Utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence pour examiner l’expression génique spécifique d’un type de cellule dans le tissu cérébral du rat

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des types de cellules neurales individuelles à partir de tissus cérébraux pour une analyse ultérieure. Ceci est accompli en dissociant d’abord le tissu neural en une suspension unicellulaire. Dans la deuxième étape, la myéline est retirée de la suspension, puis les cellules sont colorées pour les anticorps spécifiques au type de cellule.

Dans la dernière étape, les populations cellulaires individuelles sont triées par cytométrie en flux. En fin de compte, cette méthode d’isolement spécifique au type cellulaire permettra aux utilisateurs d’analyser les changements dans l’expression des gènes ou des protéines ou les modifications épigénétiques d’une manière spécifique au type cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que les types de cellules qui expriment certains récepteurs, qui expriment certaines protéines et celles qui expriment certaines modifications épigénétiques, afin que nous puissions mieux comprendre les mécanismes spécifiques aux types de cellules dans le cerveau.

Commencez la dissociation neurale en utilisant des lames de rasoir stériles pour découper chaque échantillon prélevé sur des tissus cérébraux adultes en petits morceaux de 30 à 400 milligrammes sur le couvercle d’une plaque de culture à six puits. Ensuite, plongez le tissu dans un millilitre de HBSS sans calcium ni magnésium et utilisez une pipette pour transférer les échantillons dans des tubes à centrifuger stériles de deux millilitres lorsque tous les tissus ont été prélevés. Centrifuger les échantillons et aspirer les surnageants.

Ajouter 1 900 microlitres d’enzyme chaude. Mélangez-en un et incubez les échantillons pendant 15 minutes. Dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, en inversant le tube plusieurs fois toutes les cinq minutes pour remettre en suspension les morceaux de tissu déposés.

À la fin de l’incubation, ajoutez 30 microlitres d’enzyme fraîchement préparée. Mélangez deux à chaque échantillon et retournez doucement les tubes. Ensuite, à l’aide d’une pipette antiparasitaire étiquetée, dissociez chaque échantillon avec 30 itérations de haut en bas.

En prenant soin d’éviter de générer des bulles. Incuber les échantillons pendant 15 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius avec inversion toutes les cinq minutes, suivie d’une dissociation des échantillons avec une pipette antiparasitaire. Deuxièmement, comme je viens de le démontrer.

Passez ensuite à la pipette numéro trois, répétez la dissociation et incubez les échantillons pendant 10 minutes de plus. Dans le bain-marie avec inversion toutes les cinq minutes à la fin de l’incubation, filtrez les suspensions unicellulaires à travers des crépines à cellules de 80 microns dans des tubes Falcon de 15 millilitres. En lavant chaque passoire avec 10 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium pour arrêter les réactions enzymatiques lorsque le dernier échantillon a été filtré, faites tourner les tubes et aspirez les surnageants pour épuiser la myéline de la cellule.

Les suspensions remettent complètement les granulés en suspension dans 400 microlitres de tampon d’élimination de la myéline et ajoutent la quantité appropriée de billes d’élimination de la myéline dans chaque tube. Pipetez les solutions de haut en bas jusqu’à ce que les cellules et les billes soient bien mélangées. Ensuite, incubez l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après l’incubation, lavez chaque échantillon dans cinq millilitres de tampon d’élimination de la myéline pendant que les cellules tournent, placez une colonne pour chaque échantillon dans le champ magnétique d’un trieur magnétique et placez un filtre propre de 80 microns sur chaque colonne. Rincez chaque filtre et chaque colonne avec un millilitre de tampon d’élimination de la myéline trois fois, en recueillant tout le débit dans un conteneur à déchets. Après le rinçage final, placez cinq tubes à fond rond en polystyrène d’un millilitre directement sous chaque colonne pour recueillir l’éluat.

Ensuite, aspirez le super nommé des échantillons et mettez les granulés en suspension dans 500 microlitres de tampon d’élimination de la myéline. Appliquez immédiatement les suspensions de cellules sur les colonnes, en recueillant les cellules dans les tubes situés en dessous. Rincez ensuite chaque filtre et colonne quatre fois avec un millilitre d’élimination de la myéline, tampon par lavage.

Après le dernier lavage, faites tourner les cellules et aspirez les surnageants pour colorer les cellules et les trier par cytométrie en flux. Vortex chaque échantillon pendant environ deux secondes pour dissocier les granules et transférer un microlitre de cellules de chaque tube dans des tubes individuels. Pour les contrôles de coloration, ajoutez immédiatement cinq microlitres de bloc FC dans chaque tube, y compris les contrôles de coloration.

Ensuite, vortex à nouveau les échantillons et incuber-les à quatre degrés Celsius. Après cinq minutes, ajoutez 100 microlitres du cocktail d’anticorps primaires approprié. Couvrez les tubes pour protéger les anticorps de la lumière et incubez les cellules à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

À la fin de l’incubation, lavez les échantillons dans deux millilitres de tampon de lavage, puis aspirez les surnageants et étiquetez chaque échantillon avec 100 microlitres de l’anticorps secondaire approprié. Couvrez les tubes et placez-les à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, lavez les échantillons dans deux millilitres de tampon de lavage, centrifugez les échantillons, puis aspirez.

Surnageants Resus, suspendez les pastilles dans 250 microlitres de PBS stérile et triez les cellules ici des populations représentatives de cellules neurales triées à partir d’un seul hippocampe mâle sont montrées que les cellules ont été protégées en premier de tous les événements possibles en fonction de leurs propriétés de diffusion directe et latérale. Ensuite, les cellules simples ou les singlets ont été séparés de tout doublet ou amas de cellules plus grands en fonction de leur taille pour permettre un tri précis des types de cellules individuelles, les cellules simples ont ensuite été triées en populations de cellules CD 11, B positives et CD 11 B négatives, avec un tri supplémentaire des cellules négatives CD 11 B en cellules GT un et TH un positives. Le programme d’analyse a ensuite permis de déterminer le nombre total d’événements dans chaque population ainsi que le pourcentage des populations parentales afin de confirmer la pureté des cellules triées.

Dans cet exemple particulier, l’expression génétique relative de gènes spécifiques à d’autres types de cellules a été analysée par PCR en temps réel. Comme prévu, ces données ont confirmé la pureté des cellules triées et identifié des différences intéressantes entre les régions cérébrales étudiées. Après confirmation de la pureté du type, l’expression d’autres gènes d’intérêt peut être mesurée pour déterminer le type cellulaire spécifique dans lequel ils sont exprimés, ou si leur expression est modifiée après un traitement spécifique au type cellulaire.

Par exemple, ici, l’expression de la liaison de la vache, une protéine de liaison au calcium souvent utilisée pour identifier les neurones de l’hippocampe et du cervelet, a été étudiée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler des types spécifiques de cellules neurales d’intérêt, tels que la cellule neurale montrée ici à l’aide d’anticorps de surface cellulaire appropriés.