Name: Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Découvrez le silençage génique par nanoparticules de chitosane/ARNi chez les larves de moustiques vecteurs. Cette méthode permet d'étudier la fonction des gènes impliqués dans la transmission des maladies.

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Le financement de la station d’expérimentation agricole du Kansas et du K-State Arthropod Genomics Center à KYZ a soutenu le développement original du silençage génique médié par le chitosan/dsRNA chez A. gambiae19. Les travaux sur A. gambiae décrits ici ont été soutenus en partie par le R01-AI095842 du NIH/NIAID à KM. Le développement du silençage génique médié par le chitosan/siRNA chez A. aegypti20,21 a été soutenu par le NIH/NIAID Award R01-AI081795 à MDS. Le contenu de cette étude relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels du NIH.

1. Mosquito espèces et l&#39;élevage <ol><li> Maintenir A. gambiae G3 et A. souches aegypti Liverpool IB12 (utilisés dans les études représentatives ci-dessous) ou d&#39;autres souches d&#39;intérêt conformément à la pratique de laboratoire standard ou comme décrit précédemment 23,24. </li></ol> 2. ARNdb et siRNA Conception et production <ol><li> Concevoir des amorces pour construire des modèles de longs ARNdb spécifiques du gène d&#39;intérêt. Utilisez l&#39;outil E-ARNi 25. Produire ARNdb selon la méthode de choix ou 19 comme décrit précédemment. <ol><li> Pour un témoin négatif, 19 synthétiser l&#39;ARN double brin correspondant à la séquence de la protéine fluorescente verte (GFP), la β-galactosidase (β-gal) ou un autre gène non exprimé chez les moustiques. Si on le souhaite, 19 l&#39;ARNdb utilisé pour générer les résultats représentatifs sont résumées ci-dessous peut être utilisé comme témoin positif. Magasin ARNdb dissous dans l&#39;eau sans RNAse à -80 °; C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Alternativement, la conception siRNA spécifique du gène selon la pratique de laboratoire standard ou comme décrit précédemment 10. Brouiller la séquence d&#39;un effet de choc pour concevoir siRNA siRNA contrôle négatif qui ne correspond pas à ne importe quel gène de moustique. Achetez les siRNA personnalisés, qui sont disponibles à travers un certain nombre de vendeurs de bonne réputation. <ol><li> Si on le souhaite, des siRNA 20,21 utilisée pour obtenir des résultats représentatifs sont résumées ci-dessous peuvent être utilisés comme témoins positifs. Magasin siRNA dissous dans l&#39;eau sans RNase à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li></ol> 3. Préparation de chitosane / ARN interférent nanoparticules <ol><li> Recueillir le sulfate de sodium 100 mM RT pré-fabriqué (100 mM de Na 2 SO 4 dans H 2 O déminéralisée) et de l&#39;acétate de sodium 0,1 M (0,1 M NaCl 2 H 3 O 2 -0,1 M d&#39;acide acétique, pH 4,5 dans désionisée H 2 O) tampons. </li><li> Dissoudre chitosane (≥75%désacétylée) dans du tampon acétate de sodium 0,1 M pour faire 0,02% (p / v) de solution de travail et maintenir la solution à la température ambiante avant utilisation. </li><li> Dissoudre ARNdb ou siRNA dans 50 ul de H 2 O déminéralisée et l&#39;ajouter au tampon de sulfate de sodium 100 mM pour obtenir une solution de 100 ul de 32 ug d&#39;ARN double brin / siRNA pour 100 ul de sulfate de sodium à 50 mM. </li><li> Ajouter 100 ul de solution de chitosane dans la solution ARNdb / siRNA, puis chauffer le mélange dans un bain d&#39;eau à 55 ° C pendant 1 min. Mettre en place un contrôle par addition de 100 ul de sulfate de sodium à 50 mM à 100 pi de solution de chitosane et suivre la même procédure. </li><li> Mélanger les solutions immédiatement pendant 30 secondes au vortex à grande vitesse à la température ambiante pour faciliter la formation de nanoparticules. </li><li> Centrifuger le mélange à 13 000 xg pendant 10 min à température ambiante, temps au bout duquel une pastille doit être visible. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Air-sécher le culot pour ≈10 min à température ambiante avant de l&#39;utiliser pour préparer la nourriture de moustique. </li><li> Mesure la concentration de l&#39;ARN double brin / siRNA dans le surnageant en utilisant le surnageant de la commande (voir 3.5) comme un blanc pour calculer le montant total de l&#39;ARN double brin / siRNA qui restait dans le surnageant. Utiliser la différence entre les montants de départ de l&#39;ARN double brin / siRNA et les montants restants dans les surnageants pour calculer le pourcentage d&#39;ARNdb / siRNA piégé dans les nanoparticules. Cette efficacité de chargement est normalement plus de 90%. </li><li> Répétez la même procédure si plus de nanoparticules sont nécessaires. Utiliser immédiatement les nanoparticules séchées. L&#39;impact de l&#39;entreposage frigorifique des particules avant l&#39;utilisation n&#39;a pas été évaluée. </li></ol> 4. Préparation des aliments contenant du chitosane Mosquito / ARN interférent nanoparticules <ol><li> Préparer 1 ml d&#39;une solution d&#39;agarose à 2% (p / v) dans de l&#39;eau déminéralisée, faire fondre l&#39;agarose, et de garder solution d&#39;agarose fondu dans un bain de 55 ° C de l&#39;eau avant utilisation. </li><li> Mélangez les flocons de nourriture pour les poissons (47% de protéines brutes, min. Matières grasses brutes 10%, max. Cellulose brute de 3%) et la levure sèche à unerapport de 2: 1 (p / p). Broyer le mélange à de petites particules avec un mortier et un pilon (passer à travers n ° 50 USA tamis standard). Utilisez la nourriture au sol, qui devrait être de couleur brunâtre, soit immédiatement, soit le stocker dans un récipient étanche à 4 ° C pendant plusieurs semaines. </li><li> Dans un tube de 1,5 ml, mélanger 6 mg de nourriture au sol avec les nanoparticules séchées de la section 3.7 avec un cure-dent. </li><li> Ajouter 30 ul d&#39;une solution à 2% de pré-gel d&#39;agarose fondu au mélange alimentaire nanoparticules; remuer immédiatement et abondamment à l&#39;aide d&#39;une pointe de cure-dent ou pipette. </li><li> Utiliser le gel contenant de la nourriture et des nanoparticules pour alimenter les larves de moustiques immédiatement. En variante, une fois que le gel est complètement solidifié à la température ambiante, le gel stocker à 4 ° C et en utilisant le lendemain, ou à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 5. Nourrir larves de moustiques avec les aliments contenant du chitosane / ARN interférent nanoparticules <ol><li> Alimentation A. gambiae larves de moustiques: <ol><li> Suppression d&#39;un SIngle granulés de gel du tube de 1,5 ml en utilisant un cure-dent et le couper en six tranches égales en utilisant une lame de rasoir propre ou un cure-dent. </li><li> 20 Transfert de troisième stade larvaire dans une boîte de Petri de 500 ml contenant 100 ml d&#39;eau désionisée. </li><li> Nourrir les larves de moustiques en ajoutant une tranche de la pastille de gel (finement haché en petits morceaux) par boîte de Pétri une fois par jour pendant quatre jours. Veillez à respecter les larves se nourrissent de la pastille, qui devrait être considérablement réduite en taille ou complètement absent le lendemain. Après un temps, les moustiques se développeront en fin de quatrième stade larvaire. </li><li> Enregistrez les modifications phénotypiques visibles pendant l&#39;expérience. Examiner les niveaux de transcription et d&#39;autres changements phénotypiques comme indiqué dans l&#39;article 6 à la fin de la période de quatre jours. </li></ol></li><li> Alimentation A. aegypti larves de moustiques: <ol><li> Couper la pastille de gel en tranches égales 6 en utilisant une lame de rasoir propre ou cure-dent. </li><li> Placez 50 ans synchronisé 24 heures après l&#39;éclosion des œufs fipremier stade larvaire dans une boîte de Pétri en ≈40 ml d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Les larves se nourrissent une tranche par boîte de Pétri pendant 4 heures / jour, puis de transférer les larves de retour à l&#39;alimentation des larves régulière de 2: 1 sol flocons de nourriture pour les poissons et la levure sèche pour le reste de la journée. Répéter l&#39;opération tous les jours pendant les quatre stades larvaires. </li><li> Examiner les niveaux de transcription et d&#39;autres changements phénotypiques comme indiqué dans l&#39;article 6 sur les points souhaités de temps de développement. </li></ol></li></ol> 6. Confirmation de Gene Knockdown <ol><li> Transcription relative quantification par qRT-PCR dans A. aegypti et A. larves gambiae. <ol><li> Effectuer et analyser des essais qRT-PCR avec trois répétitions biologiques sur au moins 10 commande groupée vs larves expérimentale comme décrit 11,19,20, ou selon la procédure de laboratoire standard. Les résultats représentatifs sont incluses ci-dessous. </li><li> Pour l&#39;analyse d&#39;une partie notamment le type de tissu / corps (ie., Le cerveau ou antenne), perform qRT-PCR comme décrit dans 6.1.1 dissection suivante pour récupérer le tissu d&#39;intérêt (par exemple, voir Mysore et al. 21). </li></ol></li><li> Confirmation de l&#39;effet de choc par hybridation in situ <ol><li> Synthétiser antisens digoxygénine marqué et le sens ribosondes de contrôle conformément à la pratique de laboratoire standard ou comme décrit 26. </li><li> Exécuter une hybridation in situ par le protocole Haugen et al. 27 pour la confirmation d&#39;effet de choc, comme décrit précédemment dans 11,20 et discuté dans la section des résultats représentatifs ci-dessous. </li></ol></li><li> Confirmation de l&#39;effet de choc par immunohistochimie <ol><li> Si des anticorps contre le produit protéique du gène ciblé sont disponibles, effectuer l&#39;immunohistochimie comme décrit précédemment 28, ce qui facilite l&#39;identification des personnes ayant les plus grands niveaux de knock-down pour l&#39;analyse du phénotype 20 comme illustré dans la representative section des résultats ci-dessous. </li></ol></li></ol>

