Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

L’objectif global de cette procédure est de générer des organoïdes transduits de manière stable à partir de l’épithélium intestinal primaire de souris pour l’analyse en aval des organoïdes intestinaux. Ceci est accompli en transectant d’abord les lymphocytes T HEC 2 93 avec des vecteurs d’emballage lentiviral et un plasmide lentiviral, codant pour le gène d’intérêt pour produire des particules lentivirales à titre élevé. La deuxième étape consiste à prétraiter des organoïdes intestinaux de souris en culture avec un certain nombre de facteurs de croissance pour obtenir des cryptes kystiques hyper prolifératives.

Ensuite, transduisez les organoïdes avec le lentivirus à titre élevé et incubez les organoïdes transduits dans matrigel. La dernière étape consiste à intégrer des organoïdes transduits adultes dans de la paraffine pour l’analyse immunohistochimique en aval. En fin de compte, la transduction organoïde lentivirale est utilisée pour générer des altérations génétiques dans un modèle in vitro de l’épithélium intestinal fiable, reproductible et rapide.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les lignées cellulaires cancéreuses est que les organoïdes sont une hiérarchie de cellules souches déplacées non mutées. Dans la polarisation cellulaire, il peut se différencier en tous les différents types de cellules de l’épithélium de l’intestin grêle. De plus, les organoïdes transduits peuvent être utilisés pour étudier des éléments génétiques spécifiques, l’emportant ainsi sur l’utilisation de souris transgéniques et sur les aspects du coût et de la rapidité.

La production de particules lentivirales est un protocole de cinq jours qui commence par la division des cellules T HEC 2 93 à 60 à 80 % de fluidité en carbone dans un flacon de 162 centimètres carrés dans un milieu de culture cellulaire. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius le lendemain. Préparez la solution de transfection de l’ADN et la solution de transfection de polyéthylèneamine ou de PEI comme décrit dans le texte du protocole.

Ajoutez la solution de transfection d’ADN au vortex de solution de l’Île-du-Prince-Édouard ou inversez un certain nombre de fois et incubez pendant cinq minutes. À température ambiante. Versez deux millilitres de la solution DNA TRANSFECTION plus PEI sur les cellules T HEC 2 93 et incubez pendant quatre heures à 37 degrés Celsius après quatre heures.

Rafraîchissez le milieu de culture. Pour éliminer l’IPE, incubez les cellules pendant deux jours à 37 degrés Celsius le quatrième jour, recueillez le surnageant dans un tube de 50 millilitres. Ajouter un nouveau milieu de culture dans les cellules et remettre le ballon dans l’incubateur, centrifuger le surnageant recueilli à 500 G pendant cinq minutes.

Pour éliminer les cellules mortes, utilisez une grande seringue de 60 millilitres pour pousser le SUPERNAT à travers un filtre de 0,45 micromètre. Conservez le supernat filtré pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain. Prélevez la centrifugeuse et filtrez le deuxième lot de surnageant comme indiqué pour le premier lot.

Regrouper les deux lots de surnageant dans des tubes à ultra-centrifuger. Centrifugeuse à 50 000 GS pendant 90 minutes. Lorsque la centrifugation est terminée, retirez très soigneusement les capsules contenant les tubes d’ultra-centrifugeuse et placez-les dans une hotte à flux laminaire.

Ouvrez la capsule contenant le tube ultra-centrifuge et décantez soigneusement le fluide avec la pastille sur la face supérieure du tube. Il est important de se rappeler de quel côté du tube l’appel se serait formé, car les granules virales peuvent être difficiles à visualiser. Ensuite, à l’aide d’une micro pipette, prélevez le dernier morceau de fluide en prenant soin de ne pas agiter la pastille brune opaque qui est visible sur le côté du fond du tube de l’ultracentrifugeuse.

Remettre en suspension cette pastille dans 500 microlitres de milieu de culture organoïde complété par des inhibiteurs de nicotinamide kinase et une poly résistance cérébrale. La suspension dans ce milieu est importante car le virus à titre élevé sera utilisé directement pour la transduction des organoïdes deux jours avant la transduction. Divisez un puits complet de 0,95 centimètre carré d’organoïdes en un nouveau puits d’une plaque de 48 puits.

Suivant un protocole précédemment publié. Visez à obtenir environ 50 petits organoïdes en culture d’organoïdes. Milieu complété par un inhibiteur de la glycogène synthase kinase et du nicotinamide.

Pour obtenir des cryptes kystiques hyper prolifératives. Incuber les organoïdes pendant deux jours le jour de la récolte des organoïdes à l’aide d’une micro pipette P 1000. Pipetez le gel de matra et le milieu de haut en bas, perturbant ainsi le mélange.

