Name: Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Apprenez la transduction lentivirale d'organoides intestinaux primaires pour l'ingénierie génétique et la biologie cellulaire. Cette méthode permet d'introduire des modifications génétiques stables et d'analyser l'expression génique.

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J. Heijmans est soutenu par une allocation de la Fondation néerlandaise contre le cancer (KFW). G.R. VAN DEN Brink est soutenu par un financement du Conseil européen de la recherche dans le cadre du septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7/2007-2013)/accord de subvention du Conseil européen de la recherche numéro 241344 et par une subvention VIDI de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (GvdB).

1. Préparation de Polyéthylènimine (PEI) comme réactif de transfection <ol><li> Dissoudre environ 150 mg de PEI dans 100 ml d&#39;H 2 O. </li><li> Réglez solution à pH 7,4 par addition de HCl jusqu&#39;au solution devient limpide et remuer jusqu&#39;à dissolution complète. Cela peut prendre entre 10 et 60 min et ajouter de l&#39;eau à une concentration de 1 mg / ml final. </li><li> Lorsque claire, filtrer la solution à travers le filtre PEI 0,22 um stérile et stocker dans un congélateur à -80 ° C en aliquots de 5 ml. </li></ol> 2. Production de Particules Lentivirales Jour 1: <ol><li> Des cellules HEK293T Split à 60% -80% de confluence dans 162 cm 2 fiole ou une grande boîte de Pétri dans un milieu de culture de lignée cellulaire (DMEM supplémenté avec 10% de FCS, 1% de pénicilline / streptomycine et supplément de glutamine 2 mM). </li></ol> Jour 2: <ol start="2"><li> Préparer la solution de transfection d&#39;ADN contenant 45 pg d&#39;ADN de plasmide total, additionnerles vecteurs lentiviraux d&#39;emballage (7 pg de pVSVg; 5 ug de pRSV rev; 13 pg de PMDL) et 20 ug de plasmide lentiviraux codant pour le gène d&#39;intérêt ou shRNA d&#39;intérêt. Ajuster à un volume de 1 ml en utilisant du DMEM. </li><li> Préparer la solution de transfection PEI en ajoutant 90 ul de 1 mg / ml de PEI à 930 pl de DMEM et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter la solution de transfection de l&#39;ADN à la solution PEI. Vortex ou inverser un certain nombre de fois et incuber pendant 5 minutes à température ambiante pour obtenir une solution de transfection de l&#39;ADN. </li><li> Goutte à goutte 2 ml de la solution de transfection de l&#39;ADN sur les cellules HEK293T et incuber pendant 4 h dans un incubateur humidifié de culture de cellules à 37 ° C. </li><li> Après 4 h, rafraîchir le milieu de culture pour éliminer PEI. Il ne est pas nécessaire de laver les cellules avant d&#39;ajouter nouveau média. REMARQUE: PEI est cytotoxique et d&#39;incubation fois plus longtemps que 4 heures peuvent causer des dommages aux cellules HEK293T. </li></ol> Jour 4: <ol start="7"><li> Remplacer supernatant avec le nouveau milieu de culture. Gardez surnageant (contenant le virus); il sera utilisé dans l&#39;étape 2.10. </li><li> Mettez surnageant dans 15 ml flacon. Pour éliminer les cellules mortes, centrifugeuse pendant 5 min à 500 x g. </li><li> Poussez surnageant de 0,45 um filtre utilisant une grande seringue de 60 ml. Conservez une nuit à 4 ° C. </li></ol> Jour 5: <ol start="10"><li> Recueillir le deuxième lot de surnageant; centrifugeuse et le filtre comme dans les étapes 2.8 à 2.9. </li><li> Mutualiser les surnageants des étapes 2,9 et 2,10 dans des tubes d&#39;ultracentrifugation et centrifuger à 50 000 xg dans une ultracentrifugation pendant 90 min. </li><li> Sortez capsules contenant très soigneusement les tubes d&#39;ultracentrifugation et de mettre dans une hotte à flux laminaire, se souvenant de l&#39;orientation du tube à l&#39;intérieur de la centrifugeuse. </li><li> Ouvrir le tube de maintien de capsule soigneusement ultracentrifugeuse milieu décanter et de telle façon que la pastille est sur le côté supérieur du tube. Depuis pellets viraux peuvent être difficiles à visualiser, rappeler dans quellecôté du tube une pastille sera formée. Prenez une micropipette et retirez dernier bit de milieu tout en prenant soin de ne pas agiter le culot brun opaque qui est visible sur le côté de la partie inférieure du tube d&#39;ultracentrifugation. </li><li> Remettre en suspension cette pastille dans 500 ul de milieu de culture additionné de nicotinamide organoïde 10 mM, 10 pM Chir99021, 10 uM Y27632 et 8 ug / ml de polybrène. La remise en