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<li>Molinaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine+and+chitosan+carriers+for+the+delivery+of+RNA+interference+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+delivery%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors.</a> Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).</li>
<li>Singha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+in+small-interfering+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acid+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Polymers in small-interfering RNA delivery.</a> Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le / interférer méthodologie de nanoparticules d&#39;ARN de chitosane décrit ici a été utilisé pour cibler efficacement les gènes au cours du développement larvaire dans A. gambiae (figures 2, 3) et A. aegypti (figures 4, 5, 6 et aux tableaux 1, 2). Des nanoparticules de chitosan peuvent être préparées avec soit longue ou siRNA ARN double brin, qui ont tous deux été utilisés avec succès dans les moustiques comme en témoignent les résultats représentatifs décrits ici. S...

moustiques vecteurs de l&#39;alimentation sanguine des genres anophèles et Aedine transmettent agents responsables de plusieurs des pires fléaux de l&#39;humanité pathogènes. On estime que 3,4 milliards de personnes sont à risque de contracter le paludisme, qui est responsable de plus d&#39;un demi-million de décès chaque année dans le monde entier. les résultats de la lutte contre le paludisme de l&#39;infection par Plasmodium sp., des parasites qui sont transmis à l&#39;homme par les piqûres de moustiques infectés du genre Anopheles, y compris le principal vecteur africain Anopheles gambiae ( <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> , 2014) 1. Aedes aegypti est le moustique vecteur principal de virus de la dengue, qui provoque de la fièvre de la dengue, une maladie fébrile non spécifique qui est l&#39;arbovirose la plus répandue et importante dans le monde. virus de la dengue est actuellement une menace pour&gt; 2,5 milliards de personnes dans les tropiques, avec une façon fortuite annuelleCE d&#39;environ 50 millions de cas résultant en ~ 24 000 décès par an ( <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> , 2014) 2. Malgré l&#39;impact mondial dévastateur de maladies transmises par les moustiques sur la santé humaine, des moyens efficaces de prévention et de traitement de ces maladies font défaut. lutte contre les moustiques est actuellement la meilleure méthode de prévention de la maladie. Le potentiel de lutte contre les maladies transmises par les arthropodes par la manipulation génétique des insectes vecteurs a été reconnue depuis plus de quatre décennies 3. Souches transgéniques de A. aegypti conçu pour avoir un phénotype spécifique de voler-femme répressible ont récemment fait la possibilité d&#39;utiliser des stratégies de lutte antivectorielle transgéniques une réalité 4-6. Ces progrès ont contesté les chercheurs à identifier les cibles génétiques nouvelles pour la lutte antivectorielle et des moyens supplémentaires de manipuler la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs. Altération de l&#39;expression des gènes ddéveloppement ors, comme ce était le cas chez les moustiques femelles de 4-voler, peut promouvoir l&#39;élucidation des stratégies de lutte antivectorielle nouveaux. Cependant, en grande partie en raison de problèmes techniques, les fonctions de très peu de gènes ont été caractérisées au cours du développement de A. gambiae, A. aegypti, ou d&#39;autres espèces de moustiques. Depuis sa découverte en C. elegans 7, l&#39;ARN interférence (ARNi), qui est conservé chez les animaux, les plantes et les micro-organismes, a été largement utilisé pour des études génétiques fonctionnelles dans une grande variété d&#39;organismes, y compris les insectes 8,9. La voie ARNi est initiée par Dicer, qui clive à long ARN double brin en courts 20-25 siRNA nucléotidiques de long qui fonctionnent comme des ARN interférents séquence-spécifique. gènes de silence siRNA qui sont complémentaires dans l&#39;ordre par la promotion de chiffre d&#39;affaires de la transcription, le clivage et la perturbation de la traduction 9. Longues molécules ARN double brin (typiquement 300-600 pb) ou personnalisés siRNA ciblant un particulièremenr séquence peut être utilisée dans le laboratoire de recherche pour faire taire ne importe quel gène d&#39;intérêt. En gérant lorsque ARN interférent est livré, les chercheurs peuvent contrôler l&#39;heure à laquelle silençage génique initiés. Cet avantage est utile car elle peut être utilisée pour surmonter des défis tels que la létalité de développement ou de stérilité, ce qui peut entraver la production