Manipulation et In Vitro Maturation du Xenopus laevis ovocytes, Suivi par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, pour étudier le développement embryonnaire

Le but de l’expérience suivante est d’éliminer les protéines maternelles stockées dans les ovocytes ou de surexprimer les protéines d’intérêt au moment de la fécondation des œufs de grenouille. Ceci est réalisé en injectant des oligos antisens ou ARNm dans des ovocytes immatures dérégulés enzymatiquement pour dégrader ou surexprimer une protéine spécifique. Dans un deuxième temps, les ovocytes sont transférés dans un milieu contenant de la progestérone, ce qui induit la maturation des ovocytes en ovules.

Ensuite, des spermatozoïdes sont injectés dans les ovules matures in vitro afin d’observer l’effet de l’inactivation ou de la surexpression sur le développement embryonnaire. En fin de compte, le développement d’ovocytes injectés d’oligo-injectés aux têtards nageurs est le test fonctionnel de l’inactivation ou de la surexpression des gènes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux vaisseaux existants tels que l’hôte à transférer, est que nous pouvons sauter le processus de chirurgie de la grenouille en utilisant des protocoles standard.

Collectez un opus sur SAC contenant des cytes sains dans une boîte pétroplate de neuf centimètres contenant MBS plus ps. Ensuite, séparez l’ovaire en morceaux carrés d’un à deux centimètres de large. Prélevez environ cinq millilitres de l’ovaire déchiré avec des cytes dans un nouveau tube de 50 millilitres.

Ensuite, rincez les mouchoirs avec MBS plus PS plusieurs fois et récupérez les œufs dans 15 millilitres de MBS plus ps frais. Maintenant, ajoutez sept unités d’enzyme de défoliation à la suspension et incubez la suspension avec une végétation douce jusqu’à ce qu’elle soit au moins partiellement défoliée. Cela prendra au moins une heure après l’incubation.

Remplissez le tube avec MBS plus Ps pour arrêter la réaction. Tirez la solution sur la paroi du tube et non directement sur les cytes. Laissez les mouchoirs se déposer et jetez la soupe et l’agent.

Les petits cytes immatures flotteront et ils doivent également être jetés. Répétez cette étape de lavage 10 fois au total après les lavages. Transférez les cytes dans une boîte de neuf centimètres avec MBS plus ps.

Transférez la boîte dans un microscope à dissection et à partir de là, maintenez les cytes à 16 à 18 degrés Celsius autant que possible. Sélectionnez des cytes de stade six de bonne qualité à l’aide de la classification de Dumont à l’aide d’une pipette en verre, collectez-les dans une nouvelle boîte avec MBS plus ps. Les cytes de bonne qualité doivent avoir une pigmentation uniforme dans l’hémisphère animal et montrer une séparation claire entre l’hémisphère animal et l’hémisphère végétal.

Ils doivent également tous être à peu près de la même taille, soit entre 1,2 et 1,4 millimètre de diamètre. Collectez environ deux à 300 cytes pour chaque injection, soit environ 1000 cytes par expérience. La qualité du site O est une clé de succès.

Si l’Oside présente une anomalie lors de la préparation, je vous recommande de corriger un ovaire d’un autre troupeau et de recommencer. En préparation de l’injection de l’oligo antisens, réglez le piston métallique d’un micro-injecteur sur sa position la plus basse et insérez un capillaire en verre rempli d’huile sur le piston métallique. Sous un microscope de dissection, coupez la pointe de l’aiguille à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux.

Faites un pourboire aussi petit que possible. Prochain laser. Une bande de paraforme sur la platine du microscope et sur celle-ci Distribuez trois microlitres de solution d’acide nucléique à un microgramme par microlitre.

Avec cela, remplissez la pointe de l’aiguille. Si l’air est emprisonné, l’ouverture doit être agrandie. Faites maintenant une marque visible sur l’aiguille d’injection à environ un demi-millimètre de la pointe.