suspension dans ce milieu est important car le virus à titre élevé est utilisé pour transduct directement organites. </li><li> Optionnellement: geler le virus dans ce milieu aliquotés en deux lots de 250 pl dans -80 ° C. </li></ol> 3. Lentiviral transduction des organites Jour 0: <ol><li> Diviser une pleine 0,95 cm 2 et des organites deux jours avant de transduction dans un nouveau puits, visant à obtenir environ 50 petits organites. Diviser organoïdes selon le protocole précédemment publié une (figure 3A, B). </li><li> Supplément organoïde milieu de culture avec 10 uM Chir99021 et 10 mM de nicotinamide pour obtenir hyper prolifératives kystique cryptes (figure 3C). REMARQUE: cryptes kystique développeront mieux quand organoïdes fraîchement fendus sont cultivées en présence de Chir99021. </li></ol> Jour 2: <ol start="3"><li> Organoïdes récolte par aspiration et refoulement du matrigel et moyennes, perturbant ainsi le mélange avec une micropipette P1000. Placer le mélange dans un tube de 15 ml. </li><li> Perturber outre l&#39;utilisation d&#39;une pipette Pasteur dans lequel l&#39;ouverture distale a été diminué par fusion. organoïdes à centrifuger pour sédimenter pendant 5 min à 100 x g. NOTE: En fonction de la taille de la centrifugeuse, utiliser une vitesse de centrifugeuse différente. Il est nécessaire de trouver la vitesse exacte dont perturbés organites sont séparés du mélange. </li><li> Eliminer le surnageant et ajouter 500 ul de trypsine 1x préchauffé (similaire à la trypsine 0,25%). Remettre en suspension dans de la trypsine organites et incuber3 min dans un bain d&#39;eau à 37 C °. </li><li> Inactiver la trypsine par addition de 3,5 ml de milieu de culture de lignée cellulaire (DMEM supplémenté avec 10% de FCS, 1% de pénicilline / streptomycine et glutamine). Centrifuger pendant 5 minutes à 500 x g. </li><li> Eliminer le surnageant de quitter culot dans environ 20 pi de milieu. Transférez les organites dans cette dernière petite quantité de milieu dans un puits sur une plaque de 48 puits. </li><li> Ajouter haute lentivirus du titre en milieu de transduction comme décrit à l&#39;étape 2.14, remettre en suspension et passez à l&#39;étape 3.10. En rencontrant une faible efficacité de transduction, l&#39;étape 3.9 peuvent être ajoutés. NOTE: Pour la transduction efficace, ajouter généralement une aliquote de 250 pi de haute lentivirus de titre à un puits d&#39;organites. Cela représente 50% de tous les lentivirus récolté dans une seule production comme décrit dans l&#39;étape 2 de ce protocole. </li><li> En option: pour améliorer l&#39;efficacité de transduction, effectuez spinoculation en mettant les 48 et plaques contenant organites dans une centrifugeuse préchauffé sur 326; C et tourner à 600 g pendant 1 h. </li><li> Mettre mélange organoïde-virus en culture incubateur et incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur de culture pour permettre la transduction. </li><li> En option: pour améliorer encore l&#39;efficacité transduction, incuber organoïdes pour supplémentaire de 3 heures à 37 ° C dans un incubateur de culture. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu de culture organoïde et remettre le mélange organoïde-virus, transférer dans un tube à centrifuger et centrifuger dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 850 xg pour sédimenter organites. </li><li> Retirer le surnageant et remettre le culot dans 20 ul d&#39;glacée matrigel. Comme le matériau se solidifie quand il devient plus chaud, utiliser des embouts de pipette qui sont refroidis par aspiration et refoulement PBS glacé pour un certain nombre de fois. </li><li> Mettez la goutte au milieu d&#39;un puits dans une plaque de 48 puits et incuber dans la culture incubateur à 37 ° C pendant 15 min pour solidifier. </li><li> Après 15 min, ajouter avec précaution 250 ul de milieu de culture supplémenté avec organoïdeNicotinamide 10 mM, 10 uM et 10 uM Chir99021 Y27632. Fragments organoïdes perturbé petits feront en petits organites kystiques dans les 24 heures. </li></ol> Jour 5: <ol start="16"><li> Actualiser moyen et compléter avec un antibiotique de sélection (pour puromycine, utiliser 4 pg / ml). </li></ol> Jour 7: <ol start="17"><li> Remplacer milieu pour milieu de culture organoïde standard, complétée par le choix des antibiotiques. REMARQUE: en herbe sera terminée 2-3 semaines après le retrait Chir99021. Après la sélection, organites peuvent être cultivées sans sélection antibiotique. </li></ol> 