Name: Snapshot échelle du génome des régulateurs de la chromatine et les États dans Xenopus Embryons par Chip-Seq (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Découvrez la méthode ChIP-Seq pour cartographier les régulateurs de la chromatine et leurs états dans les embryons de Xenopus. Cette technique permet d'étudier l'architecture chromatinienne à l'échelle du génome.

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Nous remercions Chris Benner pour l’implémentation du génome de X. tropicalis (xenTro2, xenTro2r) dans HOMER et le laboratoire Gilchrist pour les discussions sur l’analyse post-séquençage. G.E.G et J.C.S. ont été soutenus par le Wellcome Trust et sont maintenant soutenus par le Conseil de recherches médicales (numéro de programme U117597140).

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<li>Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
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<li>Blythe, S. A., Reid, C. D., Kessler, D. S., Klein, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+in+early+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation in early Xenopus laevis embryos.</a> Dev Dyn. 238 (6), 1422-1432 (2009).</li>
<li>Gentsch, G. E., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+physical+chromatin+associations+across+the+Xenopus+genome+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Investigating physical chromatin associations across the Xenopus genome by chromatin immunoprecipitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J Embryol Exp Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
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<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
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<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Brief Bioinform. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
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<li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44 (2), 148-156 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Notre protocole décrit comment faire et d&#39;analyser les profils de la chromatine génome entier à partir d&#39;embryons de xénope. Il couvre toutes les étapes à partir de protéines de réticulation pour les loci endogènes in vivo pour traiter des millions de lectures représentant des sites génomiques enrichies en silico. Depuis nombre croissant de projets de génome sont disponibles, ce protocole devrait être applicable à d&#39;autres organismes modèles et non-modèle. La partie expérimentale la plus importante, qui établit ce protocole en dehors du travail précédente 8,31,33,34, est la procédure post-fixation pour extraire des noyaux réticulés. Il facilite efficace solubilisation de la chromatine et cisaillement et upscaling facile. Ensemble, avec des rendements améliorés de préparation bibliothèque ce protocole permet la construction de bibliothèques ChIP-Seq haute complexité de la moitié aux deux millions de cellules exprimant l&#39;épitope de la chromatine associée d&#39;intérêt. Pour les expériences ChIP-qPCR, quelques dix mille de ces cellules sont normalement assezde vérifier pour l&#39;enrichissement de l&#39;ADN à peut-être six loci génomiques distincts. Ces chiffres sont des estimations prudentes, mais peut varier selon le niveau d&#39;expression de protéines, la qualité d&#39;anticorps, l&#39;efficacité et l&#39;accessibilité épitope de réticulation. Comme un guide, un seul embryon de Xenopus contient environ 4000 cellules au stade mi-blastula (8,5 après Nieuwkoop et Faber 29), 40 000 cellules à la fin du stade gastrula (12) et 100 000 cellules au stade de bourgeon caudal tôt (20). Le temps de fixation exacte pour immunoprécipitation efficace doit être déterminée empiriquement par Chip-qPCR (article 10). En général, plus temps de fixation sont nécessaires si l&#39;expérience implique X. laevis embryons, premiers stades de développement, et des propriétés de liaison d&#39;ADN faibles (ou indirects). Cependant, il ne est pas recommandé de fixation Xenopus embryons plus de 40 min, ou le traitement de plus d&#39;embryons que indiqué (section 3), la chromatine cisaillement devient moins efficace. Il est important de ne pasà utiliser toute la glycine après fixation que cette étape commune pour trempe formaldéhyde peut faire l&#39;extraction nucléaire à partir d&#39;embryons jaune riche très difficiles. Actuellement, la raison de cela ne est pas connue. Il est concevable que le produit d&#39;addition formaldéhyde-glycine réagit en outre avec des groupes amino ou 35 résidus d&#39;arginine N-terminale. L&#39;anticorps est la clé de toute expérience de la puce et des contrôles suffisants doivent être menées pour montrer sa spécificité pour l&#39;épitope d&#39;intérêt (voir les lignes directrices par Landt et al. 36). Si aucun anticorps ChIP qualité est disponible, l&#39;introduction de protéines de fusion de marquage épitopique correspondant peut être une alternative légitime que ces protéines peuvent occuper endogène sites de liaison 37. Dans ce cas, les embryons non-injecté sont les meilleurs à utiliser comme contrôle négatif plutôt que d&#39;une puce avec du sérum non spécifique. Cette stratégie peut également être appliquée si la protéine d&#39;intérêt est exprimée à faibles niveaux résultant de la mauvaise récupération des enriADN CHED. Comme pour la fabrication de bibliothèques ChIP-Seq, en raison de la faible quantité d&#39;ADN en cours d&#39;utilisation, il est recommandé d&#39;opter pour des procédures qui réduisent le nombre d&#39;étapes de nettoyage et de combiner des réactions de garder toute perte d&#39;ADN au minimum. Les adaptateurs et les amorces doivent être compatibles avec le séquençage