Ensuite, procédez à l’injection des cytes pour en injecter un en premier, trouvez une zone exempte de cellules folliculaires où l’aiguille peut pénétrer dans cette zone. Insérez la pointe le long de la limite équatoriale en visant le point central sous la vésicule germinale. Dans le même temps, stabilisez le cyte avec des pinces du côté opposé.

Maintenant, à l’aide de la commande au pied, éjectez la solution, éjectez entre 4,6 et 9,2 nanogrammes d’oligos antisens ou entre 250 picogrammes et 13,8 nanogrammes d’ARN messager. Après avoir injecté tous les cytes, transférez-les dans un milieu d’incubation et laissez-les incuber quelques jours afin que les changements puissent avoir lieu. Dans le protéasome.

Plus tard, transférez les cytes avec une quantité minimale de milieu dans des plats enrobés d’agros de six centimètres contenant cinq à huit millilitres de milieu de maturation. Laissez ensuite les cytes se développer dans ce milieu pendant 16 heures avant de leur injecter des spermatozoïdes. Pour ce protocole, des stocks de sperme congelés doivent être préparés.

Consulter le protocole textuel après 16 heures d’incubation pour la maturation. Transférez très soigneusement les cytes dans un plat de six centimètres enrobé d’œuf grossier avec MBS plus PS pour les laver. Si les cytes sont mal manipulés, ils peuvent s’activer spontanément avant l’ixy.

Maintenant, comptez les cytes matures et recherchez des taches blanches qui indiquent que la vésicule germinale du cyte s’est décomposée. Si moins de 80 % sont bons, ils ne sont collectivement pas en assez bonne santé pour survivre à la procédure ixy. Poursuivre.

Remplissez une nouvelle boîte avec un milieu d’injection et transférez délicatement tous les cytes dans la boîte après une demi-heure. Procéder à l’injection des cytes matures avec la solution de sperme en utilisant la même préparation d’injecteur que celle décrite pour les oligos. Idéalement, il devrait y avoir un ou deux spermatozoïdes par 4,6 nanolitres dans la solution d’injection.

Pour tester cette solution d’injection, faites des gouttes de solution DPI à 0,3 microgramme DPI par millilitre et injectez 4,6 nanolitres dans ces gouttes. Comptez ensuite le nombre de spermatozoïdes dans chaque goutte par microscopie à fluorescence. Après avoir confirmé la concentration de spermatozoïdes, injectez dans les cytes 4,6 nanolitres de solution de spermatozoïdes.

Assurez-vous que le temps nécessaire à l’injection des solutions reste constant et injectez les ovocytes régulièrement avec un minimum de pause entre les injections. Après chaque échange de 100 injections, la solution de sperme. Une fois que tous les ovocytes matures ont été injectés, la boîte doit être incubée pendant quatre à cinq heures, puis inspectée.

Pour les embryons qui ont subi un clivage, les sillons de clivage peuvent ne pas être aussi clairs que ceux des embryons fécondés normaux transfèrent tous les embryons clivés dans un milieu d’incubation et les laissent incuber pendant la nuit. Le lendemain, les embryons survivants doivent être transférés à 0,1 XMMR développement embryonnaire d’embryons ixy. L’utilisation d’ovocytes matures in vitro a été examinée dans de bonnes expériences, près de 100 % des ovocytes des vésicules germinales ont répondu à la progestérone et ont montré des signes de maturation.

Environ 25 % ont subi un clivage. 60 à 80 % des embryons clivés ont atteint le stade de souffle et environ un tiers d’entre eux ont atteint le stade de têtard nageur. Les embryons ixy étaient un mélange d’embryons normaux et anormaux, montrant que l’injection du sogo antisens dans les cytes vécaux germinaux, suivie d’une IVM et d’un Dixie, permettait un développement embryonnaire précoce.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler les protéines maternelles avant la factorisation.