4. Organoid ARN Préparation de RT-PCR quantitative ou puces à ADN <ol><li> Pour la préparation d&#39;ARN, en utilisant un kit commercial selon le protocole du fabricant. Retirer le support de organites et ajouter 350 ul de tampon RLT, complétées par des β-mercaptoéthanol droite sur le dôme de matrigel contenant organites. Reprendre les material dans RLT par pipetage utilisant p1000 micropipette. </li><li> Effectuer d&#39;autres ARN préparation selon le protocole du fabricant. </li><li> Optionnellement: augmenter le rendement en ARN par amplification en utilisant le système Ovation Pico WTA, nécessitant l&#39;apport initial de 50 ug d&#39;ARN total selon le protocole du fabricant. </li><li> En option: contrôle de la qualité avant ARN microarray, échantillons se exécutent sur ​​un bioanalyseur 2100 en utilisant une puce ARN nano eucaryote totale, visant un certain nombre d&#39;intégrité de l&#39;ARN (RIN) de 8,5 ou plus (Figure 5) selon le protocole du fabricant. </li></ol> 5. Traitement organoïdes pour inclusion dans la paraffine et immunohistochimie <ol><li> Avant l&#39;instauration du organoïde intégration pré-chauffer un bloc d&#39;aluminium avec des trous de 12 mm tubes de verre de diamètre de montage en incubateur à 70 ° C pour empêcher le liquide de paraffine. </li><li> Prenez un seul bien avec organoïdes plein grandi et éliminer le milieu, laissant les organites embarqués intacte. </li><li> Ajouter 1 mlde 4% de paraformaldehyde dans PBS directement à bien et fixer à 4 ° C allant de 1 heure à une nuit. </li><li> Remplacer paraformaldéhyde avec 1 ml de PBS glacé. En option: garder organoïdes fixes dans du PBS jusqu&#39;à 1 semaine à 4 ° C après cette étape. </li><li> Remettre en suspension organites fixes dans 1 ml de PBS et les placer dans un flacon de verre. </li><li> Laissez organites se enfoncent vers le bas pendant 1 min, décanter et remplacer avec du PBS 70% d&#39;éthanol dans laquelle un couple de gouttelettes de solution d&#39;éosine sont dissous pour permettre la visualisation des organites au long du processus d&#39;enrobage. </li><li> Laisser organites dans 70% d&#39;éthanol à température ambiante. Après 30 min, retirez 70% d&#39;éthanol par décantation attentivement, être en mesure de visualiser les organites à l&#39;oeil à cause de légère couleur rose éosine. Remplacer solution intégrant avec 96% d&#39;éthanol. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.7, à chaque fois que le remplacement de la solution enrobage avec la suivante. Passez organoïdes travers les solutions suivantes: par la suite 70% d&#39;éthanol, 90% d&#39;éthanol, 96% d&#39;éthanol, 100% ethanol, éthanol à 100%, le xylène, le xylène. </li><li> Décanter le dernier lavage de xylène et versez la paraffine dans le tube. Mettez immédiatement le tube dans le bloc d&#39;aluminium pré réchauffé à 70 ° C pendant 30 min et remplacer la paraffine avec le nouveau paraffine propre. </li><li> Verser de paraffine et organites pipette dans le moule du bloc de paraffine à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur préchauffé à grande ouverture. Gardez Pasteur pipette tiède avec un bec Bunsen. Placez les organites dans le moule du bloc de paraffine dans une petite couche de paraffine liquide. </li><li> Autant que possible, essayer de manipuler tous les organites vers le centre du moule de bloc de paraffine en utilisant une aiguille de dissection réchauffé. Gardez dissection aiguille chaude en utilisant un brûleur Bunsen. </li><li> Lorsque localisation des organites dans le moule est satisfaisante, lingotière légèrement pour solidifier la couche de paraffine. </li><li> Terminez le bloc en versant plus de paraffine sur le dessus et ajouter une cassette d&#39;intégration histologique standard. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin1%2C+a+novel+intestinotrophic+mitogen%2C+ameliorates+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li>
<li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole vidéo actuel décrit transduction lentiviral des organites de l&#39;épithélium intestinal primaire et l&#39;analyse en aval de ces organites en utilisant des techniques d&#39;ARN quantitatifs et immunohistochimie. Transduction lentivirale est souvent réalisée dans des cellules adhérentes ou flottantes dans des plaques de culture. Étant donné que la structure tridimensionnelle des organites les rend difficiles à pénétrer par des particules virales, un certain nombre de méthodes po...

