Name: Détermination Membrane Protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (FPP) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Découvrez la détermination de la topologie des protéines membranaires intégrales par la méthode FPP utilisant des chimères GFP et une protéase sélective. Cette approche permet d'analyser l'orientation des protéines dans des cellules vivantes.

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Nous tenons à remercier la plateforme d’imagerie calcique de CMS pour son aide et ses conseils en matière de capture et d’analyse d’images. Cette étude a été financée par les National Institutes of Health (NIH) des États-Unis HL102208 à N.A.B. Cette approche a été mise au point à l’origine par Holger Lorenz et Jennifer Lippincott-Schwartz aux NIH.

1. Génération et validation des chimères de protéine fluorescente <ol><li> Ajouter protéine fluorescente verte (GFP) à l&#39;extrémité amino ou carboxy-terminales de la protéine d&#39;intérêt en utilisant des stratégies d&#39;ADN recombinant 13. REMARQUE: Bien que nous ayons utilisé GFP largement, d&#39;autres variantes telles que la protéine fluorescente cyan (CFP), la protéine fluorescente jaune (YFP), DsRed et mCherry peuvent être utilisés. L&#39;amélioration de l&#39;efficacité fluorophore pliage, la luminosité et photostabilité sont constamment faits, et les enquêteurs devraient se prévaloir des dernières constructions de génération. <ol><li> Confirmer la séquence d&#39;ADN correcte et se assurer que le fragment GFP est dans le cadre avec la protéine d&#39;intérêt. Effectuer séquençage utilisant des stratégies d&#39;ADN recombinant 21. NOTE: De nombreuses institutions ont des installations d&#39;ADN base, qui l&#39;enquêteur est encouragé à contacter pour des informations supplémentaires. </li><li> Pour les protéines membranaires de passe simples ou doubles, générerles deux versions du terminal amino et carboxyle des protéines de fusion 19. </li><li> Pour les protéines transmembranaires multiples insérer à l&#39;intérieur des boucles de la GFP extramembrane putatifs, ainsi que les extrémités. Prendre des précautions particulières lors de la génération des chimères transmembranaires avec la protéine de fusion fluorescente fixée à l&#39;extrémité amino de la protéine cible comme des séquences de signaux sont souvent clivés par protéolyse de la protéine une fois que se est écoulé à travers la translocation du RE. </li><li> Dans le cas de séquences de signaux existants, introduire la protéine de fusion fluorescente distale par rapport au site de clivage de façon à générer une protéine mature contenant une protéine fluorescente marqué amino-terminal intact. Employer des stratégies classiques d&#39;ADN recombinant pour la production de chimères 21. </li></ol></li><li> Déterminer la présence d&#39;un signal fluorescent localisé de manière appropriée suffisante dans la lignée cellulaire d&#39;intérêt. <ol><li> Respecter les cellules sous microscopie à épifluorescence en utilisant la fluorescence intrinsèque de la GFP sous appromangé conditions de filtre défini. Pour les ensembles de filtres GFP englobant 510-560 nm, confirment que les filtres appropriés sont utilisés pour le fluorophore utilisé. NOTE: Un signal suffisante est atteinte lorsque l&#39;évaluation à l&#39;oeil fournit un signal assez fort pour que la structure cellulaire dans laquelle le signal est facilement résolu réside dessus du fond. En outre, le motif de coloration de la protéine GFP doit être compatible avec celle des marqueurs pour l&#39;organite approprié, et de préférence identique à celle de la protéine native non marqué. </li></ol></li><li> Déterminer si une approche de transfection stable ou transitoire sera utilisé basé sur la protéine en cours d&#39;évaluation. NOTE: transfectants stables permettent généralement à des niveaux inférieurs d&#39;expression que les systèmes transitoires. Bien que l&#39;expression transitoire donne une expression de haut niveau de protéines et d&#39;intensité augmentation de signal (~ 5-24 heures après la transfection en fonction de la protéine), elle peut aussi conduire à des artefacts de surexpression de protéines telles que aggrdélé- ou la saturation des protéines ciblant voies, conduisant à la localisation subcellulaire erronée. </li></ol> 