Une puce microfluidique pour ICPMS Présentation échantillon

L’objectif global de cette procédure est de générer et d’analyser quantitativement la composition élémentaire de microgouttelettes monodispersées contenant des cellules uniques ou des solutions aqueuses par I-C-P-M-S. Ceci est accompli en fabriquant d’abord une puce microfluidique à l’aide du moulage de réplique avec PDMS. La deuxième étape consiste à connecter les pousse-seringues à la puce microfluidique.

Les pompes alimenteront l’échantillon aqueux et la PFH en phase vecteur hautement volatile et admissible ou organique. Lorsque le pousse-seringue est mis en marche, la puce microfluidique génère des gouttelettes monodispersées de la solution aqueuse de l’échantillon ou d’une suspension cellulaire par flux, en se concentrant avec le PFH et en éjectant ces gouttelettes avec du PFH supplémentaire de la puce sous forme de jet de liquide. La dernière étape consiste à insérer la puce dans un ensemble de transport composé d’une cartouche chauffante qui évapore les gouttelettes et d’une membrane de sauvegarde qui élimine les solvants avant l’ionisation et la détection du contenu des gouttelettes par un I-C-P-M-S.

En fin de compte, les signaux enregistrés et une mesure d’étalonnage avec une solution étalon sont utilisés pour déterminer la composition élémentaire de la solution d’échantillon ou des cellules en suspension. Les principaux avantages de notre technique microfluidique par rapport aux méthodes existantes sont la taille des gouttelettes réglable, la faible consommation d’échantillons et le faible risque de nologging lors du travail avec des suspensions de cellules ou des solutions salines concentrées. De plus, la puce microfluidique jetable à faible coût évite le temps de nettoyage et élimine la contamination croisée.

La démonstration de la procédure sera assurée par tous les vins, doctorant du Laboratoire du Professeur GTA et Pascal Fabrica, doctorant de mon laboratoire. Pour commencer le processus de MICROFABRICATION, mesurez 40 grammes de PDMS et quatre grammes d’agent de durcissement PDMS dans un grand plat en plastique. Mélangez uniformément les deux parties à l’aide d’une spatule et placez le plat dans un dessiccation sous vide pendant 20 à 30 minutes pour dégazer toutes les bulles du mélange.

Pendant le dégazage. Placez un moule de coulée sur une plaquette de silicium microstructurée et utilisez la structure de guidage autour du motif pour l’enclencher en place sur une plaquette de silicium plate. Placez librement un autre moule de coulée sur le dessus.

Versez environ trois à quatre grammes du mélange Degas PDMS sur les deux moules de coulée. Transférez les deux plaquettes de silicium sur une plaque chauffante. Faites durcir le PDMS à 150 degrés Celsius pendant six minutes, puis laissez-le refroidir.

Les structures PDMS solidifiées sur le banc à température ambiante avec une spatule métallique. Séparez soigneusement les blocs PDMS solides des moules. Protégez les surfaces de collage des deux blocs contre la contamination par les particules et les empreintes digitales.

En appliquant une couche de scotch transparent, les pièces PDMS peuvent maintenant être manipulées et coupées à la bonne taille avec des ciseaux. Après la coupe, retirez le ruban du bloc PDMS microstructuré et utilisez une perforatrice de biopsie pour créer les orifices d’entrée microfluidique. Cela termine le processus de fabrication de la moitié microstructurée du dispositif, et il est maintenant prêt à être collé et assemblé avec son homologue plat.

Pour préparer les services de collage PDMS à PDMS, commencez par appliquer une couche d’agent de durcissement PDMS sur une plaquette de silicium vierge à 6 000 tr/min pendant 30 secondes pendant que l’agent de durcissement est encore humide, mettez l’interface de liaison du bloc PDMS microstructuré en contact avec la plaquette et appliquez une pression douce sur le dessus du PDMS pour former un joint sans couture sans bulles. Dans une étape séparée, retirez le ruban de protection de l’homologue plat. Ensuite, séparez lentement le PDMS microstructuré de la plaquette de silicium.

Alignez soigneusement les deux pièces PDMS et mettez les deux interfaces de liaison en contact. Pressez doucement les deux blocs pour éliminer toutes les bulles interfaciales et durcissez la puce PDMS assemblée pendant 24 heures À température ambiante à l’aide d’un couteau utilitaire et d’un dispositif d’alignement, faites une coupe le long de la ligne indicatrice orthogonale à la buse de sortie. Inspectez la puce au microscope pour détecter les défauts de coupe et la contamination par les particules adjacentes à la buse de sortie exposée.

Après évaluation de la qualité de fabrication, les surfaces internes du microcanal PDMS sont prêtes à être siloisées. Dans une hotte chimique, connectez une extrémité d’une bouteille de loup à une source d’azote sec et connectez l’autre extrémité de la bouteille aux entrées de la puce PDMS. À l’aide de plusieurs tubes reliés à un collecteur central, pipetez 50 microlitres de seline dans la bouteille loup et fermez le couvercle supérieur.

Allumez le flux porteur d’azote et rincez les micro-canaux avec une solution saline contenant de la vapeur pendant 20 minutes à un débit d’environ un millilitre par seconde. Enfin, débranchez les tubes d’entrée de la bouteille de loup. Les puces PDMS revêtues sont prêtes pour les expériences de spectrométrie de masse pour les mesures de spectrométrie de masse à cellule unique.