Placez le mélange dans un tube de 15 millilitres. Perturbez davantage le mélange à l’aide d’une pipette PEs dans laquelle l’ouverture distale a été diminuée en faisant fondre les organoïdes en les centrifugeant à 100 Gs pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant à 500 microlitres de préchauffage d’un x trypsine et remettez les organoïdes en suspension pendant trois minutes.

Dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, inactivez la trypsine en ajoutant 3,5 millilitres de centrifugeuse de milieu de culture de lignée cellulaire pendant cinq minutes. À 500 Gs.Retirez le super natan pour laisser le granulé dans environ 20 microlitres de milieu. Transférez les organoïdes de cette dernière petite quantité de milieu dans un puits.

Sur une plaque de 48 puits. Ajouter le lentivirus à titre élevé préalablement préparé dans un milieu de transduction aux organoïdes et remettre en suspension. Incuber le mélange de virus organoïdes pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture pour permettre la transduction après une heure, ajouter un millilitre de culture organoïde, milieu au mélange de virus organoïdes, remettre en suspension et transférer le mélange dans une centrifugeuse à tube de micro-centrifugeuse à 850 GS pendant cinq minutes.

Pour granuler les organoïdes, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension. Dans 20 microlitres de gel matra glacé, mettez la gouttelette au milieu d’un puits. Dans une plaque à 48 puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Pour que la gouttelette se solidifie au bout de 15 minutes. Ajouter soigneusement 250 microlitres de culture d’organoïdes. Milieu complété par des inhibiteurs de nicotinamide et de kinase.

Préchauffez un bloc d’aluminium dans un incubateur à 70 degrés Celsius pour conserver le liquide de paraffine. Retirez le milieu d’un seul puits avec des organoïdes complètement développés, en laissant les organoïdes incorporés intacts, et ajoutez un millilitre d’aldéhyde paraforme à 4 % dans PBS directement dans le puits. Remplacez le paraforme aldéhyde par un millilitre de PBS.

Remettre en suspension les organoïdes fixes dans le PBS et les transférer dans un flacon en verre. Laissez les organoïdes couler au fond pendant une minute. Ensuite, pipetez le PBS et remplacez-le par de l’éthanol à 70 % dans lequel quelques gouttelettes de solution d’eoin sont dissoutes.

Pour permettre la visualisation des organoïdes tout au long du processus d’enrobage, laissez les organoïdes dans de l’éthanol à 70 % à température ambiante pendant 30 minutes. Retirez l’éthanol à 70 % en le pipetant soigneusement. Les organoïdes peuvent être visualisés à l’œil nu en raison de la couleur rosée de l’éoin.

Remplacez la solution d’enrobage par de l’éthanol à 96 % et laissez-la à température ambiante pendant 30 minutes de cette manière. Par la suite, passez les organoïdes à travers 70 % d’éthanol, 90 % d’éthanol, 96 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, du xylène et du xylène. Décantez le dernier lavage au xylène et versez la paraffine dans le flacon en verre.

Mettez immédiatement le flacon dans le bloc d’aluminium préchauffé à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, remplacez la paraffine par de la parofmine neuve et propre à l’aide d’un préchauffage, d’un PE ou d’une pipette. Versez la paraffine et utilisez un parasite préchauffé ou une pipette avec une grande ouverture pour pipeter les organoïdes dans le moule en bloc de paraffine en une couche de paraffine liquide.

Réchauffez une aiguille de dissection avec un bec Bunsen et manipulez tous les organoïdes autant que possible vers le centre du moule en bloc de paraffine. Lorsque la localisation des organoïdes dans le moule est satisfaisante, refroidissez légèrement le moule pour solidifier la couche de paraffine. Terminez le bloc en versant plus de paraffine sur le dessus et ajoutez une cassette d’enrobage histologique standard.

Dans ce protocole, les organoïdes de l’épithélium intestinal ont été transduits avec des lentivirus. Les organoïdes normaux se développent comme des structures villeuses de crypte K avec un certain nombre de cryptes qui sortent d’un domaine de villosités partagé. Lors du traitement de ces organoïdes avec l’inhibiteur de GSK trois B, CHIR 9 9 0 21, la prolifération augmente et les cryptes deviennent kystiques après la transduction des organoïdes.

En utilisant la surexpression lentivirale de l’EGFP, les organoïdes expriment des étapes d’amélioration de la transduction de l’EGFP fluorescent qui peuvent être effectuées lorsque l’efficacité de la transduction est faible, comme l’inoculation ou l’incubation virale prolongée ne sont pas nécessaires, car ces étapes n’augmenteront pas l’efficacité déjà élevée. Par la suite, ces organoïdes sont traités pour les techniques d’ARN et l’immunohistochimie. Cette image représentative est une coupe d’un organoïde intestinal de souris, coloré pour BRDU après incubation avec BRDU pendant une heure avant la fixation.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transduire des organoïdes de l’épithélium intestinal primaire à l’aide de particules lentivirales ou rétrovirales.