2. La transfection de cellules et culture cellulaire NOTE: Une variété de cellules se prêtent à l&#39;analyse FPP, y compris Hek293, HeLa, COS-7 et des cellules CHO 14. La description suivante est basée sur l&#39;expression de protéines membranaires dans des cellules HEK293. <ol><li> Cultiver les cellules humaines embryonnaires de rein (HEK293) sous forme de monocouches adhérentes dans 6 ml de Eagles modifié de Dulbecco (DMEM), complété avec du sérum 5% de fœtus bovin (FBS), du pyruvate de sodium à 1%, et 250 pg / ml de pénicilline / streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO 2. Effectuer tous les travaux avec des cellules dans une hotte à flux laminaire de culture de tissus. Cultiver des cellules dans un milieu de culture jusqu&#39;à ~ 80% de confluence dans un flacon T-75. </li><li> cellules Transfecter utilisant ne importe quel haut rendement standard, à faible méthode de transfection de toxicité, y compris en lipides, technologies viral- ou à base électroporation à générer transient ou une expression stable. Typiquement, 2 pg d&#39;ADN plasmidique par 1 x 10 6 cellules donne une bonne expression de la protéine reproductible. Maintenir des cellules de 5 à 48 h dans un milieu de culture tissulaire approprié à 37 ° C dans un incubateur de culture capable de tissu CO 2. </li><li> Surveiller les cellules pour l&#39;expression de la protéine GFP-fusion en utilisant la microscopie à épifluorescence en utilisant le signal de fluorescence intrinsèque de la GFP, en utilisant les jeux de filtres appropriés selon le protocole du fabricant. Le signal de fluorescence atteint habituellement un maximum dans les 24 à 72 heures après transfection. Utilisation des cellules lorsque le signal de fluorescence atteint un niveau maximum. Surveiller les niveaux d&#39;expression de protéines par analyse par immunotransfert en utilisant des anticorps dirigés contre soit la protéine d&#39;intérêt ou du fragment GFP. </li><li> Pour les cellules de la plaque d&#39;analyse expérimentales sur des lamelles revêtues. Voir soit sous une configuration des cellules vivantes ou après fixation et monter sur des lames de microscopie. cellules de la plaque pour atteindre 60% -80% de confluence dans les 24-48 heures. <ol><li> Manteau de lamelles avec une solution de poly-lysine (0,1 mg / ml), de sorte que toute la surface soit couverte. Incuber pendant 30 min sous une lumière ultraviolette à la température ambiante, puis 60 min dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C. Retirer l&#39;excès de poly-lysine et rincer les lamelles dans du PBS trois fois. </li><li> Alternativement, la plaque les cellules sur un couvercle de verre chambré constituée de plaques de culture cellulaire avec un fond de verre optique pour permettre l&#39;imagerie directe avec les objectifs huile immersion. La configuration réelle de microscopie dépend de l&#39;équipement disponible à l&#39;enquêteur, mais devrait être capable de changements rapides de solutions. Selon la forme de type de cellule et la cellule, les cellules devraient être d&#39;environ 60 à 90% de confluence au moment de l&#39;essai FPP. </li></ol></li></ol> 3. Fluorescence Microscopy Setup <ol><li> Utiliser une ouverture numérique (NA) objectif de haut immersion dans l&#39;huile pour la collecte de signal maximal et la résolution spatiale, comme une 60X, 1,42 NA objectif à immersion d&#39;huile. Utilisez ee suivante lasers pour stimuler les fluorophores: argon 488 nm (GFP et YFP) et 561 diode (DP, mCherry). </li><li> Déterminer l&#39;exposition, le gain et la capture taux optimal d&#39;images pour chaque construction. Ajustez l&#39;intensité du laser et le temps d&#39;exposition afin de minimiser photoblanchiment (voir l&#39;étape 7.1.2). </li><li> Pour les études utilisant de multiples fluorophores (par exemple, un marqueur soluble pour perméabilisation de la membrane de concert avec un marqueur de protéine de la membrane), choisir un filtre approprié fixe pour minimiser le signal de diaphonie et de maximiser le rapport signal-bruit. </li></ol> 4. Mise en place des conditions optimales pour la membrane plasmique perméabilisation <ol><li> Retirer le milieu de culture cellulaire à partir de cellules exprimant seulement des protéines fluorescentes solubles (par exemple EGFP, DsRed). Laver les cellules