et l&#39;entretien des souches portant des mutations héréditaires, un processus coûteux et de main-d&#39;œuvre qui ne est pas encore disponible dans toutes les espèces d&#39;insectes. Bien que le degré de silençage génique par ARNi peut varier de gène à gène, un tissu à tissu, et un animal à l&#39;ARNi est largement utilisé pour l&#39;analyse fonctionnelle des gènes dans les moustiques et autres insectes 8,9. Trois stratégies d&#39;interférence de livraison d&#39;ARN ont été utilisés dans les moustiques: micro-injection, l&#39;application trempage / topique, et ingestion. Pour une histoire détaillée et une comparaison de l&#39;utilisation de ces trois techniques chez les insectes, se il vous plaît se référer à Yu et al 8. We ont utilisé avec succès la micro-injection 10 comme un moyen de fournir des siRNA pour cibler les gènes du développement chez A. aegypti embryons, larves, pupes et 11-14. Cependant, cette stratégie de prestation de main-d&#39;œuvre exige à la fois une installation de micro-injection et une main habile. En outre, la micro-injection est stressant pour l&#39;organisme, un facteur de confusion, en particulier lorsque phénotypes comportementaux seront évalués. Enfin, la livraison de micro-injection ne peut pas être étendu au domaine de la lutte antivectorielle. Comme alternative, le trempage l&#39;organisme en interférant solution d&#39;ARN est également devenu un moyen populaire d&#39;induire le silençage génique, car il est pratique et nécessite peu d&#39;équipement ou la main-d&#39;œuvre. Le trempage a surtout été appliquée dans la lignée cellulaire d&#39;insectes étudie 8, mais dans une étude récente, knockdown a été atteint en A. larves de aegypti immergé dans une solution de 15 l&#39;ARN double brin, où les animaux semblaient être ingéré. Cependant, les études portant sur l&#39;analyse de plusieurs experimentagroupes de L ou phénotypes, le trempage est assez coûteux. Lopez-Martinez et al. 16 décrit réhydratation entraîné ARNi, une nouvelle approche pour la livraison de l&#39;ARN interférant qui implique la déshydratation dans une solution saline et la réhydratation avec une seule goutte d&#39;eau contenant de l&#39;ARN interférant. Cette approche ne coupe les coûts associés à l&#39;immersion de l&#39;animal entier, mais est plus cher que la micro-injection et peut être limitée dans son application aux espèces qui peuvent tolérer fortes pressions osmotiques. En outre, il est difficile d&#39;imaginer comment l&#39;immersion ou la méthode d&#39;immersion / de réhydratation de déshydratation pourraient être adaptées pour la lutte antivectorielle dans le domaine. Pour ces raisons, pour les études post-embryonnaires, la livraison des ARN interférant avec de la nourriture ingérée est une stratégie alternative viable. Bien que des stratégies fondées sur l&#39;ingestion-ne fonctionnent pas chez toutes les espèces d&#39;insectes, peut-être surtout Drosophila melanogaster, l&#39;administration orale d&#39;ARN interférents mélangé avec de la nourriture a favorisé si géniquelencing dans une variété d&#39;insectes 8,17, y compris A. aegypti adultes 18. Nous avons décrit des nanoparticules de chitosan à médiation par ARNi dans A. gambiae larves 19 et ont appliqué avec succès cette approche pour la réduction de l&#39;expression génique dans A. aegypti larves 20,21. Ici, la méthodologie pour cette procédure ARNi, qui consiste à piéger des ARN interférents par le chitosane de polymère, est détaillée. Chitosan / ARN interférents nanoparticules sont formées par auto-assemblage de polycations avec des ARN interférent par les forces électrostatiques entre les charges positives des groupes amino dans le chitosane et les charges négatives portées par les groupes phosphate sur le squelette de 19 l&#39;ARN interférent. La procédure décrite est compatible avec les molécules d&#39;ARNdb longs (ci-après dénommée ARN double brin) ou double brin siRNA (ci-après dénommé siRNA). Après la synthèse, le chitosane / interférents nanoparticules d&#39;ARN sont mélangés avec de la nourriture des larves et livrés àlarves à l&#39;ingestion. Cette méthodologie est relativement peu coûteux, nécessite peu de matériel et la main-d&#39;œuvre 19, et facilite l&#39;analyse à haut débit de plusieurs phénotypes, incluant l&#39;analyse des comportements 20,21. Cette méthode, qui peut être adaptée pour les études d&#39;inactivation de gène dans d&#39;autres insectes, y compris d&#39;autres vecteurs de maladies et les insectes nuisibles agricoles, pourrait être utilisée pour le silençage génique dans une variété d&#39;autres espèces animales. En outre, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable 22, pourrait être utilisée dans le domaine de lutte contre les moustiques spécifique de l&#39;espèce.