multiplex et la plate-forme NGS (voir le tableau de matériaux spécifiques / Équipement). Si l&#39;on utilise des adaptateurs en Y (contenant de longs bras simple brin), il est essentiel d&#39;effectuer une pré-amplifier la bibliothèque de trois à cinq cycles de PCR avant inserts d&#39;ADN grandeur de sélection (par ex., 100 à 300 pb) par électrophorèse sur gel. Extrémités simple brin causent des fragments d&#39;ADN de migrer hétérogène. Essai fonctionne avec différentes quantités d&#39;ADN d&#39;entrée (par exemple, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 et 20 ng) sont recommandés pour déterminer le nombre total de cycles de PCR (inférieur ou égal à 18 cycles) nécessaire pour effectuer une taille Sélectionnée bibliothèque de 100 à 200 ng. Réduire le nombre de cycles de PCR rend le séquençage de Redundant lit moins probable. Phase solide perles d&#39;immobilisation sont réversibles bonne nettoyage réactifs de récupérer efficacement l&#39;ADN d&#39;intérêt et fiable retirez les cartes gratuites et des dimères de ligature et les réactions PCR. En termes de nombre, le type et la durée de lit, autour de 20 à 30 millions seule fin lit de 36 pb est suffisant pour la plupart des expériences de ChIP-Seq pour couvrir l&#39;ensemble du génome de Xenopus avec la profondeur suffisante. Les machines de l&#39;END les plus fréquentes sont régulièrement capables de répondre à ces critères. Cependant, il peut être avantageux d&#39;augmenter le nombre de lectures si un larges distributions de lit est prévu, comme observé avec les modifications des histones, plutôt que des pics nets. Pour de nombreuses expériences de ChIP-Seq, 4-5 bibliothèques différemment indexées peuvent être regroupées et séquencées dans un flux voie de cellule en utilisant un haute performance NGS machine. Parfois est également conseillé de prolonger la durée de lecture et la séquence deux extrémités de la matrice d&#39;ADN (jumelé-end) pour augmenter cartographiabilité wpoule analyse chromatine au sein des régions génomiques répétitives. Ce protocole a été appliqué avec succès à une large variété de fonctions de la chromatine tels que les facteurs de transcription, des médiateurs de signalisation et des modifications des histones post-traductionnelles. Cependant, les embryons acquérir un degré croissant d&#39;hétérogénéité cellulaire dans l&#39;élaboration de profils de la chromatine et deviennent plus difficiles à interpréter. Des mesures prometteuses ont été faites chez Arabidopsis et Drosophila aux paysages chromatine tissus spécifiquement profil en extrayant cellulaires noyaux spécifiques de type 38,39. Notre protocole comprend une étape d&#39;extraction nucléaire, qui pourrait ouvrir la voie à tissu-spécifique ChIP-Seq dans d&#39;autres embryons.

Les premières tentatives de caractérisation des interactions protéine-ADN in vivo ont été signalées il y a environ 30 ans dans le but de comprendre la transcription génique médiée par l’ARN polymérase chez les bactéries et chez la mouchedes fruits 1,2. Depuis lors, l’utilisation de l’immunoprécipitation pour enrichir les caractéristiques distinctes de la chromatine (ChIP) a été largement adoptée pour capturer les événements de liaison et les états de la chromatine avec une efficacité élevée3. Par la suite, avec l’émergence de puissantes technologies de microarrays, cette méthode a conduit à la caractérisation des paysages de chromatine à l’échelle du génome4. Plus récemment, le profilage de la chromatine est devenu encore plus complet et à haute résolution, car des millions de matrices d’ADN co-immunoprécipité peuvent désormais être séquencées en parallèle et cartographiées sur le génome (ChIP-Seq)5. Alors qu’un nombre croissant d’assemblages de génomes sont disponibles, ChIP-Seq est une approche attrayante pour en savoir plus sur la régulation du génome qui sous-tend les processus biologiques. 
Ici, nous fournissons un protocole pour effectuer ChIP-Seq sur des embryons riches en vitellus tels que ceux de la grenouille Xenopus. Des ébauches des génomes des deux espèces de Xenopus largement utilisées, X. tropicalis et X. laevis, ont maintenant été publiées par l’International Xenopus GenomeConsortium 6. Les embryons des espèces de Xenopus partagent de nombreuses caractéristiques souhaitables qui facilitent et permettent l’interprétation des études de la chromatine à l’échelle du génome, y compris la production d’un grand nombre d’embryons de haute qualité, la grande taille des embryons eux-mêmes et leur développement externe. De plus, les embryons se prêtent à des manipulations classiques et nouvelles telles que le traçage de la lignée cellulaire, l’hybridation in situ en monture entière, la surexpression de l’ARN et la technologie d’inactivation médiée par TALEN/CRISPR.
Le protocole suivant s’appuie sur les travaux de Lee et al., Blythe et al. et Gentsch et al. 7-9. En bref, les embryons de xénope sont fixés au formaldéhyde au stade de développement d’intérêt pour lier de manière covalente (réticulation) les protéines à leur ADN génomique associé. Après l’extraction nucléaire, la chromatine réticulée est fragmentée pour concentrer le séquençage ultérieur sur des sites spécifiques de liaison ou de modification génomique, et pour minimiser les contributions des séquences d’ADN flanquantes. Par la suite, les fragments de chromatine sont immunoprécipités avec un anticorps de grade ChIP pour enrichir ceux contenant la protéine d’intérêt. L’ADN co-immunoprécipité est extrait de la protéine et purifié avant de créer une banque indexée (extrémités appariées) pour le séquençage de nouvelle génération (NGS). À la fin, des lignes de commande simples sont proposées pour l’analyse post-séquençage des données ChIP-Seq.