trois fois (une minute chacun) dans du tampon KHM (110 mM d&#39;acétate de potassium, 3 mM de MgCl2, 20 mM de HEPES-NaOH, pH 7,2). Réaliser des expériences sur des cellules et tous les réactifs à la température ambiante. </li><li> La place des cellules on lamelles (voir l&#39;étape 2.4) dans un tampon KHM sur une scène de microscope à fluorescence et de recueillir la première image, qui représente la commande de l&#39;étage «non-perméabilisées &#39;. </li><li> Pour perméabiliser sélectivement la membrane plasmatique, ajouter la digitonine (30 uM) dans du tampon KHM aux cellules. Perfuser les cellules avec du tampon (tampon digitonine +) à un débit de 5 ml / min pendant 10 à 60 sec. </li><li> Déterminer la concentration optimale de la digitonine en augmentant progressivement la concentration de la digitonine. La concentration digitonine optimale est atteinte quand il ya perte totale de signal de fluorescence de EGFP soluble dans les 10 à 60 secondes d&#39;application digitonine. Pour de nombreuses cellules application de 10 à 50 uM digitonine est suffisante pour perméabiliser la membrane cellulaire. <ol><li> Pour toutes les applications utilisent la concentration la plus basse possible de digitonine. Recueillir images après digitonine perméabilisation pour perméabilisée signal de fond. </li></ol></li><li> Assurez-vous que la chimère GFP-protéine d&#39;intérêt est membraneITéS en confirmant rétention cellulaire du signal de fluorescence suivant la digitonine perméabilisation de la membrane plasmique 16. <ol><li> Exprimez un organite spécifique protéine fluorescente 23. Protéines mitochondriales fonctionnent bien à cet égard 16, par exemple, pDsRed2-Mito vecteur. Déterminer les conditions optimales d&#39;expression tel que décrit dans l&#39;étape 2.1. </li><li> Se assurer que la concentration de la digitonine est approprié pour le type de cellule employé en se assurant que la morphologie des organites intracellulaires et constants (jusqu&#39;à 60 min) une exposition prolongée à la digitonine. REMARQUE: utiliser des protocoles de microscopie d&#39;immunofluorescence standard en utilisant des anticorps contre divers compartiments cellulaires, telles que les lysosomes (par exemple, LAMPE1), l&#39;appareil de Golgi (par exemple, TGN38), réticulum endoplasmique (par exemple, la calnexine), endosomes (par exemple, Rab5), les mitochondries (par exemple, le cytochrome c). Si organite intracellulaire changements morphologie / intégrité considérablement over 60 min, il est probable que la concentration de la digitonine est trop élevé, et nécessite une réduction de la concentration de la digitonine et / ou le temps d&#39;exposition. REMARQUE: Digitonine est toxique par inhalation et par contact avec la peau. Porter un équipement de protection individuelle (EPI). </li></ol></li></ol> 5. Traitement de la protéase protéines fluorescentes <ol><li> Laver les cellules dans un tampon KHM puis ajouter protéase (protéinase K; 50 pg / ml dans un tampon KHM) directement sur les cellules. Perfuser les cellules à un débit de 5 ml / min en utilisant un système de perfusion alimenté par gravité pour la préparation en continu bain de flux. <ol><li> Stocker les solutions à 50 ml seringues et des tuyaux en polyéthylène raccordés réservoirs indépendants à un collecteur avec une sortie unique, dans le bain (débit 5 ml / min). Positionner une pipette d&#39;aspiration pour maintenir un (0,5 ml) Volume du bain constante et réaliser l&#39;échange de solution par commutation manuelle entre les réservoirs de perfusion. </li></ol></li><li> Recueillir des images pour déterminer si le fluorsignal de Escent persiste ou se dégrade. Une perte de&gt; 90% de l&#39;intensité de signal initial sur 30 à 60 secondes est compatible avec la dégradation protéolytique de la protéine chimère-GFP (voir résultats représentatifs). </li><li> Si aucune dégradation du signal est observé avec la protéinase K, lorsqu&#39;une telle perte est prévu, remplacer la solution de protéinase K avec de la trypsine (4-8 mM) dans le tampon KHM. Si nécessaire, utiliser un mélange de trypsine et la proteinase K. Il ne est pas nécessaire pour éteindre l&#39;activité de protease. </li></ol> 6. Approche alternative pour le plasma protéines membranaires avec des domaines externes <ol><li> Pour les