L&#39;épithélium intestinal est l&#39;un des tissus les plus proliférant rapidement corporels, qui a causé d&#39;attirer un grand intérêt de la recherche sur les cellules cancéreuses et souches. En 2009, une technique a été publié pour générer cultures durables de petites cryptes intestinales dans matrigel, conserver une structure en 3 dimensions 1. Ces structures, appelées organites intestinaux, peuvent être cultivées en utilisant des techniques standard, avec entourant milieu supplémenté avec un certain nombre de facteurs de croissance définis, y compris la BMP-signalisation inhibiteur de la voie noggine (cheville en bois), la voie Wnt-signalisation activateur rspondin 1 (Rspo1) et le facteur de croissance épidermique (EGF) tout trouvé pour améliorer la prolifération intestinal 2-4. Organites dépassent lignées cellulaires de cancer dans les aspects traditionnels qu&#39;ils sont non mutée, ont maintenu hiérarchie de cellules souches, afficher polarisation cellulaire intacte et la différenciation d&#39;exposition dans toutes les lignées cellulaires trouvés dans la petite int naissantépithélium Estinal. Comme ils peuvent être transduites pour mener transgènes ou interférence ARN constructions 5, ils sont utilisés pour étudier des éléments génétiques spécifiques, l&#39;emportant sur ​​des expériences utilisant des souris transgéniques en facettes de coût et de vitesse. L&#39;expression transgénique dans organites peut être effectuée en utilisant soit retroviral murin ou vecteurs lentiviraux 6,7. En raison des limitations de retrovirus murins, capables de transduire des cellules mitotiques exclusivement 8, la transduction lentivirale est plus fréquemment utilisé pour des cellules qui sont difficiles à infecter, tels que les organites. Virally transduction et exprimant de façon stable organoïdes transgéniques peuvent être utilisés pour une multitude d&#39;analyses en aval, y compris ARN analyses quantitatives et immunohistochimie. Pris ensemble, la culture de organites de cellules épithéliales intestinales primaires a évolué pour devenir une technique de routine qui est facile à mettre en œuvre sans exigences spécifiques de laboratoire, et est devenu le roman standard CEll culture dans la recherche sur l&#39;épithélium intestinal. Techniques de transduction virale et l&#39;analyse aval ultérieure dans organites sont fastidieux d&#39;effectuer des expériences et d&#39;aider organoïdes nous avons généré ce protocole vidéo, montrant des méthodes pour lentiviral transduction des organites culture. Nous montrons en outre la façon dont le traitement correct des organites peuvent augmenter le rendement et donc d&#39;améliorer les performances de l&#39;analyse en aval en utilisant des techniques d&#39;ARN ou immunohistochimie. Dans le protocole, organites qui sont dérivés de petites cryptes intestinales ont été exclusivement utilisées, bien que les techniques décrites peuvent être appliquées aux organites côlon ainsi.