<table><tbody><tr><td>Micro-embout conique 1/16 pouce</td><td>Qsonica</td><td>4417</td><td>Ce micro-embout est compatible avec le Sonicator 3000 de Misonix et le Q500/700 de Qsonica.</td></tr><tr><td>Flacon d’échantillon en verre de 8 ml avec bouchon Wheaton</td><td></td><td>224884</td><td>Flacons d’échantillons en verre transparent de 8 ml pour échantillons aqueux avec bouchons à vis doublés de caoutchouc phénolique de taille 15-425.</td></tr><tr><td>Adaptateur</td><td>, par exemple adaptateur universel IDT ou Sigma</td><td>NA</td><td>TruSeq, 
AATGATACGGCGACCACCGAG 
ATCTACACTCTTTCCCTACAC 
GACGCTCTTCCGATC*T. Adaptateur indexé TruSeq, 
P-GATCGGAAGAGCACACGTC 
TGAACTCCAGTCAC &#8208 ; NNNNNNN&#8208 ; 
ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, groupe phosphate de liaison phosphorothioate à 5' fin. NNNNNNN, index (voir le Guide de préparation des échantillons TruSeq ChIP pour la séquence d’ADN). Commandez des adaptateurs HPLC purifiés. Les adaptateurs peuvent être préparés en combinant des quantités équimolaires (chaque 100 &#181 ; M) de l’adaptateur universel et de l’adaptateur indexé et en les refroidissant lentement de 95 &#176 ; C à température ambiante. Utilisez 1,5 pmol par ng d’ADN d’entrée. Conserver à -20 &#176 ;C.</td></tr><tr><td>b2g4pipe (logiciel)</td><td>Blast2GO</td><td>non commercial</td><td>http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip</td></tr><tr><td>BLAST+ (logiciel)</td><td>Camacho et al.</td><td>non commercial</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&amp ; DOC_TYPE=Télécharger</td></tr><tr><td>Bowtie (logiciel)</td><td>Langmead et al.</td><td>non commercial</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml</td></tr><tr><td>cisFinder (logiciel)</td><td>Sharov et al.</td><td>non commerciale</td><td>http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/</td></tr> <tr><td>Puce pour électrophorèse capillaire</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td>Chargez cette puce avec 1 &micro ; l ADN pour le contrôle de la qualité des bibliothèques. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse capillaire sur puce</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td>Le BioAnalyzer Agilent 2100 est utilisé pour vérifier la qualité des banques ChIP-Seq. Maintenir les réactifs à 4 &°C.</td></tr><tr><td>Kit de préparation de la banque ChIP-Seq (KAPA Hyper Prep Kit)</td>Le kit <td>KK8504</td> de <td>Kapa Biosystems</td><td>contient un mélange d’enzymes de réparation d’extrémité et de queue A, un tampon de réparation d’extrémité et de queue A, une ligase d’ADN, un tampon de ligature, un mélange d’amorces d’amplification de bibliothèque KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) et un mélange d’amorces d’amplification de bibliothèque KAPA (10X) (voir également amorces PCR). Les adaptateurs ne sont pas inclus. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Kit de préparation de banque ChIP-Seq (alternative, ThruPLEX-FD Prep Kit)</td><td>Le kit Rubicon Genomics</td><td>R40048</td><td>utilise ses propres adaptateurs de boucle de tige et amorces. Ce kit élimine les étapes de purification intermédiaires et est aussi sensible que le kit KAPA Hyper Prep. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Cluster3 (software)</td><td>de Hoon et al.</td><td>non commercial</td><td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster</td></tr><tr><td>FastQC (logiciel)</td><td>Simon Andrews</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc non commercial</td><td></td></tr><tr><td>Technologies de vie</td> du<td>fluorimètre</td><td>Q32866</td><td>Fluorimètre Qubit 2.0</td></tr><tr>Technologies <td>de la vie</td> des<td>réactifs du fluorimètre</td><td>Q32851</td><td>Le kit fournit un réactif de dosage concentré, un tampon de dilution et des étalons d’ADN pré-dilués pour le fluorimètre Qubit. Stocker les étalons d’ADN à 4 &deg ; C, tamponner et colorant à température ambiante.</td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>F8775-4X25ML</td><td>Solution de formaldéhyde, pour la biologie moléculaire, 36,5-38 % dans H2O, stabilisée avec 10-15 % de méthanol. Conserver à température ambiante. ATTENTION : Le formaldéhyde est corrosif et hautement toxique.</td></tr><tr><td>Gel (E-Gel EX agarose, 2 %)</td><td>life technologies</td><td>G4010</td><td>Gel prémoulé avec 11 puits, format ouvrant. Laissez une voie vide entre l’échelle et la bibliothèque pour éviter la contamination croisée. Conservez les gels à température ambiante.</td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse sur gel</td><td></td><td>G6465</td><td>Kit combiné E-Gel iBase et E-Gel Safe Imager pour la sélection de la taille des bibliothèques ChIP-Seq.</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Conservez tous les réactifs à température ambiante. Utilisation 500 & micro ; l de tampon QG pour 100 mg de tranche de gel d’agarose à 2 % pour extraire l’ADN. Utilisez les colonnes MinElute (du kit de purification PCR MinElute) pour éluer l’ADN deux fois.</td></tr><tr><td>HOMER (logiciel)</td><td>Chris Benner</td><td>http://homer.salk.edu/homer/index.html non commercial</td><td></td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>Techne</td><td>FHB1D</td><td>Hybridizer HB-1D</td></tr><tr><td>IGV (logiciel)</td><td>Robinson et al.