antisens ou entre 250 picogrammes et 13,8 nanogrammes d'ARN messager. Après avoir injecté toutes les cellules, transférez-les dans un milieu d'incubation et laissez-les incuber plusieurs jours afin que des modifications puissent survenir. Dans le protéasome.Par la suite, transférez les cytes avec un volume minimal de milieu vers des boîtes de Pétri de six centimètres de diamètre recouvertes d’agar et contenant cinq à huit millilitres de milieu de maturation. Incubez alors les cytes dans ce milieu pendant 16 heures avant de les injecter avec du sperme. Pour ce protocole, il est nécessaire de préparer au préalable une solution de spermatozoïdes congelée.Consulter le protocole textuel après 16 heures d'incubation pour la maturation. Transférer très précautionneusement les cytes dans une boîte de Pétri de six centimètres recouverte d'œufs et contenant du MBS plus du PS afin de les rincer. Si les cytes sont manipulés de manière inappropriée, ils pourraient s'activer spontanément avant l'ixy.Comptez maintenant les ovocytes matures et recherchez les taches blanches, qui indiquent que la vésicule germinative de l'ovocyte s'est rompue. Si moins de 80 % sont bons, ils ne sont pas collectivement assez sains pour survivre à la procédure d'ixy. Pour continuer.Remplissez un nouveau plat avec le milieu d'injection et transférez délicatement tous les cytes dans le plat après une demi-heure. Procédez ensuite à l'injection des cytes matures avec la solution de spermatozoïdes en utilisant la même préparation d'injecteur que celle décrite pour les oligos. Idéalement, il devrait y avoir un ou deux spermatozoïdes par 4,6 nanolitres dans la solution d'injection.Pour tester cette solution d'injection, préparez des gouttes de solution de DPI à 0,3 microgramme de DPI par millilitre et injectez 4,6 nanolitres dans ces gouttes. Ensuite, comptez le nombre de spermatozoïdes dans chaque goutte par microscopie de fluorescence. Après avoir confirmé la concentration en spermatozoïdes, injectez les cytes avec 4,6 nanolitres de la solution de spermatozoïdes.Veillez à ce que le temps nécessaire pour injecter les solutions reste constant et injectez les ovocytes de manière régulière, avec un minimum d'arrêts entre les injections. Après chaque série de 100 injections, remplacez la solution de spermatozoïdes. Une fois que tous les ovocytes matures ont été injectés, placez la boîte au incubateur pendant quatre à cinq heures, puis examinez-la.Pour les embryons ayant subi une segmentation, les sillons de division peuvent ne pas être aussi nets que ceux des embryons normalement fécondés. Transférez tous les embryons segmentés dans un milieu d'incubation et laissez-les incuber toute la nuit. Le lendemain, les embryons survivants doivent être transférés dans un milieu de développement embryonnaire 0,1 XMMR pour les embryons ixy. L'utilisation d'ovocytes matures in vitro a été examinée dans de bons expériences : près de 100 % des ovocytes présentant une vésicule germinative ont répondu à la progestérone et ont montré des signes de maturation.Environ 25 % ont subi une segmentation. De 60 à 80 % des embryons segmentés sont parvenus au stade de blastula, et environ un tiers de ceux-ci ont atteint le stade de têtard nageur. Les embryons ixy constituaient un mélange d'embryons normaux et anormaux, ce qui montre que l'injection d'ARN antisens sogo dans les ovocytes germinaux, suivie de la maturation in vitro (IVM) et de la fécondation in vitro (Dixie), permettait un développement embryonnaire précoce.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de manipuler les protéines maternelles avant la factorisation.

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