<table><tbody><tr>Pipette <td>Rainin</td><td>PR20</td> <td>de 0,02 ml</td><td>pour la remise en suspension d’ARN interférent</td></tr><tr><td>Pipette Rainin</td><td>PR200</td> de<td>0,2 ml</td><td>pour la remise en suspension d’ARN interférent et la préparation d’ARN/nanoparticules interférents</td></tr><tr><td>Tube gradué de 0,5 ml.</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-120</td><td>pour l’aliquotage de l’ARN interférent en suspension</td></tr><tr><td>1 ml pipette</td><td>Rainin</td><td>PR1000</td><td>pour la remise en suspension de l’ARN interférent et la préparation d’ARN/nanoparticules interférents</td></tr><tr><td>1,5 ml tube gradué.</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-046</td><td>pour la préparation d’ARN/nanoparticules interférentes</td></tr><tr><td>1M Acétate de sodium, pH 4,5</td><td>TEKnova</td><td>S0299</td><td>pour préparer un tampon d’acétate</td></tr><tr><td>de sodium Acide acétique, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade</td><td>BDH</td><td>VWR BDH3092-500MLP</td><td>pour préparer le tampon d’acétate de sodium</td></tr><tr><td>Agarose Genetic Technology Grade</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>800668</td><td>pour enrober d’ARN/nanoparticules interférents préparés</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf AG</td><td>5415D</td><td>pour granuler ARN/nanoparticules interférents</td></tr><tr><td>Chitosane, à partir de carapaces de crevettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646-25G</td><td>à combiner avec de l’ARN interférent pour la préparation d’ARN/nanoparticules interférents</td></tr><tr><td>Levure sèche</td><td>Universal Food Corp</td><td>NA</td><td>pour préparer de la nourriture pour larves de moustiques avec de l’ARN interférent/ nanoparticules</td></tr><tr><td>Outil E-RNAi</td><td>Centre allemand de recherche sur le cancer</td><td>NA</td><td>pour la conception de l’ARNdb ; nourriture pour poissons rouges http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td></tr> <tr><td></td><td>Wardley</td><td>Goldfish FLAKE FOOD</td><td>pour préparer de la nourriture pour larves de moustiques avec des ARN/nanoparticules interférents</td></tr><tr><td>Bain-marie chauffé Thermo</td><td>Scientific</td><td>51221048</td><td>pour chauffer les ARN/nanoparticules interférents à 55oC</td></tr><tr><td>Glace</td><td>non applicable</td>, <td>ne s’applique pas à la</td><td>décongélation de l’ARN interférent et à la préparation d’ARN/nanoparticules</td></tr><tr> interférents<td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Seau à glace</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-591-44</td><td>pour le stockage de la glace utilisée pendant la procédure poudre de</td></tr><tr><td>foie</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>900396</td><td>pour nourrir les larves de moustiques après un traitement ARN/nanoparticules interférents</td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td>Une variété de fournisseurs</td><td>non applicables</td><td>pour préparer une solution d’agarose à 2 %</td></tr><tr><td>pétride (100 x 15 mm)</td><td>Fischer Scientific</td><td>875713</td><td>chambre d’alimentation en ARN/nanoparticules interférents pour les larves</td></tr><tr><td>PH-mètre</td><td>Mettler Toledo</td><td>S220</td><td>pour la préparation de tampons</td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-640</td><td>pour diviser la pastille d’ARN/nanoparticules interférente pour l’alimentation</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Thermo Scientific/Dharmacon</td><td>custom</td><td>pour la préparation de siRNA/nanoparticules</td></tr><tr><td>Sodium Sulfate, anhydre (Na2SO4)</td><td>BDH/distribué par VWR</td><td>VWR BDH0302-500G</td><td>pour préparer une solution de sulfate de sodium de 50 mM dans laquelle l’ARN interférent sera remise en suspension</td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td>VWR</td><td>61066-046</td><td>pour mesurer la température du bain-marie</td></tr><tr><td>Pics</td><td>à dents VWR</td><td>470146-908</td><td>pour agiter pendant la préparation et la coupe des aliments ARN/nanoparticules interférentes Gel de préparation et de coupe des aliments</td></tr><tr><td>Congélateur ultra-bas</td><td>Une variété de fournisseurs</td><td>non applicables</td><td>pour le stockage des aliquotes d’ARN interférents et des ARN/nanoparticules interférents à -80oC</td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-216-108</td><td>pour la préparation de chitosane/ARN interférent</td></tr><tr><td>Poids papier</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC9798735</td><td>pour diviser l’ARN/nanoparticules interférents pour l’alimentation</td></tr></tbody></table>

