Isolement de l'ARN à partir de sous-populations cellulaires spécifiques en utilisant le laser capture microdissection Combiné avec Rapid immunomarquage

L’objectif global de cette procédure est de démontrer comment effectuer un immunomarquage rapide d’une population de cellules cérébrales de souris isolée par capture laser, microdissection ou LCM tout en maintenant l’intégrité de l’ARN des échantillons. Ceci est accompli en congelant d’abord rapidement le tissu cérébral disséqué. Le cerveau est ensuite découpé en fines sections sur des lames de microscope en verre sans ARN et traité avec une immunocoloration rapide.

Enfin, la population cellulaire d’intérêt est isolée à l’aide du LCM. In fine, la coloration rapide suivie d’une microdissection par capture laser permet d’identifier les changements dans l’expression du gène d’intérêt dans l’échantillon de cellule expérimentale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le tri des cellules activées par fluorescence, est qu’avec notre technique, la résolution spatiale est maintenue, ce qui permet la solution de la cellule spécifique de l’ES à partir du tissu environnant.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette cellule de Smith tournent en rond, car cette procédure comprend plusieurs étapes critiques qui nécessitent de travailler rapidement pour maintenir l’intégrité de l’ARN dans les échantillons. Pour préparer les échantillons à la section, disséquez les cerveaux des souris postnatales du premier jour dans un milieu L 15 glacé dans les deux minutes suivant le sacrifice. Ensuite, placez les cerveaux dans des moules d’enrobage dans l’orientation appropriée pour la section et remplissez les moules de tissu congelé, en enrobant des milieux.

Ensuite, congelez immédiatement les échantillons dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius dans les 30 secondes suivant la congélation. Maintenant, traitez les lames de verre recouvertes d’une membrane avec une décontamination de l’ARN de surface pour éliminer toute trace d’ARN. Rincez-les à l’eau DEPC et laissez-les sécher à l’air libre lorsque les lames sont sèches.

Réglez la température de la chambre du cryostat à moins 20 degrés Celsius et transférez l’échantillon congelé dans le cryostat. Pour chaque échantillon, montez le bloc congelé sur la pince à échantillon et coupez les échantillons à une épaisseur de 10 microns, en recueillant les sections sur les lames recouvertes de membrane. Après avoir laissé sécher les sections pendant au moins 10 minutes, utilisez un stylo barrière hydrophobe pour encercler les tissus.

Après environ 10 secondes, placez les lames dans une solution de fixation froide fraîchement préparée pendant pas plus de cinq minutes à moins 20 degrés Celsius. Transférez maintenant les lames dans un plateau propre prétraité avec une solution de décontamination de l’ARN de surface. Tout d’abord, secouez les lames une fois pour éliminer tout excès de fixateur et lavez-les avec six à huit trempettes rapides Dans D-E-P-C-P-B-S feuilletez les diapositives.

Pour éliminer l’excès de D-E-P-C-P-B-S, ajoutez 200 microlitres de la solution d’anticorps primaire dans chaque section. Après 10 minutes à température ambiante, lavez les lames avec trois trempettes rapides dans D-E-P-C-P-B-S et effleurez-les une fois pour éliminer l’excès de solution de lavage. Ensuite, incubez les échantillons dans 200 microlitres de la solution d’anticorps secondaires à température ambiante après six minutes.

Lavez les lames dans D-E-P-C-P-B-S comme nous venons de le démontrer et incuberez-les dans une solution BC fraîchement préparée pendant quatre minutes après un autre lavage rapide D-E-P-C-P-B-S mélangez 196 microlitres de DAB fraîchement préparé avec quatre microlitres d’inhibiteur d’ARN. Juste avant d’ajouter la solution à la section, laissez le DAB se développer pendant une à deux minutes, suivi d’un lavage A-D-E-P-C-P-B-S. Ensuite, déshydratez les sections avec une incubation de quelques secondes dans de l’éthanol absolu et séchez les lames pour passer au LCM.

Ensuite, à 50 microlitres de tampon de lyse à partir d’un kit d’extraction d’ARN dans le capuchon du tube collecteur. Placez ensuite une lame sous le microscope avec le côté de l’échantillon face au capuchon. Choisissez le meilleur grossissement pour l’échantillon et ajustez la mise au point pour voir les cellules d’intérêt.

Définissez ensuite la zone de coupe et commencez à découper avec le laser. La collecte du matériel disséqué dans le tube collecteur permet de recouvrir les cellules collectées pendant 30 minutes à 42 degrés Celsius. Pendant ce temps, préconditionnez une colonne de purification d’ARN du kit d’extraction d’ARN avec 250 microlitres de tampon de conditionnement.

Ensuite, chargez 50 microlitres d’éthanol dans les cellules lysées de la colonne et centrifugez la colonne pendant deux minutes à 16 000 G et à température ambiante, puis deux rinçages avec un tampon de lavage. Enfin, éluez l’ARN dans le volume minimal recommandé de 11 microlitres d’eau libre d’ARN en gardant deux microlitres de côté pour tester la qualité de l’ARN. Cette procédure d’immunomarquage rapide permet de visualiser les cellules d’intérêt tout en préservant l’intégrité de l’ARN expérimental.

Selon l’expérience, le LCM peut être utilisé, comme nous venons de le démontrer, pour isoler des cellules uniques ou des régions d’intérêt plus grandes. L’ARN dégradé a un impact considérable sur la qualité de l’analyse en aval. Chaque échantillon est ainsi traité sur une plateforme bio-analyseuse basée sur un microfluide X pour permettre la quantification et la vérification de l’intégrité de l’ARN isolé comme nous venons de le démontrer.

Par exemple, ici, les résultats typiques d’un bioanalyseur sont à la fois dégradés et de bonne qualité. Des échantillons d’ARN sont montrés. En effet, le gel numérique et les électrophérogrammes démontrent l’importance d’utiliser un inhibiteur de rase dans chaque solution pour protéger l’ARN suite à cette procédure, l’ARN de haute qualité peut être traité ultérieurement pour des applications en aval, y compris le séquençage de l’ARN MICROARRAY ou Q-R-D-P-C-R, par exemple, dans ces graphiques, l’enrichissement moyen pour l’expression du gène TH et A A DC dans l’échantillon micro disséqué par rapport aux sections du cerveau moyen a été déterminé à plus de 170 fois.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler très rapidement et avec du matériel exempt d’ARN. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler une population spécifique de cellules à partir de n’importe quel tissu.