<table><tbody><tr><td>Polyéthylène imine</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM moyen</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD</td><td>BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-acétyl cystéine</td><td>Sigma</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>souris Egf</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>glutamax 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Lonza</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>puromycine</td><td>Sigma</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>&#946 ;-mercaptoéthanol</td><td>Merck</td><td>8,057,400,250</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Pico WTA system</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>flacon en verre conique 12&nbsp ; mm x 75&nbsp ; mm 5&nbsp ; ml</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>Éosine Jaunâtre</td><td>VWR</td><td>1 159 350 025</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole pour lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Les structures de la crypte intestinale, appelées organoïdes, peuvent être maintenues en culture soutenue en trois dimensions lorsqu’elles sont complétées par les facteurs de croissance appropriés. Étant donné que les organoïdes sont très similaires au tissu d’origine en termes de différenciation des cellules souches homéostatiques, de polarité cellulaire et de présence de tous les types de cellules différenciées en phase terminale connus de l’épithélium intestinal adulte, ils constituent une ressource essentielle dans la recherche expérimentale sur l’épithélium. La possibilité d’exprimer des transgènes ou des ARN interférents à l’aide de vecteurs lentiviraux ou rétroviraux dans des organoïdes a augmenté les possibilités d’analyse fonctionnelle de l’épithélium intestinal et des cellules souches intestinales, surpassant les souris transgéniques traditionnelles en termes de vitesse et de coût. Dans le protocole vidéo actuel, nous montrons comment utiliser la transduction d’organoïdes de l’intestin grêle avec des vecteurs lentiviraux illustrés par l’utilisation de transgènes inductibles à la doxycyline, ou d’ARN en épingle à cheveux court inductible par IPTG pour la surexpression ou l’inactivation de gènes. De plus, considérant que la culture d’organoïdes donne un nombre infime de cellules qui peut même être réduit par un traitement expérimental, nous expliquons comment traiter les organoïdes pour l’analyse en aval visant la RT-PCR quantitative, les microréseaux d’ARN et l’immunohistochimie. Les techniques qui permettent l’expression de transgènes et l’inactivation de gènes dans les organoïdes intestinaux contribuent au potentiel de recherche de ces structures épithéliales intestinales, établissant la culture d’organoïdes comme une nouvelle norme dans la culture cellulaire.

Transduction lentiviral Organoid La technique de transduction organoïde utilisant des particules lentiviraux dépend de manipulation correcte des organites avant et pendant la transduction. Organites (figure 3A) ont été cultivées et ils ont été perturbés dans cryptes simples (figure 3B). Comme indiqué précédemment, ces cryptes simples, lorsqu&#39;elles sont cultivées en présence de l&#39;inhibiteur de GSK3 Chir99021 cryptes sont devenues cystiques <s...

Dans ce protocole vidéo, nous expliquons étape par étape la transduction lentivirale dans les organoïdes de l’épithélium intestinal primaire et le traitement et l’analyse en aval de ces cultures par RT-PCR quantitative, ARN-microarray et immunohistochimie.

Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des organoïdes stables transduits à partir d'épithélium intestinal de souris primaire pour une analyse en aval des organoïdes intestinaux. Cette étape est réalisée en transfectant d'abord des cellules HEC 293 T avec des vecteurs d'emballage lentiviraux et un plasmide lentiviral, codant pour le gène d'intérêt, afin de produire des particules lentivirales à haut titre. La deuxième étape consiste à prétraiter des organoïdes intestinaux de souris en culture avec plusieurs facteurs de croissance afin d'obtenir des cryptes kystiques hyperprolifératives.Ensuite, transduire les organoïdes avec un lentivirus de haut titre et incuber les organoïdes transduits dans du Matrigel. La dernière étape consiste à inclure les organoïdes transduits pleinement développés dans de la paraffine en vue d'une analyse immunohistochimique en aval. En définitive, la transduction d'organoïdes par lentivirus est utilisée pour générer des altérations génétiques dans un modèle in vitro de l'épithélium intestinal qui est fiable, reproductible et rapide.