protéines de la membrane plasmique, pour réaliser le dosage des protéines fluorescentes externes chimères avant la digitonine perméabilisation. Laver les cellules sur des lamelles dans du tampon KHM (5 ml / min x 3 min), et de prendre une image pour le traitement pré-protéase et quantifier signal de fluorescence pré-protéase comme à l&#39;étape 7. </li><li> Exposer les cellules de la protéase (protéinase K; 50 pg / ml ou trypsine 4-8 mM dans un tampon KHM) en til absence de digitonine par perfusion des cellules avec un milieu contenant KHM protéase (débit 5 ml / min). Recueillir des images de la protéine fluorescente, afin de déterminer comment rapidement le signal disparaît ou combien de temps le signal persiste. </li><li> Avant de perméabilisation de la digitonine, étancher toute activité de protease, par lavage des cellules trois fois (une minute chacun) dans des milieux de culture cellulaire contenant 10% de sérum (FBS). </li><li> Laver les cellules avec du tampon de perfusion KHM (taux de 5 ml / min) pendant 2 min. Acquérir une image pré-perméabilisation. Perméabiliser la membrane cellulaire comme décrit dans l&#39;étape 4. </li><li> Recueillir images suivantes plus protéase comme décrit à l&#39;étape 5. </li></ol> Analyse 7. Image <ol><li> Utilisation d&#39;un microscope inversé capable de «cellules vivantes&quot; enregistrement, dans lequel la perte du signal de fluorescence peut être surveillé en temps réel. Pour la surveillance continue, utiliser des paramètres identiques (temps d&#39;exposition, le gain, l&#39;intensité du laser, etc.). <ol><li> Déterminer experexpérimen- paramètres en observant le signal de fluorescence de la GFP-protéine d&#39;intérêt dans des conditions témoins (à savoir, KBH tampon seul). Ajuster le gain, l&#39;intensité du laser et des paramètres de temps d&#39;exposition sur le microscope commandé par ordinateur pour se assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de perte sensible de l&#39;intensité du signal sur une période de 10-20 min. REMARQUE: l&#39;intensité du signal ne est pas une valeur absolue, mais est basé sur le système de microscope et les paramètres disponibles à chaque PI. Suivre l&#39;évolution de l&#39;intensité relative de fluorescence. </li></ol></li><li> Alternativement, traiter les cellules à un calendrier établi points dans digitonine suivie par une protéase, et fixer les cellules avant de monter sur des lamelles pour l&#39;imagerie. Déterminer les points de temps empiriquement procédures dans les étapes 4 et 5. Pour l&#39;enquête initiale après, commencent à 0, 30, 60, 120 et 300 secondes après addition de digitonine ou protéase. <ol><li> Fixer les cellules (20 min à température ambiante) en utilisant une quantité suffisante de fixateur (3,7% de paraformaldehyde dans du PBS) pour submerger complètement èmecellules de e. </li><li> Quench paraformaldehyde résiduel par rinçage des cellules avec du PBS contenant de la glycine 20 mM (3 x 5 min). </li><li> Monter lamelles en éliminant l&#39;excès de liquide de la lamelle et l&#39;inversion de la lamelle sur support de montage 50 pi sur un microscope de lames de verre pour l&#39;imagerie. Laisser les lames sécher toute la nuit avant d&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Recueillir des images de microscopie par fluorescence (sous les filtres appropriés fixe compatible avec le fluorophore utilisé) en utilisant la fonction de capture d&#39;image vidéo sur un ordinateur contrôlé microscope à fluorescence. </li><li> Quantifier les intensités de signal fluorescent en fonction de la condition d&#39;incubation. Obtenir l&#39;intensité moyenne de pixels dans une région d&#39;intérêt (ROI) qui entoure une cellule individuelle. </li></ol>

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

L&#39;orientation correcte et la topologie des protéines de la membrane sont essentielles pour leur bon fonctionnement. Malgré l&#39;importance de comprendre protéine membranaire topologie, il ya beaucoup de protéines pour lesquelles ces données sont complètement défaut. FPP fournit un moyen facile et efficace de détermination de protéine membranaire topologie, et qui peut être effectuée par la plupart des laboratoires. L&#39;approche FPP offre des avantages significatifs par rapport aux méthodes précédentes pour déterm...