</td><td>non commercial</td><td>http://www.broadinstitute.org/igv/home</td></tr><tr><td>Filtre de qualité Illumina CASAVA-1.8 (logiciel)</td><td>Assaf Gordon</td><td>non commercial</td><td>http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter</td></tr><tr><td>Java TreeView (logiciel)</td><td>Alok Saldanha</td><td>non commercial</td><td>http://jtreeview.sourceforge.net</td></tr><tr><td>Laboratory jack</td><td>Edu-Lab</td><td>CH0642</td><td>Cette prise est utilisée pour élever l’échantillon dans l’enceinte sonore pour la sonication.</td></tr><tr><td>Échelle, 100 pb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231</td><td>Conserver 1x solution à température ambiante. Stocker le stock à -20 °C.</td></tr><tr><td>Échelle, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232</td><td>Conservez 1x solution à température ambiante. Stocker le stock à -20 °C.</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation à faible rétention de 1,5 ml</td><td>technologies de vie</td><td>AM12450</td><td>tubes de microfuge antiadhésifs sans RNase, 1,5 ml</td></tr><tr><td>MACS2 (logiciel)</td><td>Tao Liu</td><td>non commercial</td><td>https://github.com/taoliu/MACS</td></tr><tr><td>Perles magnétiques</td><td>life technologies</td><td>11201D</td><td>Ces Dynabeads sont des billes superparamagnétiques avec des IgG de mouton polyclonaux de mouton purifiés par affinité liés de manière covalente à la surface de la bille. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Perles magnétiques</td><td>life technologies</td><td>11203D</td><td>Ces Dynabeads sont des billes superparamagnétiques avec affinité purifiée polyclonale de mouton IgG anti-lapin liées de manière covalente à la surface de la bille. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td></td><td>10001D</td><td></td> <td>Ces Dynabeads sont des billes superparamagnétiques avec la protéine A recombinante liée de manière covalente à la surface de la bille. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td></td><td>10003D</td><td></td> <td>Ces Dynabeads sont des billes superparamagnétiques avec la protéine G recombinante liée de manière covalente à la surface de la bille. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Magnetic rack</td><td>life technologies</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>aimant MEME</td><td>Bailey et al.</td><td>non commercial</td><td>http://meme.nbcr.net/meme/</td></tr> <tr><td>Na3VO4</td><td>New England BioLabs</td><td>P0758</td><td>L’orthovanadate de sodium (100 mM) est un inhibiteur général couramment utilisé pour les protéines phosphotyrosyl phosphatases. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Le</td><td></td><td></td><td>fluorure de sodium (500 mM) est couramment utilisé comme inhibiteur général des phosphoséryl et des phosphothréonylphosphatases. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Machine NGS</td><td>Illumina</td><td>SY-301-1301</td><td>Genome Analyzer IIx</td></tr><tr><td>Machine NGS (haute performance)</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>HiSeq</td></tr><tr><td>Sérum normal (contrôle des anticorps)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2028</td><td>Utilisation comme contrôle pour les anticorps IgG polyclonaux de chèvre dans les expériences ChIP-qPCR. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Sérum normal (contrôle des anticorps)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td>Utilisation comme contrôle des anticorps IgG polyclonaux de souris dans les expériences ChIP-qPCR. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Sérum normal (contrôle des anticorps)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td>Utilisation comme contrôle des anticorps IgG polyclonaux de lapin dans les expériences ChIP-qPCR. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Solution de coloration des acides nucléiques</td><td>iNtRON</td><td>21141</td><td>Utilisez la solution de coloration des acides nucléiques RedSafe à 1:50 000. Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>O3756-25G</td><td>Sel disodique d’acide 1-phénylazo-2-naphtol-6,8-disulfonique. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Amorces PCR</td><td>, par exemple IDT ou Sigma</td><td></td><td>Amorces pour enrichir les fragments d’ADN ligaturés par adaptateur par PCR : AATGATACGGCGACCACCGA*G et CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, liaison phosphorothioate. Apprêts conçus par Ethan Ford. Combinez les apprêts à 5 et micro ; M chacun. Utilisation 5 & micro ; l dans un 50 &micro ; l Réaction PCR. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Kit de purification PCR MinElute&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td>pour la purification des échantillons de test ChIP-qPCR et de cisaillement. Stocker les colonnes de spin MinElute à 4 &deg ; C, tous les autres tampons et tubes de collecte à température ambiante.</td></tr><tr><td>Phénol :chloroforme :alcool isoamylique (25:24:1, pH 7,9)</td><td>technologies de vie</td><td>AM9730</td><td>Phénol :Chloroforme :IAA (25:24:1) est prémélangé et fourni à pH 6,6. Utilisez le tampon alcalin Tris fourni pour augmenter le pH à 7,9. Conserver à 4 °C. ATTENTION : l’alcool phénol :chloroforme :isoamylique est corrosif, hautement toxique et combustible.</td></tr><tr><td>Primer3 (logiciel)</td><td>Steve Rozen & Helen Skaletsky</td><td>non commercial</td><td>http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</td></tr><tr><td>comprimés inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>cOmplete, Mini, sans EDTA. Utiliser 1 comprimé pour 10 ml. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Comprimés inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>complets, sans EDTA. Utiliser 1 comprimé pour 50 ml. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>life technologies</td><td>AM2548</td><td>protéinase K solution (20 & micro ; g/&micro ; l). Stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>technologies de la vie</td><td>12091-039</td><td>RNase A (20 & micro ; g/&micro ; l). Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td>Rotator SB3</td></tr><tr><td>SAMtools (logiciel)</td><td>Li et al.</td><td>non commercial</td><td>http://samtools.sourceforge.neta</td></tr><tr><td>Perles d’immobilisation réversibles en phase solide</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>Les billes Agencourt AMPure XP sont utilisées pour minimiser la contamination des dimères d’adaptateur dans les bibliothèques ChIP-Seq. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Sonicator 3000</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>De nouveaux modèles sont maintenant disponibles. Q125, Q500 ou Q700 conviennent tous au cisaillement de la chromatine réticulée.</td></tr><tr><td>Enceinte acoustique</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>en option : suivez les recommandations du fabricant pour obtenir l’enceinte acoustique appropriée.</td></tr><tr><td>Thermomixeur</td><td>eppendorf</td><td>22670000</td><td>Thermomélangeur pour 24 tubes de 1,5 ml. Contrôle précis de la température à partir de 4 &deg ; C au-dessus de la température ambiante à 99 °C.</td></tr></tbody></table>

snapshot échelle du génome des régulateurs de la chromatine et les États dans<em&gt; xenopus</em&gt; embryons par chip-seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Le recrutement des régulateurs de la chromatine et l’attribution d’états de la chromatine à des loci génomiques spécifiques sont essentiels aux décisions relatives au destin cellulaire et à la formation des tissus et des organes au cours du développement. La détermination des emplacements et des niveaux de ces caractéristiques chromatiniennes in vivo fournira des informations précieuses sur la régulation spatio-temporelle des éléments génomiques et soutiendra les aspirations à imiter le développement des tissus embryonnaires in vitro. La méthode la plus couramment utilisée pour le profilage à l’échelle du génome et à haute résolution est l’immunoprécipitation de la chromatine suivie d’un séquençage de nouvelle génération (ChIP-Seq). Ce protocole décrit comment les embryons riches en vitellus tels que ceux de la grenouille Xenopus peuvent être traités pour les expériences ChIP-Seq, et il offre des lignes de commande simples pour l’analyse post-séquençage. En raison de la grande efficacité avec laquelle le protocole extrait les noyaux des tissus fixés au formaldéhyde, la méthode permet une mise à l’échelle facile pour obtenir suffisamment de matériel ChIP pour le profilage à l’échelle du génome. Notre protocole a été utilisé avec succès pour cartographier diverses protéines de liaison à l’ADN telles que les facteurs de transcription, les médiateurs de signalisation, les composants de la machinerie de transcription, les modificateurs de la chromatine et les modifications post-traductionnelles des histones, et pour cela à divers stades de l’embryogenèse. Enfin, ce protocole devrait être largement applicable à d’autres organismes modèles et non modèles à mesure que de plus en plus d’assemblages de génomes deviennent disponibles.

Des résultats équivalents à ceux présentés ici sont attendus si le protocole est bien exécuté et l&#39;anticorps en cours d&#39;utilisation est de qualité ChIP qualité (voir la discussion). Ce protocole permet l&#39;extraction des noyaux d&#39;embryons de Xenopus fixés au formaldehyde et le cisaillement efficace de la chromatine par sonication (figure 1A-C). Chromatine rasé montre une distribution asymétrique des fragments d&#39;ADN principalement allant de 100 à 1000 pb et un pic entre 300 et 500 pb (figure 1C). Un minimum de 50 pg d&#39;ADN immunoprécipité est tenu de faire avec succès un jumelé fin bibliothèque de ChIP-Seq indexées avec des inserts d&#39;ADN de taille similaire (figure 2A). La bibliothèque devrait être largement dépourvue de dimères de l&#39;adaptateur, qui peut être vu sur le électrophérogramme à environ 120 pb. Après séquençage par synthèse, pré-traitée lit sont mappés au génome (figure 2B, C). Dans une expérience réussie avec <em&gt; X. embryons tropicalis, normalement 50 à 70% de mono-lit extrémité de 40 pb peut être mappée de manière unique à l&#39;ensemble du génome de v7.1 avec au maximum deux mésappariements. Bien entrée lit aligner uniformément sur tout le génome, l&#39;alignement de la puce à lit résultats enrichissement spécifique brin qui flanquent la fonction de la chromatine d&#39;intérêt. Ce est parce que tous les fragments sont séquencés de l&#39;extrémité 5 &#39;(figure 2C) 25. Extension de l&#39;alignement à la lecture de la direction à une taille moyenne de fragment produit des profils précis pour les éléments de la chromatine simples tels que les événements de liaison du facteur de transcription. Ces occupations d&#39;ADN apparaissent comme des pics lorsque visualisée dans IGV ou tout autre navigateur compatible génome. Appelants pointe comme MACS sont utilisés pour déterminer l&#39;emplacement de ces pics (figure 3A). De cette façon, des dizaines de