Name: Utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence pour examiner l’expression génique spécifique d’un type de cellule dans le tissu cérébral du rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Apprenez le tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler des types cellulaires neuronaux spécifiques dans le tissu cérébral du rat. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique spécifique à chaque population cellulaire.

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Les auteurs tiennent à remercier Lynn Opdenaker du Centre de recherche translationnelle de l’Université du Delaware au Centre de cancérologie Helen F. Graham pour son assistance technique, ainsi que Nancy Martin de la ressource partagée de cytométrie en flux de l’Institut du cancer de l’Université Duke, et la Dre Susan H. Smith pour ses conseils en matière de méthodes et de collecte de données.

1. Préparation pour le prélèvement de tissus (15 – 30 min)
<ol>
	<li>Polir au feu trois jeux de pipettes Pasteur en verre de diamètres décroissants et les numéroter « 1 » = environ 1 mm de diamètre, « 2 » = environ 0,75 mm de diamètre et « 3 » = environ 0,50 mm de diamètre.</li>
	<li>Remettre en suspension l’enzyme A lyophilisée avec la totalité du tampon A selon le protocole fourni avec le kit de dissociation neurale (voir tableau des matériaux). Ne faites pas de vortex. Aliquote la solution en aliquotes de 50 μl et stockez-la à -20 ºC pour une utilisation ultérieure.</li>
	<li>Fabriquer 1 L de tampon d’élimination de la myéline et de filtre à vide pour la stérilisation [tampon d’élimination de la myéline = 1 000 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,1 M, 2 ml d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 500 mM et 10 g d’albumine sérique bovine (BSA)].</li>
	<li>Coupez la feuille de maille de nylon en petits carrés de 1 x 1 pouce (2,5 x 2,5 cm) qui seront utilisés pour filtrer les débris cellulaires et l’autoclave dans un petit bécher recouvert de papier d’aluminium.</li>
	<li>Préparez 1 L de tampon de lavage [tampon de lavage = 1 000 ml de PBS 0,1 m, 2 ml d’EDTA 500 mM et 10 g de BSA].</li>
</ol>
2. Prélèvement de tissus
<ol>
	<li>Allumez le bain-marie à 37 ºC.</li>
	<li>Préparez le tampon X à partir du kit de dissociation neurale en ajoutant du bêta-mercaptoéthanol au tampon X jusqu’à une concentration finale de 0,067 mM (pour 4 échantillons, ajoutez 13,5 μl de 50 mM de bêta-mercaptoéthanol à 10 ml de tampon X).</li>
	<li>Préparez le mélange enzymatique 1 en mélangeant 50 μl d’enzyme P avec 1 900 μl de tampon X pour chaque échantillon, comme décrit dans le protocole du kit de dissociation neurale. Par exemple, pour 4 échantillons, mélangez 200 μl d’enzyme P avec 7 600 μl de tampon X.</li>
	<li>Placez le tampon X dans le bain-marie à 37 ºC.</li>
	<li>Placez 2 ml de solution saline tamponnée de Hank’s (HBSS) froide (sans Ca++ ni Mg++) dans un puits d’une plaque de culture stérile à 6 puits pour chaque échantillon qui sera prélevé et conservez-le sur de la glace pour la dissection tissulaire.</li>
</ol>
3. Dissection tissulaire (45 min – 1 h)
<ol>
	<li>Injectez à l’animal le volume approprié de solution d’euthanasie (solution commerciale de barbituriques, par exemple Euthasol), conformément aux directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), et perfuser tout le sang avec une solution saline froide à 0,9 %.
	<ol>
		<li>Administrez à des rats une surdose de solution d’euthanasie.</li>
		<li>Surveillez l’anesthésie par la respiration et par pincement des orteils. Lorsque l’animal est suffisamment anesthésié (pas de réponse au pincement des orteils et respiration profonde et lente), le rat peut être perfusé.</li>
		<li>Pour perfuser le rat, ouvrez la cavité thoracique avec une paire de ciseaux robustes. Coupez le diaphragme pour permettre l’accès jusqu’au cœur. Coupez les côtes des deux côtés vers le haut de la poitrine, pour permettre un accès complet au cœur. À ce stade, la cage thoracique peut être maintenue sur le côté à l’aide d’une paire d’hémostatiques.</li>
		<li>Effectuez la perfusion cardiaque en insérant une aiguille de 18 G (pour les rats adultes) attachée à une pompe électrique dans le ventricule gauche du cœur. La pompe aspire une solution saline froide à 0,9 %.</li>
		<li>Ensuite, ouvrez l’oreillette droite avec une petite paire de ciseaux pour permettre au perfusat de sang et de liquide de s’écouler du corps.</li>
		<li>Perfuser les rats avec environ 10 ml (pour les rats adultes) de solution saline à 0,9 % pour éliminer toutes les cellules et facteurs immunitaires périphériques.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Disséquez la partie souhaitée de la région du cerveau à l’aide de lames de rasoir stériles et d’une dissection appropriée, puis placez les morceaux de tissu dans le HBSS froid sans Ca2+ et Mg2+. 