chitosane / arn interférant nanoparticules mediated gene silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

moustiques vecteurs infligent des souffrances plus humain que ne importe quel autre organisme - et tuent plus d&#39;un million de personnes chaque année. Les projets sur le génome de moustiques ont facilité la recherche dans de nouvelles facettes de la biologie des moustiques, y compris les études génétiques fonctionnels dans le principal vecteur africaine du paludisme Anopheles gambiae et de la dengue et le vecteur de la fièvre jaune Aedes aegypti. ARN de (RNAi-) le silençage génique médiation a été utilisée pour cibler des gènes d&#39;intérêt dans ces deux espèces de moustiques vecteurs de maladies. Ici, nous décrivons une procédure pour la préparation de chitosane / ARN interférant nanoparticules qui sont combinés avec de la nourriture et ingérés par les larves. Ceci, à haut débit techniquement simple et relativement peu coûteux méthodologie, qui est compatible avec de longs ARN double brin (ARNdb) ou de petits ARN interférents (siARN) de molécules, a été utilisé pour le knock-down réussi d&#39;un certain nombre de différents gènes dans A. gambiae et A. aegyptilarves. Après tétées larvaires, démontable, qui est vérifiée par qRT-PCR ou hybridation in situ, peuvent persister au moins jusqu&#39;à la fin du stade de pupe. Cette méthode peut se appliquer à une grande variété de moustique et d&#39;autres espèces d&#39;insectes, y compris les parasites agricoles, ainsi que d&#39;autres organismes non-modèles. En plus de son utilité dans le laboratoire de recherche, à l&#39;avenir, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable, susceptibles d&#39;être utilisés dans le domaine.

<html> A. gambiae: Des nanoparticules de chitosan / ARNdb sont formées grâce à l&#39;interaction électrostatique entre les groupes amino du chitosane et les groupements phosphate de l&#39;ARN double brin. L&#39;efficacité de l&#39;incorporation dans l&#39;ARN double brin nanoparticules est généralement supérieure à 90% telle que mesurée par l&#39;appauvrissement de l&#39;ARN double brin à partir de la solution. Atomiques images de microscopie de force montrent que le...

Nous décrivons ici une procédure pour inhiber la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs de la maladie grâce à l&#39;utilisation de chitosane / interférer nanoparticules d&#39;ARN qui sont ingérés par les larves.

Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

L'objectif général de cette procédure est de concevoir et d'utiliser des nanoparticules d'ARN interférent tussin pour des études d'inhibition génique chez les larves de moustiques. Cette étape est réalisée en préparant d'abord des nanoparticules d'ARN interférent tussin par l'association de chitine et d'ARN interférent, suivie d'un chauffage, d'un vortexage et d'une centrifugation. L'objectif suivant consiste à mélanger les nanoparticules avec la nourriture des larves et des aros afin de préparer des pastilles gélatineuses contenant la nourriture et les nanoparticules.La nourriture sous forme de nanoparticules est administrée aux larves de moustique, et l'alimentation des larves sur le comprimé est observée, suivie ultérieurement de la vérification de l'inhibition génique par réaction de polymérase en chaîne en temps réel quantitative. Ou dans des tests d'hybridation deux-hybride. Les phénotypes liés à la perte de fonction peuvent être examinés.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les moustiques vecteurs. Par exemple, nous l'avons utilisée pour étudier les fonctions des gènes durant le développement du système olfactif, du cerveau, de l'intestin moyen et d'autres tissus d'importance vectorielle. Les principaux avantages de cette technique sont sa haute capacité, son coût relativement faible et son moindre stress pour l'organisme par rapport à l'administration d'ARN interférents par microinjection, qui nécessite un niveau de compétence plus élevé et ne peut pas être mise en œuvre sur le terrain.Avec la boursière postdoctorale Ava Maur, la technicienne Ping Lee démontrera la procédure. Pour commencer, dissoudre la tussin dans du tampon d'acétate de sodium 0,1 molaire afin d'obtenir une solution de travail à 0,02 %. Conserver la solution à température ambiante avant utilisation. Ensuite, dissoudre l'ARN double brin ou l'ARN interférent petit, tous deux désignés ci-après par ARN interférent, dans 50 microlitres d'eau déionisée.Préparez une solution de 100 microlitres contenant 32 microgrammes d'acide nucléique par 100 microlitres de sulfate de sodium 50 millimolaire. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de tussin à la solution d'ARN interférent. Chauffez le mélange dans un bain-marie à 55 degrés Celsius pendant une minute.Préparez un témoin en ajoutant 100 microlitres de sulfate de sodium 50 millimolaire à 100 microlitres de solution de Tustin et suivez la même procédure après chauffage. Mélangez immédiatement les solutions pendant 30 secondes par vortexage à haute vitesse à température ambiante afin de faciliter la formation de nanoparticules. Centrifugez le mélange à 13 000 ×g pendant 10 minutes à température ambiante, après quoi un culot doit être visible. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et laissez sécher le culot à l’air pendant environ 10 minutes à température ambiante avant utilisation.Pour préparer la nourriture pour moustiques à l'aide de la photométrie par spectres UV, mesurez la concentration d'ARN interférent dans le SNAT en utilisant le surnageant S du témoin comme blanc afin de calculer la quantité totale d'ARN interférent restant dans le SNAT. Utilisez la différence entre les quantités initiales d'ARN interférent et les quantités restantes dans les surnageants pour calculer le pourcentage d'ARN interférent piégé dans les nanoparticules. Cette efficacité de chargement est généralement supérieure à 90 %. Répétez la même procédure si davantage de nanoparticules sont nécessaires.Utilisez immédiatement les nanoparticules sèches, car l'impact du stockage au froid des particules avant utilisation n'a pas été évalué. Pour formuler la nourriture pour moustiques, préparez d'abord une solution d'agarose à 2 % dans de l'eau déionisée et faites fondre l'agarose. Conservez la solution d'agarose fondue dans un bain-marie à 55 degrés Celsius avant utilisation.Mélangez ensuite des flocons pour nourrir les poissons et de la levure sèche dans un rapport de un à deux. Réduisez le mélange en fines particules à l’aide d’un mortier et d’un pilon. La nourriture broyée est de couleur brunâtre.Dans un tube de 1,5 millilitre, mélangez six milligrammes d’aliment broyé avec les nanoparticules sèches à l’aide d’un cure-dent. Ajoutez ensuite 30 microlitres de solution d’agarose fondue à 2 % au mélange d’aliment et de nanoparticules. Mélangez immédiatement et soigneusement à l’aide d’un cure-dent ou de la pointe d’une pipette.Le gel contenant la nourriture et les nanoparticules est désormais prêt pour nourrir les larves de moustiques *Anopheles gambiae*. Prélevez une pastille de gel unique à l’aide d’un cure-dent depuis le tube de 1,5 millilitre et découpez-la en quatre tranches égales à l’aide d’un rasoir propre ou d’un cure-dent. Transférez ensuite 23 larves étoilées dans une boîte de Pétri contenant 100 millilitres d’eau déionisée.Nourrissez les larves de moustiques en ajoutant une tranche du comprimé gélatineux, finement coupée en petits morceaux par boîte de Pétri. Pendant quatre jours, observez une fois par jour les larves en train de se nourrir du comprimé, qui devrait être considérablement réduit en taille ou complètement absent le lendemain.Les moustiques atteindront le stade de larves de fin de quatrième stade. Notez tous les changements phénotypiques visibles au cours de l'expérience. Examinez les niveaux d'expression transcriptionnelle et les autres modifications phénotypiques, comme indiqué dans le protocole écrit, à la fin de la période de quatre jours destinée à nourrir les larves de moustiques GTI.Divisez le culot de gel en quatre tranches égales à l’aide d’une lame de rasoir propre ou d’un cure-dent, comme précédemment. Ensuite, placez 50 h synchronisées 24 heures après l’éclosion des œufs. D’abord, les larves en étoile dans une boîte de Pétri.Dans environ 40 millilitres d'eau déionisée. Nourrissez les larves avec une tranche par boîte de Pétri pendant quatre heures par jour. Là encore, la tranche doit être finement hachée en morceaux plus petits.Ensuite, transférez les larves au régime alimentaire larvaire habituel composé de deux parts de flocons de nourriture pour poissons broyés pour une part de levure sèche, pour le reste de la journée. Répétez la procédure quotidiennement tout au long des quatre stades larvaires. Analysez les niveaux d'expression des transcrits et les autres modifications phénotypiques comme indiqué dans le protocole textuel, au moment du développement souhaité.Les points présentés ici correspondent à des larves de quatrième stade d'anis gambi nourries avec un contrôle et ayant un aspect normal, comme attendu. Toutefois, la matrice para-atrophique est perturbée chez les larves nourries avec un ARN interférent ciblant la chitine synthase 1, comme en témoigne le bleu de dextrine, qui a fui dans la clé gastrique. L'expression normale d'Orco, le co-récepteur obligatoire des odorants, est observée dans les antennes des larves de quatrième stade d'aegypti nourries avec le contrôle.En revanche, l'expression d'Orco est absente chez les animaux nourris avec des ARN interférents ciblant le gène single-minded, comparés aux animaux témoins nourris normalement. Les animaux présentant une inhibition du gène single-minded ont un comportement altéré de suivi des odeurs. Après avoir visionné cette vidéo, on devrait bien comprendre comment utiliser des nanoparticules d'ARN interférents pour inhiber l'expression des gènes durant le développement des moustiques vecteurs.Cette technique, qui pourrait potentiellement être étendue à l'étude de moustiques adultes ou d'autres organismes modèles émergents, a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer les fonctions des gènes identifiés dans les projets de séquençage du génome de moustiques, vecteurs de maladies.