Les membranes de plasma, ainsi que les nombreuses membranes intracellulaires, servent de barrières séparant deux compartiments aqueux. Dans le cas de la membrane plasmique, la séparation entre l&#39;extérieur et l&#39;intérieur de la cellule; pour organites intracellulaires elle est comprise entre le cytoplasme et la lumière des organites. Par exemple, la membrane du réticulum endoplasmique (RE) sépare un environnement oxydant dans la lumière du RE à partir d&#39;un environnement en réduisant une cytosolique. Les protéines membranaires sont synthétisées sur les ribosomes ER-associé, et d&#39;atteindre leur topologie finale dans la membrane du RE 2. L&#39;acquisition de l&#39;orientation de la membrane appropriée et la topologie des protéines est critique pour leur fonction normale. Corriger la topologie permet les domaines pertinents de protéines membranaires d&#39;interagir avec leurs partenaires de liaison, elle permet des modifications post-traductionnelles importantes se produisent, et dans le cas de protéines de la membrane plasmique, permet à la cellule d&#39;interagir avec et de répondre to son environnement. Pour apprécier pleinement la fonction d&#39;une protéine de membrane, il est impératif de connaître clairement comment cette protéine est orienté par rapport à la membrane à l&#39;intérieur duquel il se trouve, ce est à dire, sa topologie de membrane. En plus de l&#39;acquisition de connaissances scientifiques de base, la compréhension de la topologie d&#39;une protéine de membrane et les aspects d&#39;une surface de la protéine sont exposées à des environnements différents marqué a des implications cliniques depuis protéines membranaires constituent la majorité des trois cibles pharmacologiques. Jusqu&#39;à récemment, les approches de la détermination de protéine membranaire topologie ont nécessité un investissement considérable en temps et de l&#39;argent ou ont exigé des réactifs qui sont difficiles à trouver. Les deux approches expérimentales et in silico ont été employées pour déterminer la topologie de membrane de protéines résidant dans la membrane plasmique. Depuis les premières prédictions de domaines membranaires se étendant sur la base de l&#39;évaluation de l&#39;hydrophobicité indiviacides aminés double 3, de nombreux algorithmes prédictifs sont maintenant disponibles sur l&#39;Internet, et nécessitent tout simplement connaissance de la séquence d&#39;acides aminés de la protéine. Cependant, les hypothèses sont souvent au cœur de ces programmes de modélisation, des hypothèses qui peuvent conduire à des affectations incorrectes de topologie 4,5. En outre, si ces prédictions informatiques peuvent affecter provisoirement régions couvrant la membrane, ils ne déterminent pas toujours si l&#39;extrémité amino ou carboxy terminales de protéines sont dans le cytoplasme, des organites ou lumen extérieur de la cellule. Même avec une augmentation de puissance de calcul, et l&#39;utilisation de l&#39;apprentissage machine algorithmes 6, ces données est toujours un modèle, et doit être validée en utilisant des données expérimentales acquises. Détermination expérimentale directe de topologie de membrane a été réalisée en utilisant des panneaux d&#39;anticorps monoclonaux avec des epitopes connus répartis dans la protéine, où l&#39;évaluation de leur immunoréactivité a été effectuée avant et après perméabilisation de la cellule. Cetteapproche nécessite un ensemble d&#39;anticorps, qui peuvent ne pas être disponibles pour la protéine d&#39;intérêt. Une autre stratégie consiste à concevoir des étiquettes d&#39;épitopes tels que myc ou l&#39;hémagglutinine (HA) dans divers endroits de la protéine, à nouveau suivi par la détermination de l&#39;immunoréactivité avant et après perméabilisation de la membrane. En plus de balises immunogènes, étiquettes enzymatiques (y compris la phosphatase alcaline, β-galactosidase, β-lactamase ou) et des modifications chimiques telles que la numérisation de la cystéine ont tous été utilisée pour déterminer protéine membranaire topologie 7,8. Une autre méthode employée pour la cartographie topologique des protéines de la membrane plasmique se appuie sur une approche légèrement différente de marqueurs d&#39;épitopes. Dans ce procédé, la séquence de marqueur est la séquence consensus de glycosylation N-lié NXS / T. Etant donné que la glycosylation ne se produit que lorsqu&#39;une telle séquence est présente dans le lumen de la voie de biosynthèse, la présence de l&#39;étiquette par rapport à un luminaleun compartiment cytosolique est facilement observable comme un changement de masse sur des gels de SDS-PAGE. Une telle approche a été appliquée sur le canal ionique CFTR multispanning 9. Bien que toutes ces approches ont été utilisées, il est clair que tous exigent des investissements considérables de la biologie moléculaire et la séquence pour générer les constructions multiples. Pour déterminer les informations topologiques concernant protéines transmembranaires situés dans des organites intracellulaires se est avéré être plus difficile. L&#39;application des technologies à base de fluorescence cependant, a fait la détermination de la topologie de la membrane beaucoup plus simple. La technique de fluorescence bimoléculaire complémentation (BiFC) repose sur l&#39;interaction entre deux fragments non fluorescents d&#39;une protéine fluorescente, la restauration des propriétés fluorescentes de 10 cette protéine. Bien qu&#39;initialement décrit pour la détermination des interactions protéine-protéine in vivo 10, cette approche a aussi été utiliséepour déterminer la topologie membranaire protéine