milliers de sites de liaison ont été déterminées dans le X. tropicalis génome pour T-box facteurs de transcription tels que Vegt 26. ChIP-qPCR expéments devraient confirmer l&#39;enrichissement locale trouvée par ChIP-Seq (figure 3B). expériences de ChIP-Seq permettent d&#39;explorer les caractéristiques de l&#39;ensemble du génome de caractéristiques de la chromatine. Par exemple, calculer la répartition de lecture sur les éléments génomiques telles que le démarrage de la transcription et de sites de terminaison peut mettre en évidence les préférences contraignantes spatiales autour de gènes (figure 3C). De même, un heatmap des distributions de lecture à des endroits de pointe est utilisé pour comparer différentes caractéristiques de la chromatine à l&#39;échelle du génome entier (Figure 3D). Certains facteurs de transcription se lient séquence d&#39;ADN spécifiquement. De novo analyse de motif de pics sous-jacentes de l&#39;ADN génomique peut récupérer ce genre d&#39;information, y compris les motifs de co-enrichi de co-facteurs potentiels (Figure 3E). La grande majorité des gènes cibles montrent ADN occupation à un plus bas plutôt que niveau plus élevé (figure 3F). Cette fonctionnalité sans échelle semble être assez fréquent chez les trfacteurs de anscription et suggère que seule une petite fraction de gènes cibles sont directement réglé avec pertinence biologique 27,28. L&#39;analyse des termes de GO enrichis ou d&#39;autres attributs tels que l&#39;expression différentielle des gènes cibles peut en outre révéler un aperçu de la fonction biologique de la fonction de la chromatine dans l&#39;embryon de Xenopus (figure 3G). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig1highres.jpg" /> Figure 1. La chromatine procédure d&#39;immunoprécipitation pour les embryons de Xenopus. (A) Les embryons sont le formaldéhyde-fixe au stade de développement de l&#39;intérêt pour lier de manière covalente (réticulation) des protéines associées à l&#39;ADN génomique. Lors de l&#39;extraction nucléaire (B), la chromatine réticulé est fragmentée pour affiner l&#39;ADN génomique de liaison ou les sites de modification de la chromatine en minimisant le DN d&#39;accompagnementUne séquence (C). Par la suite, les fragments de chromatine sont immunoprécipités avec un anticorps ChIP de qualité pour enrichir ceux contenant l&#39;épitope d&#39;intérêt (D). L&#39;ADN de co-immunoprécipitée est enlevé la protéine et purifié (E) avant de créer la banque de fragments de puce pour NGS (Figure 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig2highres.jpg" /> Figure 2. Préparation de la bibliothèque ChIP-Seq, le séquençage par synthèse, la cartographie et les appels de pointe. (A) Le électrophérogramme affiche une bonne bibliothèque de ChIP-Seq avec des modèles d&#39;ADN de 250 à 450 pb. Ces modèles comportent l&#39;insert d&#39;ADN d&#39;intérêt flanquée par le universel (58 pb) et la (63 pb) indexé adaptateur (B). </strong&gt; Des millions de grappes, avec chaque groupe contenant des modèles identiques, sont la base séquencée par la base, en présence des quatre nucléotides possédant réversible, fluorophore distincte et propriétés de terminaison identiques. Images fluorescentes sont traitées en temps réel pour appeler bases correspondantes, qui sont finalement assemblés en lit. (C) ne lit que cette carte unique pour le génome de Xenopus sont conservés. Comme tous les fragments sont séquences à partir de l&#39;extrémité 5 &#39;, la mise en correspondance de résultats en lit ChIP pics spécifiques à brin qui flanquent la fonction de la chromatine d&#39;intérêt. Ainsi, les appelants pointe détectent l&#39;enrichissement qui provient immunoprécipitation et d&#39;étendre le lit à une longueur moyenne des fragments de localiser avec précision les caractéristiques de la chromatine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img aLT = &quot;Figure 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52535 / 52535fig3highres.jpg&quot; /&gt; Figure 3. Un exemple d&#39;analyse post-séquençage et la visualisation de données au moyen du facteur T-boîte de zygotique transcription Vegt (zVegT). Tous lire chiffres indiqués ici sont normalisés à 10 millions cartographié de façon unique et non redondant lectures. (A) Extrait du profil de l&#39;ensemble du génome de zVegT obligatoire dans X. Les embryons de tropicalis (stade 11 à 12,5 après Nieuwkoop et Faber 29). Chaque pic, un carambolage de lit étendu, représente un site de liaison. Ces pics sont appelés par MACS2 avec un taux de fausse découverte (FDR) de moins de 1%. Chaque gène MESP montre liaison zVegT très proximale et en amont, mais seulement mespa et mespb sont exprimés à ce stade (données d&#39;ARN-Seq 30). (B) le taux d&#39;occupation de l&#39;ADN de zVegT tel que déterminé par ChIP-qPCR à plusieurs loci (y compris un non région liØe 0,5 kb en amont du β-actine) confirm l&#39;enrichissement spécifique trouvée par ChIP-Seq. Comparer les résultats pour mespa avec un pic appelé (barre rouge) dans (A). Le taux d&#39;occupation de l&#39;ADN est visualisé en tant que pourcentage de l&#39;entrée à la fois, la puce avec l&#39;anticorps Vegt (polyclonal de lapin d&#39;isotype IgG) et la puce avec l&#39;anticorps de contrôle (IgG de lapin normal). Les barres d&#39;erreur reflètent l&#39;écart type de deux répétitions biologiques. (C) metagene analyse montre liaison zVegT préférentiel (balises binned plus de 25 pb) au