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

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Inverse des approches génétiques se sont avérées extrêmement utiles pour déterminer quels gènes de résistance sous-tendent à des agents pathogènes vecteurs de moustiques. Ce protocole vidéo illustre une méthode utilisée par le laboratoire Dimopoulos à injecter dans les ARNdb Anopheles gambiae moustiques, qui abritent le parasite du paludisme. La technique de manipulation de l'installation d'injection et injection ARNdb dans le thorax est illustré.

Protocole pour des essais de l&#39;ARNi dans les moustiques adultes (A. gambiae)

Dans ce protocole, nous combinons silencing RNAi-médiée avec un...

Inactivation génique médiée par ARNi et<em&gt; In Vivo</emEssai diurèse&gt; Femmes adultes<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Les moustiques

interférence ARN (ARNi) est un outil extrêmement précieux pour découvrir la fonction des gènes. Cependant, la capacité de cibler des gènes à l’aide de l’ARNi au cours des stades préadultes est limitée chez le principal vecteur du paludisme humain, Anopheles gambiae. Nous décrivons un protocole ARNi pour réduire la fonction des gènes par injection directe pendant le développement de la nymphe.

ARNi Trigger Livraison en<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; pupes

Nous rapportons en utilisant une artificiel intronic petit RNA expression stratégie à élaborer un recombinant non défectueux densovirus (AaeDV) Aedes aegypti in vivo système de livraison. Une procédure détaillée pour la construction, emballage et l’analyse quantitative des vecteurs rAaeDV aussi bien en ce qui concerne l’infection larvaire est décrite.

Utilisation d’un moustique Recombinant Densovirus comme un vecteur de livraison de gène pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les larves de moustiques

Ce manuscrit montre l’épuisement d’expression de gène dans l’intestin moyen de la blatte germanique par ingestion orale de l’ARN double brin encapsulée dans des liposomes.

Utilisation pratique de l’interférence d’ARN : l’administration orale d’ARN Double brin dans Liposome transporteurs pour les blattes

Cet article explique les nouvelles techniques mises au point pour l’administration orale de l’ARN double brin (dsRNA) à travers les tissus vasculaires des plantes pour l’interférence ARN (ARNi) en sève nourrir les insectes.

Méthodes de prestation orale ARN double-brin d’induire l’interférence d’ARN dans le phloème et insectes hémiptères plante-sap-alimentation

Ce protocole décrit une méthode de microinjection que nous avons normalisé et utilisé depuis plusieurs années à livrer des quantités d’acides nucléiques spécifiques directement à l’hémolymphe des moustiques et des mouches domestiques. Ce protocole se traduit par la mortalité injection minime et permet des mesures de dose en corrélation de la fécondité.

DsRNA reproductible Microinjection et bioessais sur la ponte chez les moustiques et les mouches domestiques

L’administration orale d’ARNd produit par des bactéries, une méthode d’administration de l’interférence ARN (ARNi) couramment utilisée chez Caenorhabditis elegans, a été appliquée avec succès ici aux moustiques adultes. Notre méthode permet des études robustes de génétique inverse et des études de vecteurs bloquant la transmission sans l’utilisation de l’injection.

Administration efficace d’interférence ARN orale (ARNi) aux moustiques anophèles gambiens adultes

Voici un protocole pour l’administration de nanoparticules de chitosane/ARNdb dans les larves de ver à soie Bombyx mori afin d’induire le silençage génique par ingestion.

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Découvrez le silençage génique par nanoparticules de chitosane/ARNi chez les larves de moustiques vecteurs. Cette méthode permet d'étudier la fonction des gènes impliqués dans la transmission des maladies.

Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques

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