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les lignées de cellules cancéreuses, est que les organoïdes constituent une hiérarchie de cellules souches non mutées et déplacées. En ce qui concerne la polarisation cellulaire, ils peuvent se différencier en tous les types cellulaires différents de l’épithélium intestinal grêle. En outre, les organoïdes transduits peuvent être utilisés pour étudier des éléments génétiques spécifiques, ce qui rend cette approche préférable à l’utilisation de souris transgéniques en raison des aspects liés au coût et à la rapidité.La production de particules lentivirales est un protocole de cinq jours qui commence par la division des cellules HEC 293T jusqu'à une confluence de 60 à 80 % dans un flacon de 162 centimètres carrés contenant du milieu de culture cellulaire. Incuber les cellules toute la nuit dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius le jour suivant. Préparer la solution de transfection d'ADN et la solution de transfection de polyéthylèneamine ou PEI comme décrit dans le texte du protocole.Ajouter la solution de transfection d'ADN à la solution de PEI en vortexant ou en inversant plusieurs fois, puis incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter goutte à goutte deux millilitres de la solution de transfection d'ADN plus PEI sur les cellules HEK 293 T et incuber pendant quatre heures à 37 degrés Celsius.Renouvelez le milieu de culture. Pour éliminer le PEI, incubez les cellules pendant deux jours à 37 degrés Celsius le quatrième jour, puis recueillez le surnageant dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez du nouveau milieu de culture aux cellules et remettez le flacon dans l’incubateur. Centrifugez le surnageant recueilli à 500 G pendant cinq minutes.Pour éliminer les cellules mortes, utilisez ensuite une grande seringue de 60 millilitres pour faire passer le SUPERNAT à travers un filtre de 0,45 micromètre. Conservez le surnageant filtré toute la nuit à quatre degrés Celsius et, le jour suivant, récupérez-le. Centrifugez et filtrez le deuxième lot de surnageant comme indiqué pour le premier lot.Rassembler les deux lots de surnageant dans des tubes d'ultracentrifugation. Centrifuger à 50 000 ×g pendant 90 minutes. Une fois la centrifugation terminée, retirer très soigneusement les capsules contenant les tubes d'ultracentrifugation et les placer dans une hotte à flux laminaire.Ouvrez la capsule contenant le tube d'ultracentrifugeuse et versez soigneusement le milieu en gardant le culot du côté supérieur du tube. Il est important de se souvenir du côté du tube où le culot s'est formé, car les culots viraux peuvent être difficiles à visualiser. Ensuite, utilisez une micropipette pour éliminer la dernière quantité de milieu, en prenant soin de ne pas perturber le culot brun opaque visible sur le côté inférieur du tube d'ultracentrifugeuse.Résuspendez ce culot dans 500 microlitres de milieu de culture d'organoides enrichi avec des inhibiteurs de la nicotinamide kinase et du poly brain resus. La suspension dans ce milieu est importante, car un virus à forte concentration sera utilisé directement pour la transduction des organoides deux jours avant la transduction. Répartissez un puits complet de 0,95 centimètre carré d'organoides dans un nouveau puits d'une plaque de 48 puits.Suivre un protocole publié précédemment. Viser à obtenir environ 50 petits organoïdes en culture d'organoïdes. Milieu supplémenté avec un inhibiteur de la glycogène synthase kinase et de la nicotinamide.Pour obtenir des cryptes kystiques hyperprolifératives, incubez les organoïdes pendant deux jours puis récoltez-les le jour de la transduction à l’aide d’une micropipette P 1000. Aspirez et expulsez le gel de matrice et le milieu plusieurs fois à l’aide de la pipette, perturbant ainsi le mélange.Placer le mélange dans un tube de 15 millilitres. Perturber davantage le mélange à l’aide d’une pipette PE dont l’ouverture distale a été réduite par fusion. Pelletiser les organoïdes par centrifugation à 100 G pendant cinq minutes. Ensuite, retirer le surnageant et ajouter 500 microlitres de trypsine 1 x préchauffée, puis resuspendre les organoïdes et incuber pendant trois minutes.Dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, inactiver la trypsine en ajoutant 3,5 millilitres de milieu de culture de lignée cellulaire, puis centrifuger pendant cinq minutes à 500 G. Retirer le surnageant en laissant le culot dans environ 20 microlitres de milieu. Transférer les organoïdes dans cette petite quantité résiduelle de milieu dans un