promoteur par rapport à toute autre région génomique autour et au sein des organes de gènes. (D) Heatmap montre k-moyenne cluster niveaux (k = 5) d&#39;occupation d&#39;ADN (tags binned plus de 25 pb) et du zVegT Smad2 / Smad3 (données de la puce-Seq 31) par rapport à toutes les régions zVegT-liés au stade de la gastrula. Le heatmap est log 2 basé et centré à 5 étiquettes par pb. (E) De novo analyse de motif découvre le motif de liaison canonique T-box facteur de transcription dans 38% des zVegT-régions à destination si le score de motif sous-jacent est normalisée à un taux de découverte de 5% dans les séquences de fond. La carte de densité montre plus haut enrichissement pour le motif T-box dans le centre de sites de liaison zVegT, alors que le motif de liaison Smad2 / Smad3 canonique est peu enrichi. (F) de l&#39;histogramme montre les taux d&#39;occupation de l&#39;ADN de zVegT, qui sont calculées pour chaque gène cible de tous les pics (+/- 200 pb) entre 5 kb en amont [-]. et 1 kb en aval [+] de sites de départ de transcription correspondant (G) Top 300 gènes avec plus hauts niveaux d&#39;occupation de l&#39;ADN au sein de -5 kb et 1 kb sont enrichi pour les processus biologiques du développement embryonnaire précoce. Ceux-ci vont termes sont en ligne avec la fonction putative de zVegT. Le FDR est basée sur un test exact de Fisher bilatéral et corrigé pour les tests multiples. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

La question de savoir comment les organismes de réglementation et des états de la chromatine chromatine affecte le génome in vivo est essentielle à notre compréhension de la façon dont les premières décisions du destin cellulaire sont faites dans l&#39;embryon en développement. ChIP-Seq-la méthode la plus populaire pour étudier les caractéristiques de la chromatine au niveau-est globale définie ici pour les embryons de xénope.

Snapshot échelle du génome des régulateurs de la chromatine et les États dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryons par Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

L’objectif de cette procédure, communément appelée ChIP-seq, abréviation de Chromatin Immunoprecipitation, suivie d’un séquençage de nouvelle génération, est de déterminer l’emplacement à l’échelle du génome des régulateurs de la chromatine et des états de la chromatine dans l’embryon opus. Ceci est accompli en fixant d’abord les embryons zap et en liant ainsi de manière covalente les protéines associées à l’ADN au génome. Ensuite, les noyaux sont extraits et leur chromatine est solubilisée et partagée par sonication.À ce stade, la protéine d’intérêt liée à l’ADN est purifiée par immunoprécipitation et lavage extensif. La dernière étape consiste à créer une banque ChIP-seq indexée à partir des fragments d’ADN purifiés. En fin de compte, des millions de cinq premiers fragments de ces fragments d’ADN, appelés res, sont séquencés en parallèle, alignés sur le génome et étendus à la longueur moyenne des fragments.L’enrichissement local de ce que l’on appelle les pics est déterminé à identifier toutes les occupations d’ADN spécifiques au site de la protéine d’intérêt, et ainsi à élargir l’étude de ses caractéristiques à l’échelle du génome. Ainsi, ce protocole peut fournir des informations détaillées sur l’architecture de la chromatine à l’échelle du génome des embryons d’émeus. Il peut également être appliqué à d’autres organismes dont les génomes sont séquencés.Commençons par les embryons de l’acte. Les détails jusqu’à présent sont fournis dans le protocole texte. Transférez-les dans un flacon en verre de huit millilitres et lavez-les avec 0,01 XMMR.Après le lavage, fixez les embryons avec 1 % de para formaldéhyde et 0,01 XMMR. Laissez la solution durer au moins 15 à 40 minutes au maximum à température ambiante. Terminez la solution en lavant les embryons trois fois avec du 0,01 XMMR froid.Empêchez les embryons de toucher la surface de la solution car la tension superficielle entraînera une rupture. Une fois le fixateur emporté, faites des aliquotes de 250 embryons dans des micro-tubes à déchets. Ensuite, hypo pondérez autant de XMMR que possible et procédez à l’extraction de la chromatine pour faire une pause.Ici, égalisez les embryons dans 250 microlitres de tampon HEG froid. Une fois installés dans le tampon, les embryons peuvent être congelés dans de l’azote liquide et stockés à moins 80 degrés Celsius. Commencez par homogénéiser les embryons fixés dans E un tampon.Des détails sur la mise à l’échelle et la préparation de la mémoire tampon sont fournis dans le protocole texte. Centrifugeuse suivante. Les homogénats à quatre degrés Celsius aspirent et jettent le sate et remettent en suspension les granulés dans E un.Encore une fois, conservez l’échantillon sur de la glace pendant 10 minutes. Répétez la centrifugation et cette fois Reese, suspendez la palette en E deux. Attendez 10 minutes pendant que l’homogénat refroidit sur de la glace.Puis répétez la centrifugation à nouveau, et Reese suspendez la pastille en E trois. Cette fois, après avoir refroidi pendant encore 10 minutes, la suspension devrait apparaître assez transparente car à ce stade, le détergent onique rend la plupart des plaquettes de jaune restantes solubles. Maintenant, répétez la centrifugation. Andre.Suspendez les granulés dans un à trois millilitres de E trois. Si nécessaire, utilisez la dernière étape de centrifugation pour