dans les cellules végétales 11. Toutefois, cette approche est également fastidieux car il nécessite la génération non seulement des protéines de fusion avec la protéine d&#39;intérêt, mais également une variété de protéines de fusion ciblées vers le cytosol ou organites lumière, et nécessite des connaissances dont intracellulaire membranes de la protéine d&#39;intérêt de réside dans . Une approche alternative plus simple à déterminer protéine membranaire topologie a été décrite 12. L&#39;analyse, par fluorescence de la protection de la protéase (FPP) nécessite la génération d&#39;une protéine de fusion entre la GFP et le gène d&#39;intérêt. L&#39;approche est basée sur l&#39;accessibilité relative des proteases non spécifiques à la fraction de la GFP; selon que la GFP est protégé de la protéolyse par la lumière résidant dans des organites intracellulaires ou est exposé à la protéolyse en étant présente dans le cytosol. Ainsi, si le fragment GFP de la protéine d&#39;intérêt est confronté le cytoplasme, il est exposé àactivité de la protease et le signal de fluorescence perdues. Inversement, si le fragment GFP de la protéine d&#39;intérêt est confronté à un environnement «protégé» à partir de la protéase (tel que la lumière de l&#39;appareil de Golgi), le signal de fluorescence persistera. Pour permettre d&#39;entrer les proteases de la cellule, mais pas entre les compartiments membranaires intracellulaires la liaison cholestérol digitonine médicament est utilisé. Le cholestérol est le sterol dominant chez les vertébrés, et est spécifiquement enrichi dans la membrane de plasma par rapport à compartiments intracellulaires. La toxine de glycoside, la digitonine, est extraite de la plante Digitalis purpurea. Digitonine a une affinité pour les membranes riches en cholestérol, où elle conduit à membrane sélective permeabiliztion 14,16 (figure 1). En plus de permettre la sortie des petits composants cytosoliques, la digitonine perméabilisation permet également l&#39;entrée de molécules exogènes, tels que la protéinase K ou de la trypsine. Le protocole FPP profite de la fact que la membrane de plasma contient jusqu&#39;à 80% de cholestérol cellulaire 17, tandis que d&#39;autres organelles, comme ER, l&#39;appareil de Golgi, endosomes, les mitochondries, qui ont une très faible teneur en cholestérol, 14 restent intacts. L&#39;incorporation sélective de cholestérol dans la membrane plasmique a été observé dans de nombreuses cellules eucaryotes, ce qui permet l&#39;utilisation de la digitonine dépendant membrane plasmique perméabilisation de ces espèces eucaryotes aussi divers que S. cerevisiae à 14,18 humain. Le dosage FPP fournit un moyen simple, rapide et assez robustes de déterminer (a) si une protéine est liée à la membrane / associé ou librement diffusable dans le cytosol et (b) quel domaine d&#39;une protéine de la membrane fait face le cytosol ou organites lumière. Si une protéine membranaire avoir plusieurs orientations, le signal se posera de la forme dominante et formes mineures ne sera pas détecté. Bien qu&#39;il puisse y avoir une certaine inquiétude que l&#39;addition d&#39;un fragment de la protéine GFP à l&#39;intérêt peut affecter sa fonction et/ Ou la localisation subcellulaire, ce est en fait plus théorique que réelle. En effet de nombreuses études ont clairement montré que la balise de la GFP ne modifie pas les propriétés de la protéine 19,20.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Média de montage</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

détermination membrane protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (fpp)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

La topologie et l’orientation correctes des protéines membranaires intégrales sont essentielles à leur bon fonctionnement, mais une telle information n’a pas été établie pour de nombreuses protéines membranaires. Une technique simple appelée protection par protéase par fluorescence (FPP) est présentée, qui permet de déterminer la topologie des protéines membranaires dans les cellules vivantes. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport aux autres méthodes de détermination de la topologie des protéines, en ce sens qu’elle ne nécessite pas la disponibilité de plusieurs anticorps contre divers domaines de la protéine membranaire, ne nécessite pas de grandes quantités de protéines et peut être réalisée sur des cellules vivantes. La méthode FPP utilise les actions spatialement confinées des protéases sur la dégradation des protéines membranaires marquées à la protéine fluorescente verte (GFP) pour déterminer leur topologie et leur orientation membranaires. Cette approche simple est applicable à une grande variété de types de cellules et peut être utilisée pour déterminer l’orientation des protéines membranaires dans divers organites subcellulaires tels que les mitochondries, le Golgi, le réticulum endoplasmique et les composants du système endosomal/recyclage. Les protéines membranaires, marquées sur les extrémités N-terminales ou C-terminales avec une fusion GFP, sont exprimées dans une cellule d’intérêt, qui est soumise à une perméabilisation sélective à l’aide de la digitonine détergente. La digoninine a la capacité de perméabiliser la membrane plasmique, tout en laissant les organites intracellulaires intacts. Les fractions GFP exposées au cytosol peuvent être dégradées de manière sélective par l’application de protéase, tandis que les fractions GFP présentes dans la lumière des organites sont protégées de la protéase et restent intactes. Le dosage FPP est simple et les résultats peuvent être obtenus rapidement.