	REMARQUE : Le protocole exige une HBSS sans Ca2+ et Mg2+ dans les premières étapes du protocole, car ces ions peuvent interférer avec les enzymes nécessaires à la dissociation neurale.</li>
	<li>Une fois que tous les échantillons de tissus ont été prélevés, retournez à la paillasse propre ou à la hotte de culture stérile pour le traitement des tissus.</li>
</ol>
4. Dissociation neuronale (1 h)
<ol>
	<li>Coupez chaque échantillon de tissu en petits morceaux à l’aide de lames de rasoir stériles sur le couvercle de la plaque de culture à 6 puits. Ce protocole a été utilisé pour des échantillons de tissus d’environ 30 à 100 mg, mais il est approuvé pour des échantillons de tissus allant jusqu’à 400 mg. Pour les échantillons de tissus de plus de 400 mg, les volumes de réactifs doivent être augmentés de manière appropriée.</li>
	<li>À l’aide de 1 ml de HBSS frais sans Ca2+ et Mg2+, transférez les morceaux de tissu coupés en dés à l’aide d’une pipette dans un tube à centrifuger stérile de 2 ml. Répétez les étapes 4.1 et 4.2 pour tous les échantillons jusqu’à ce que tous les échantillons aient été transférés dans un tube à centrifuger de 2 ml.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 2 min à RT et aspirer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 1 900 μl d’Enzyme Mix 1 chaud, tel que préparé aux étapes 2.2 et 2.3, à chaque échantillon et fermer les tubes.</li>
	<li>Incuber les échantillons pendant 15 minutes dans le bain-marie à 37 ºC, en inversant les tubes plusieurs fois toutes les 5 minutes pour remettre en suspension les morceaux de tissu déposés.</li>
	<li>Pendant ce temps, préparez le mélange d’enzymes 2 en mélangeant 20 μl de tampon Y avec 10 μl d’enzyme A décongelée (pour 4 échantillons, mélangez 80 μl de tampon Y avec 40 μl d’enzyme A décongelée).</li>
	<li>Ajouter 30 μl d’Enzyme Mix 2 à chaque échantillon et retourner doucement. Ne faites pas de vortex.</li>
	<li>Dissocier chaque échantillon de tissu à l’aide de la pipette Pasteur « 1 », en triturant de haut en bas 30 fois.</li>
	<li>Incuber les échantillons pendant 15 minutes dans le bain-marie à 37 ºC ; retourner les tubes plusieurs fois toutes les 5 minutes pour remettre en suspension les morceaux de tissu déposés.</li>
	<li>Dissocier chaque échantillon de tissu à l’aide de la pipette Pasteur « 2 », en triturant 30 fois de haut en bas. Évitez de générer des bulles.</li>
	<li>Dissocier chaque échantillon de tissu à l’aide de la pipette Pasteur « 3 » en triturant 30 fois de haut en bas. Évitez de générer des bulles.</li>
	<li>Incuber les échantillons pendant 10 min dans le bain-marie à 37 ºC ; retourner les tubes plusieurs fois toutes les 5 min pour remettre en suspension les cellules décantées.</li>
	<li>Appliquez une suspension unicellulaire sur une souche cellulaire de 80 microns placée sur un tube de faucon de 15 ml pour éliminer tous les gros débris et lavez le filtre et les cellules avec 10 ml de HBSS (avec Ca2+ et Mg2+) pour arrêter les réactions enzymatiques. Répétez l’opération jusqu’à ce que chaque échantillon soit transféré dans un tube faucon propre de 15 ml.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 10 min à RT et aspirer le surnageant.</li>
</ol>
5. Épuisement de la myéline (45 min)
<ol>
	<li>Remettez soigneusement en suspension la pastille de cellules avec 400 μl de tampon d’élimination de la myéline.</li>
	<li>Ajoutez la quantité spécifiée de billes d’élimination de la myéline et pipetez de haut en bas pour bien mélanger. 
	REMARQUE : Le volume de billes d’élimination de la myéline utilisé dépendra de la taille du tissu, de l’âge de l’animal et de la quantité de myéline attendue dans cette région particulière du cerveau. Par exemple, pour un échantillon d’hippocampe de rat adulte (environ 300 mg), incubez l’échantillon avec 100 μl de billes d’élimination de la myéline.