Tout d’abord, diluez l’échantillon d’entrée avec un tampon approprié de sorte que la concentration cellulaire effective soit inférieure à 10 millions de cellules par millilitre. Chargez deux seringues de cinq millilitres avec le PFH et chargez l’échantillon d’entrée dans une seringue séparée d’un millilitre. Retirez toutes les bulles piégées dans les seringues et le tube et chargez les deux seringues sur un pousse-seringue.

Assurez-vous que le tube de transport est correctement aligné et que tous les tubes de gaz sont connectés. Ensuite, connectez les tubes de la seringue aux orifices d’entrée de la puce PDMS et activez le pousse-seringue pendant trois à cinq minutes. Au cours de ce processus de stabilisation du débit, retirez tout excès de liquide de l’orifice de sortie à l’aide d’un mouchoir.

Si le fluide sort, la puce ne forme pas un jet droit. Après cinq minutes, essayez d’essuyer toute obstruction potentielle à la sortie des puces avec un mouchoir propre. En cas d’échec, jetez la puce existante et remplacez la connexion par une nouvelle puce.

Retirez le bouchon de l’adaptateur de pulvérisateur cyclonique et insérez soigneusement la puce PDMS stabilisée dans l’adaptateur. Modifiez le débit selon les paramètres recommandés et restabilisez le débit pendant deux à cinq minutes. Dans le même temps, ajustez les débits pour tous les gaz jusqu’à ce que l’intensité maximale du signal de l’analyte d’intérêt soit atteinte.

Réglez également la puissance du plasma et la tension de la lentille de focalisation sur le spectromètre de masse pour améliorer encore l’intensité du signal lors de l’optimisation du signal. Réglez le spectromètre de masse sur un temps de séjour de 10 millisecondes et commencez l’acquisition des données. Après les mesures, transférez les données brutes vers un programme d’analyse de données.

Dans une routine d’analyse de données classique, toutes les mesures sont d’abord séparées dans des bacs de données, chaque bac représentant le nombre de comptages par 10 millisecondes de temps de séjour, puis un graphique d’histogramme est généré pour tous les bacs et ajusté avec la fonction de distribution gaussienne. La moyenne et l’étalement des ajustements individuels représentent à la fois l’intensité moyenne du signal et l’écart-type à un rapport masse/charge particulier. Pour commencer le processus d’étalonnage, mesurez d’abord une solution étalon au même débit que votre échantillon.

À l’aide de la puce PDMS pour la génération de gouttelettes, installez deux seringues de cinq millilitres pour l’HFP et une seringue d’un millilitre pour la solution standard. Ensuite, à l’aide d’une boîte de Pétri comme porte-échantillon de microscope, placez la puce PDMS dans la boîte de Pétri et faites la mise au point sous un faible grossissement en reflétant les étapes précédentes du protocole. Stabilisez la génération de gouttelettes dans le microcanal PDMS pendant trois à cinq minutes avec une caméra haute vitesse.

Commencez à enregistrer des images de gouttelettes aqueuses sur la puce à la jonction secondaire pour obtenir le diamètre moyen des gouttelettes à partir des enregistrements. Utilisez un logiciel d’analyse d’images avec une suite dédiée de morphing de gouttelettes, d’optométrie et de symétrie de vitesse. En supposant que chaque gouttelette puisse être modélisée comme un objet sphérique, le volume moyen des gouttelettes peut être estimé en utilisant le diamètre moyen des gouttelettes obtenu par le logiciel.

Ensuite, divisez la concentration connue d’analyte de l’échantillon par le volume moyen des gouttelettes pour obtenir la masse d’analyte contenue dans une gouttelette. Convertissez ensuite la masse résultante en nombre d’atomes. Enfin, calculez l’efficacité globale de détection en divisant le nombre d’ions mesurés par gouttelette par le résultat précédent.

Cette efficacité de détection peut maintenant être utilisée comme grandeur d’étalonnage pour déterminer le nombre d’atomes dans un échantillon inconnu. À l’aide d’un générateur de gouttelettes microfluidique, des cellules individuelles peuvent être encapsulées dans des gouttelettes aqueuses monodispersées d’un diamètre moyen inférieur à 50 microns, et analysées par I-C-P-M-S. La gaine organique PFH entourant la gouttelette aqueuse peut facilement être retirée avant que l’échantillon n’atteigne le détecteur I-C-P-M-S.

Lors de la mesure de solutions, la mono-dispersion élevée des gouttelettes peut être observée comme de faibles variances entre les groupes de signaux provenant d’un seul double ou d’un triple comptage de gouttelettes dans un temps de séjour donné. Après un étalonnage approprié, la teneur en fer d’un ensemble de globules rouges bovins, chacun en suspension dans des gouttelettes uniques, peut être déterminée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation et de l’utilisation de ces puces microfluidiques pour l’analyse élémentaire quantitative de très petits volumes d’échantillons ou de particules et de cellules uniques.

La fabrication de ces puces nécessite moins de 15 minutes, du temps de manipulation par puce si elle est correctement exécutée. De plus, les puces faciles à modifier permettent l’intégration d’autres modules microfluidiques pour un prétraitement avancé des échantillons et l’introduction simultanée d’échantillons et d’étalons pour améliorer l’efficacité et le débit d’échantillons.