Plasma Membrane perméabilisation Efficient perméabilisation de la membrane plasmique est déterminée par l&#39;utilisation de protéines fluorescentes solubles (par exemple, GFP, DsRed) (étape 4). Ces protéines, lorsqu&#39;elle est exprimée dans des cellules, sont libres de diffuser dans le cytosol, et sont perdus lors de la membrane plasmique est perméabilisées à l&#39;aide de la digitonine (figure 2). Une disparition complète du signal fluorescent doit avoi...

Ici, nous présentons un protocole pour déterminer l’orientation et la topologie des protéines membranaires intégrales dans les cellules vivantes. Ce protocole simple repose sur la sensibilité sélective de la protéase des chimères entre la protéine d’intérêt et la GFP.

Détermination Membrane Protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la topologie des protéines membranaires intégrales. Cela est réalisé par l'expression d'une fusion entre la protéine fluorescente verte ou GFP et les extrémités amino ou carboxyle de la protéine membranaire d'intérêt dans les cellules. À des fins de contrôle, des protéines fluorescentes solubles telles que RFP peuvent être exprimées.Ensuite, la membrane plasmique est soumise à une perméabilisation sélective. À l'aide du détergent dig, les protéines fluorescentes solubles sortiront de la cellule, tandis que les protéines fluorescentes liées à la membrane seront retenues à l'intérieur de la cellule. La dernière étape consiste à appliquer une protéase sur les cellules perméabilisées et à déterminer la rétention ou la perte du signal fluorescent.En fin de compte, les variations de l'intensité de fluorescence observées à l'aide de l'imagerie par microscopie de fluorescence sont utilisées pour montrer la topologie et l'orientation des protéines membranaires intégrales. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la cartographie des épitopes, est que la procédure ne nécessite pas beaucoup d'équipements spécialisés ni divers réactifs qui peuvent être difficiles à obtenir. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie des protéines membranaires, telles que les domaines d'une protéine membranaire intégrale qui pourraient se trouver dans le cytosol par opposition à ceux qui pourraient être situés dans la lumière d'organites tels que le réticulum endoplasmique ou les endosomes.Commencez cette procédure par la génération et la validation de la protéine fluorescente KY, comme décrit dans le protocole textuel. Transfectez ensuite la protéine fluorescente KY dans des cellules rénales embryonnaires humaines ou des cellules HEK 293 en utilisant une méthode de transfection standard à haute efficacité et faible toxicité, y compris des technologies basées sur des lipides, des vecteurs viraux ou l'électroporation, afin d'obtenir une expression transitoire ou stable. Les cellules sont ensuite ensemencées sur des lamelles recouvertes de polylysine. Maintenez les cellules de cinq à 48 heures dans un milieu de culture tissulaire approprié à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire compatible avec le dioxyde de carbone.Surveillez les cellules pour l'expression de la protéine de fusion GFP en utilisant la microscopie à fluorescence en épifluorescence ; le signal fluorescent intrinsèque de GFP atteint généralement un maximum entre 24 et 72 heures après la transfection. Utilisez les cellules lorsque le signal fluorescent atteint son niveau maximal. L'expression protéique peut également être contrôlée par analyse en immuno-blot à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine d'intérêt ou contre la partie GFP.Pour commencer, mettez en place le système de perfusion par gravité destiné au traitement des cellules. Préparez des seringues de 50 millilitres pour les solutions, équipées de tubulures en polyéthylène reliées à des réservoirs indépendants et à un collecteur possédant une sortie unique vers le bain. Positionnez une pipette d'aspiration afin de maintenir un volume constant dans le bain et effectuez le changement de solution en passant manuellement d'un réservoir de perfusion à l'autre pour permettre la perméation de la membrane plasmique.Commencez par retirer le milieu de culture cellulaire des cellules. Lavez les cellules trois fois pendant une minute chacune. Dans du tampon KHM, placez les lamelles