Détermination Membrane Protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (FPP)

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la topologie des protéines membranaires intégrales. Ceci est réalisé par l’expression de l’épanchement, protéine entre la protéine fluorescente verte ou GFP et les queues aminés ou carboxyles de la membrane. Protéine d’intérêt dans les cellules à des fins de contrôle, des protéines fluorescentes solubles telles que RFP peuvent être exprimées.

Ensuite, la membrane plasmique est soumise à une perméation sélective. À l’aide de l’excavation détergente, les protéines fluorescentes solubles sortiront de la cellule, tandis que les protéines fluorescentes liées à la membrane seront conservées dans la cellule. La dernière étape est l’application d’une protéase sur les cellules perméables et la détermination de la rétention ou de la perte du signal fluorescent.

En fin de compte, les changements d’intensité de fluorescence observés à l’aide de l’imagerie par microscopie à fluorescence sont utilisés pour montrer la topologie et l’orientation des protéines membranaires intégrales. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la cartographie des épitopes, est que la procédure ne nécessite pas beaucoup d’équipement spécialisé ou divers réactifs qui peuvent être difficiles à trouver. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie des protéines membranaires, telles que quels domaines d’une protéine membranaire intégrale peuvent être situés dans le cytosol par rapport à quels domaines peuvent être situés dans la lumière d’organites tels que le réticulum endoplasmique gold G ou les endosomes.

Commencez cette procédure par la génération et la validation de la protéine fluorescente KY comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, transfectez la protéine fluorescente KY dans des cellules rénales embryonnaires humaines ou des cellules HEK 2 93 à l’aide de toute méthode de transfection standard à haute efficacité et à faible toxicité, y compris les technologies basées sur les lipides, les viraux ou l’électroporation pour générer une expression transitoire ou stable, les cellules sont ensuite plaquées sur des lamelles recouvertes de polylysine. Conservez les cellules pendant cinq à 48 heures dans un milieu de culture tissulaire approprié à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire capable de dioxyde de carbone.

Surveillez l’expression de la protéine de fusion GFP dans les cellules à l’aide de la microscopie à fluorescence épi, et le signal fluorescent intrinsèque du signal fluorescent GFP atteint généralement un maximum dans les 24 à 72 heures. Après la transfection. Utiliser les cellules lorsque le signal fluorescent atteint un niveau maximal L’expression des protéines peut également être surveillée par analyse immuno-blot à l’aide d’anticorps dirigés contre la protéine d’intérêt ou la fraction GFP.

Pour commencer, mettez en place le système de perfusion alimenté par gravité pour traiter les cellules. Préparez des seringues de 50 millilitres pour les solutions avec un tube en polyéthylène relié à des réservoirs indépendants et à un collecteur avec une seule sortie au bain. Positionnez une pipette d’aspiration de manière à maintenir un volume de bain constant et à réaliser l’échange de solution en basculant manuellement entre les réservoirs de perfusion pour la perméation de la membrane plasmique.

Tout d’abord, retirez le milieu de culture cellulaire des cellules. Lavez les cellules trois fois pendant une minute chacune. Dans le tampon KHM, placez les lamelles sur une platine de microscope à fluorescence et collectez la première image, qui représente l’image de contrôle non perméable pour perméer sélectivement la membrane plasmique.

Ajoutez le chiffre toin dans le tampon KHM aux cellules, perfuser les cellules avec le tampon plus le chiffre toin à une vitesse de cinq millilitres par minute pendant 10 à 60 secondes. La confirmation que la membrane plasmique est suffisamment perméable est facilement réalisée par l’expression d’une molécule GFP ou RFP soluble, qui se diffusera facilement hors de la membrane cellulaire suivante. La perméation confirme ensuite que le chimère de protéine GFP d’intérêt est intégré à la membrane en confirmant la rétention cellulaire du signal fluorescent après digon et perméation de la membrane plasmique.

Ensuite, exprimez une protéine fluorescente spécifique à un organe, telle qu’une protéine mitochondriale, comme indiqué dans le protocole de texte. Déterminez les conditions d’expression optimales comme précédemment. Confirmer que l’excavation et la concentration sont appropriées pour le type de cellule utilisé en s’assurant que la morphologie des canaux intracellulaires des organes reste constante pendant une exposition prolongée.

Pour creuser toin. Après avoir lavé les cellules dans le tampon KHM, ajoutez de la protéase directement sur les cellules. Parcourez les cellules à un débit de cinq millilitres par minute, en utilisant un système de perfusion alimenté par gravité pour baigner continuellement la préparation.

Ensuite, déterminez si le signal fluorescent persiste ou se dégrade. Collectez des images de microscopie fluorescente sous les jeux de filtres appropriés à l’aide de la fonction de capture d’images vidéo sur un microscope fluorescent contrôlé par ordinateur. Quantifier l’intensité du signal fluorescent en fonction de la condition d’incubation.

Obtenez l’intensité moyenne des pixels dans une région d’intérêt qui entoure une cellule individuelle. Une perte de plus de 90 % de l’intensité initiale du signal sur une période de 30 à 60 secondes est compatible avec une dégradation protéolytique de la protéine GFP ky. Une disparition complète du signal fluorescent soluble devrait se produire dans les 10 à 60 secondes suivant l’application du doigt

La confirmation que la protéine d’intérêt est associée à des organites intracellulaires est obtenue en notant la rétention du signal fluorescent après digon et perméation. La queue carboxyle de la kinase à ancrage membranaire LTK two a été fusionnée à la GFP et a exprimé transitoirement fluorescente ltk. Le signal GFP a été perdu rapidement après l’ajout de la protéinase K, indiquant que l’emplacement de l’extrémité carboxyle de ltk deux se trouve dans le cytosol.

Cavi et GFP est une protéine de membrane plasmique avec une fraction GFP attachée au domaine cytosolique. Comme pour LTK deux, le signal de cavi et de GFP est insensible au chiffre, mais sensible à l’ajout ultérieur de protéase DS red mito code la protéine fluorescente rouge fusionnée à la séquence de ciblage mitochondriale de la cytochrome C oxydase après perméation digon, ainsi qu’à l’ajout de protéinase K. La fluorescence associée à DS red mito reste stable. Cela est cohérent avec le fait que le Fluor quatre se trouve dans les mitochondries où il n’est pas exposé au cytosol.

Lorsque la fraction fluorescente attachée à une protéine membranaire fait face à l’extérieur de la cellule, comme dans la protéine prion ancrée GPI attachée à une protéine fluorescente jaune. Le traitement à la protéinase doit éteindre rapidement le signal fluorescent sans qu’il soit nécessaire de procéder à une perméation préalable comme prévu. Après le traitement à la protéinase, le signal fluorescent extracellulaire a disparu rapidement pour les cellules exprimant cette construction.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à deux heures si elle est bien faite. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la façon de déterminer la topologie de votre protéine membranaire d’intérêt.