séparer toutes les pastilles des noyaux réticulés souhaités. Cette suspension contient également des granules de pigment et quelques plaquettes résiduelles du vitellin.Ces granules et les plaquettes vitellines seront séparés de la chromatine après sonication par centrifugation. Gardez maintenant l’échantillon sur de la glace et procédez à la fragmentation de la chromatine. Vous pouvez également prendre et congeler l’échantillon pour le stocker temporairement.Commencez par transférer l’échantillon de E trois dans un tube en polystyrène fabriqué sur mesure. Pour le sonique, fixez le tube à un bécher de 800 millilitres avec de l’eau glacée à l’aide d’une pince de thermomètre courte afin qu’il reste appelé pendant la sonication. Placez le bécher sur un cric et ajustez le cric de manière à ce que la pointe du sonique s’immerge aux deux tiers de l’échantillon.L’embout sonicate ne doit pas toucher la paroi du tube. Optimiser la sonication, en commençant par les paramètres préconisés par le fabricant de mon Sonic Sonicate 3000 équipé d’un micro embout conique de 16ème pouce sonicate sept minutes au total. 30 secondes à la fois entre les sonications.Laissez reposer l’échantillon pendant une minute. Commencez chaque sonication à une puissance de un et augmentez-la progressivement jusqu’à ce qu’elle soit comprise entre deux et quatre. Si l’échantillon commence à mousser, repositionnez le tube et laissez la mousse se dissiper avant de continuer Après la sonication, la chromatine est solubilisée et cisaillée.Transférez-le dans un pré-refroidissement de 1,5 millilitre dans des tubes à microdéchets et centrifugez-le à pleine vitesse. Pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, recueillir le SNA et le transférer dans des tubes de pré-refroidissement. Jetez la pastille.Utilisez 50 microlitres de SUP natant pour évaluer visuellement la fragmentation et conserver le reste pour l’immunoprécipitation. Commencez par transférer 10 à 30 microlitres de chromatine SUP dans un nouveau tube pour servir d’échantillon d’entrée. Ajoutez ensuite des anticorps de qualité puce à environ un microgramme par million de cellules à la chromatine restante.Incuber l’échantillon d’anticorps chromatiniens pendant la nuit, également à quatre degrés Celsius, mais avec une rotation de 10 tr/min. Le lendemain, lavez les billes magnétiques compatibles avec les anticorps en E 3 pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. En utilisant la concentration de billes suggérée par le fabricant au niveau des billes lavées pour l’anticorps Chromatine pré-incubée, incubez à quatre degrés Celsius avec rotation pendant quatre heures supplémentaires.Ensuite, à l’aide d’un tampon ripper réfrigéré, lavez les billes 10 fois. Utilisez l’aimant pendant 20 à 30 secondes pour séparer les billes entre les lavages. La solution doit être claire.Suivez les lavages du tampon ripper avec un lavage à l’aide d’un tampon 10 réfrigéré. Transférez ensuite les billes dans un petit volume de 10 tampons dans un nouveau tube. Séparez les billes et jetez le tampon résiduel.Pour détacher la chromatine immunoprécipitée. Reese a plié les billes dans 50 à 100 microlitres de tampon de solution SDS et vortex le tube avec un mélangeur thermique. Ensuite, centrifugez le tube à pleine vitesse pendant 30 secondes et récupérez le snat contenant l’éluat de chromatine immunoprécipité.Répétez la solution SDS, effectuez une étape et combinez tous les éluats. Procédez ensuite à l’extraction de l’ADN, au ChIP-seq, à la préparation de la banque et au séquençage de nouvelle génération comme décrit dans le protocole texte. Suite à ce protocole, la chromatine partagée montre une distribution asymétrique des fragments d’ADN, allant principalement de 100 à 1000 paires de bases et culminant entre 300 et 500 paires de bases. Un minimum de 50 picogrammes d’ADN immunoprécipité est nécessaire pour réussir à créer une bibliothèque d’indices N ChIP-seq appariés avec des inserts d’ADN de taille similaire.La bibliothèque devrait être en grande partie dépourvue de dimères adaptateurs, qui peuvent être vus sur l’électrophérogramme à environ 120 paires de bases. Le séquençage de la bibliothèque ChIP-seq réduit des millions de courtes séquences d’ADN, appelées lectures. Ceux-ci sont cartographiés sur le génome tandis que les lectures d’entrée s’alignent uniformément le long du génome.Les lectures de puces montrent des enrichissements spécifiques au brin qui flanquent la caractéristique chromatinienne d’intérêt. L’extension de l’alignement dans le sens de lecture à une taille de fragment moyenne réduit les profils précis des caractéristiques uniques de la chromatine telles que les événements de liaison au facteur de transcription. Ceux-ci apparaissent comme des pics dans un navigateur génomique, comme illustré ici pour le thé végétarien au stade de la liste gastro des embryons tropicaux de Zénon.Les expériences ChIP-seq permettent d’explorer les caractéristiques pangénomiques des caractéristiques de la chromatine, telles que les motifs de séquence d’ADN enrichis sous-jacents aux pics, ou l’analyse de l’ontologie génétique des cibles géniques, comme le montre ici, les interactions TDNA cartographiées après son développement. Cette méthode ouvre la voie aux chercheurs pour explorer le paysage embryonnaire de la chromatine, à la fois à l’échelle du génome, sous une très haute résolution.

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