sur la platine d'un microscope à fluorescence et recueillez la première image, qui représente l'image témoin non perméabilisée afin de perméabiliser sélectivement la membrane plasmique.Ajouter de la digitonine dans le tampon KHM aux cellules, puis perfuser les cellules avec le tampon contenant de la digitonine à un débit de cinq millilitres par minute pendant 10 à 60 secondes. La confirmation que la membrane plasmique est suffisamment perméabilisée peut être facilement réalisée par l'expression d'une molécule GFP ou RFP soluble, qui diffusera rapidement hors de la cellule après la perméabilisation membranaire. Ensuite, confirmer que la protéine chimérique GFP d'intérêt est intégrée à la membrane en vérifiant la rétention cellulaire du signal fluorescent après la digitonine et la perméabilisation de la membrane plasmique.Ensuite, exprimez une protéine fluorescente spécifique à un organite, telle qu'une protéine mitochondriale, comme indiqué dans le protocole textuel. Déterminez les conditions d'expression optimales comme précédemment. Vérifiez que la digestion et la concentration sont adaptées au type cellulaire utilisé en vous assurant que la morphologie des organites intracellulaires reste constante lors d'une exposition prolongée.Pour creuser les toin. Après avoir lavé les cellules dans un tampon KHM, ajoutez directement la protéase sur les cellules. Parcourez les cellules à un débit de cinq millilitres par minute, en utilisant un système de perfusion par gravité pour baigner continuellement la préparation.Ensuite, déterminez si le signal fluorescent persiste ou se dégrade. Acquérez des images de microscopie fluorescente avec les jeux de filtres appropriés en utilisant la fonction de capture d'images vidéo sur un microscope fluorescent commandé par ordinateur. Quantifiez les intensités du signal fluorescent en fonction des conditions d'incubation.Obtenir l'intensité moyenne des pixels dans une région d'intérêt englobant une cellule individuelle. Une perte supérieure à 90 % de l'intensité initiale du signal sur une période de 30 à 60 secondes est compatible avec une dégradation protéolytique de la protéine GFP ky. La disparition complète du signal fluorescent soluble doit survenir entre 10 et 60 secondes après l'application de la digitotoxine.La confirmation que la protéine d'intérêt est associée à des organites intracellulaires s'obtient en observant la conservation du signal fluorescent après digestion et perméabilisation. La queue carboxy-terminale de la kinase ancrée à la membrane LTK2 a été fusionnée à la GFP et exprimée de façon transitoire dans LTK fluorescent. Le signal GFP a disparu rapidement après l'ajout de protéinase K, indiquant que la localisation du terminus carboxy de LTK2 se trouve dans le cytosol.Cavi et GFP est une protéine de la membrane plasmique dotée d'une partie GFP attachée au domaine cytosolique. Comme pour LTK deux, le signal provenant de cavi et GFP est insensible à la digitonine, mais sensible à l'ajout ultérieur de protéase. DS red mito code une protéine fluorescente rouge fusionnée à la séquence de ciblage mitochondrial provenant de la cytochrome C oxydase après perméabilisation par la digon, ainsi qu'à l'ajout de protéinase K. La fluorescence associée à DS red mito reste stable. Ceci est compatible avec le fait que le Fluor quatre se trouve dans les mitochondries, où il n'est pas exposé au cytosol.Lorsque la partie fluorophore attachée à une protéine membranaire est orientée vers l'extérieur de la cellule, comme dans le cas de la protéine prion ancrée par un GPI et liée à la protéine fluorescente jaune, un traitement par protéinase devrait rapidement éteindre le signal fluorescent, sans nécessiter au préalable une perméabilisation membranaire, comme prévu. Après traitement par protéinase, le signal fluorescent extracellulaire a disparu rapidement chez les cellules exprimant cette construction.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à deux heures si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la manière de déterminer la topologie de votre protéine membranaire d'intérêt.

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Détermination Membrane Protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (FPP)

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