puits.Dans une plaque de 48 puits, ajouter le lentivirus à titre élevé préparé précédemment dans le milieu de transduction aux organoïdes et resuspendre. Incuber une heure à 37 degrés Celsius dans une étuve à culture pour permettre la transduction. Après une heure, ajouter un millilitre de milieu de culture d’organoïdes au mélange organoïdes-virus, resuspendre, puis transférer le mélange dans un tube de microcentrifugeuse. Centrifuger à 850 ×g pendant cinq minutes.Pour faire précipiter les organoïdes, retirez le surnageant et resuspendez le culot. Dans 20 microlitres de gel de matrice glacé, placez la goutte au centre d'un puits. Dans une plaque de 48 puits, incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.Pour que la gouttelette durcisse après 15 minutes. Ajouter soigneusement 250 microlitres de culture d'organoïdes. Milieu supplémenté avec de la nicotinamide et des inhibiteurs de kinases.Préchauffer un bloc d'aluminium dans une étuve à 70 degrés Celsius pour maintenir le paraffine à l'état liquide. Retirer le milieu d'une seule cavité contenant des organoïdes pleinement développés, en laissant les organoïdes inclus intacts, puis ajouter directement un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS dans la cavité. Remplacer le paraformaldéhyde par un millilitre de PBS.Resuspendre les organoïdes fixés dans le PBS et les transférer dans un flacon en verre. Laisser les organoïdes décanter au fond pendant une minute. Ensuite, pipeter le PBS et le remplacer par de l'éthanol à 70 %, dans lequel quelques gouttes de solution d'éosine ont été dissoutes.Pour permettre la visualisation des organoïdes tout au long du processus d'inclusion, laissez les organoïdes dans de l'éthanol à 70 % à température ambiante pendant 30 minutes. Retirez l'éthanol à 70 % en pipettant soigneusement. Les organoïdes peuvent être visualisés à l'œil nu grâce à la couleur éosine rose.Remplacer la solution d'inclusion par de l'éthanol à 96 % et laisser à température ambiante pendant 30 minutes de cette manière. Ensuite, faire passer les organoïdes à travers de l'éthanol à 70 %, de l'éthanol à 90 %, de l'éthanol à 96 %, de l'éthanol à 100 %, de l'éthanol à 100 %, le xylène et le xylène. Éliminer la dernière solution de xylène par décantation et verser du paraffine dans le flacon en verre.Placer immédiatement le flacon dans le bloc en aluminium préchauffé à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, remplacer le paraffine par du paraffine propre et préchauffé à l’aide d’un tube en polyéthylène ou d’une pipette. Verser le paraffine et utiliser une spatule ou une pipette préchauffée à orifice large pour transférer les organoïdes dans le moule à blocs de paraffine, au sein d’une couche de paraffine liquide.Chauffer une aiguille de dissection avec un bec Bunsen et manipuler autant que possible tous les organoïdes vers le centre du moule en paraffine. Lorsque la localisation des organoïdes dans le moule est satisfaisante, refroidir légèrement le moule pour solidifier la couche de paraffine. Terminer le bloc en versant davantage de paraffine par-dessus et en ajoutant une cassette d'inclusion histologique standard.Dans ce protocole, des organoïdes de l'épithélium intestinal ont été transduits avec des lentivirus. Les organoïdes normaux se développent sous forme de structures kryptiques villositaires présentant un certain nombre de cryptes qui émergent d'un domaine villositaire partagé. Après traitement de ces organoïdes avec l'inhibiteur GSK-3β, le CHIR 99021, la prolifération augmente et les cryptes deviennent kystiques suite à la transduction des organoïdes.Grâce à une surexpression de EGFP par lentivirus, les organoïdes expriment un transducteur fluorescent EGFP, et des étapes d'amélioration de la transduction, telles qu'une inoculation ou une incubation virale prolongée, qui peuvent être réalisées lorsque l'efficacité de transduction est faible, ne sont pas nécessaires, car ces étapes n'augmenteraient pas l'efficacité déjà élevée. Par la suite, ces organoïdes sont traités pour des techniques d'ARN et pour l'immunohistochimie. Cette image représentative correspond à une section d'un organoïde intestinal de souris, colorée pour BRDU après incubation avec BRDU pendant une heure avant la fixation.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire la transduction d'organoïdes à partir d'un épithélium intestinal primaire en utilisant des particules lentivirales ou rétrovirales.

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Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

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