	
</li>
	<li>Incuber 15 min au réfrigérateur à 4 ºC.</li>
	<li>Lavez chaque échantillon avec 5 ml de tampon d’élimination de la myéline.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 10 min à RT.</li>
	<li>Pendant la centrifugation des échantillons, placez 1 colonne pour chaque échantillon dans le champ magnétique du trieur magnétique et placez un filtre propre de 80 microns sur chaque colonne.</li>
	<li>Préparez les colonnes et filtrez en rinçant chaque colonne avec 1 ml de tampon d’élimination de la myéline, 3 fois (3 ml au total). Recueillez tout le flux dans un conteneur à déchets, comme le fond d’une boîte à pourboires vide.</li>
	<li>Placez un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml directement sous chaque colonne en préparation du prélèvement de l’échantillon.</li>
	<li>Lorsque les cellules ont terminé la centrifugation, aspirer le surnageant et le remettre complètement en suspension dans 500 μl de tampon d’élimination de la myéline. Appliquez immédiatement une suspension cellulaire sur la colonne et collectez les cellules dans le tube situé en dessous.</li>
	<li>Lavez le filtre et la colonne avec 1 ml de tampon d’élimination de la myéline, 4 fois (4 ml au total).</li>
	<li>Centrifuger la collection de cellules à 300 x g pendant 10 min à RT.</li>
	<li>Aspirez le surnageant et les cellules sont maintenant prêtes pour la coloration.</li>
</ol>
6. Coloration des cellules vivantes pour FACS (1 heure pour la coloration)
<ol>
	<li>Tourbillonnez brièvement (2 sec) les cellules pour séparer la pastille et ajoutez immédiatement 5 μl de bloc Fc (anti-clusters de différenciation 32, CD32), vortex à nouveau, et incubez au réfrigérateur à 4 ºC pendant 5 min.</li>
	<li>Pendant ce temps, préparez le mélange d’anticorps primaires en ajoutant les trois anticorps primaires dans le tampon de lavage comme suit : 0,125 μl d’anticorps CD11b conjugué à l’allophycocyanine (APC) (1:800), 1 μl d’anticorps anti-GLT1 (1:100) et 0,4 μl d’anticorps conjugué Thy1 isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (1:250) pour chaque 100 μl de tampon de lavage. Chaque échantillon recevra 100 μl de mélange d’anticorps primaires pour l’incubation ; Cependant, si votre échantillon est beaucoup plus grand que 400 mg de tissu, vous voudrez peut-être envisager d’augmenter le volume de votre mélange d’anticorps primaires en conséquence</li>
	<li>Préparez des tubes pour des contrôles de coloration unique en retirant seulement 2 μl de cellules de chaque tube d’échantillon et en les ajoutant à chaque tube de contrôle de coloration unique. Les témoins « à coloration unique » comprennent : APC-CD11b uniquement, GLT1 uniquement, FITC-Thy1 uniquement, anticorps secondaires PE uniquement et le contrôle « blanc » ou non coloré. 
	REMARQUE : Tous les échantillons doivent être représentés dans tous les contrôles de coloration, donc 2 μl de cellules de chaque échantillon doivent être ajoutés à chaque tube de contrôle de coloration.</li>
	<li>Agitez brièvement les tubes (2 secondes) et ajoutez 100 μl de mélange d’anticorps primaires dans chaque tube d’échantillon et 100 μl d’anticorps primaires appropriés dans chaque tube de contrôle de coloration, agitez à nouveau les tubes, couvrez les tubes avec une feuille d’aluminium pour protéger les anticorps fluorescents de toute lumière, et incubez les tubes au réfrigérateur à 4 ºC pendant 20 min. Les échantillons doivent être conservés au frais (à 4 ºC) pour le reste de la procédure afin de maintenir l’intégrité des échantillons et des anticorps.</li>
	<li>Agitez brièvement les tubes et ajoutez 2 ml de tampon de lavage dans chaque tube.</li>
	<li>Tubes de centrifugation à 350 x g pendant 5 min à 4 ºC.</li>
	<li>Pendant ce temps, préparez le mélange d’anticorps secondaires en ajoutant 0,2 μl d’anticorps secondaire anti-lapin conjugué au PE pour 100 μl de tampon de lavage. Chaque échantillon recevra 100 μl de mélange d’anticorps secondaires ; Cependant, si votre échantillon est beaucoup plus grand que 400 mg de tissu, vous voudrez peut-être envisager d’augmenter le volume de votre mélange d’anticorps primaires en conséquence.</li>
	<li>Une fois la centrifugation terminée, versez le surnageant de chaque échantillon dans l’évier et épongez les tubes à l’envers sur une serviette en papier.</li>
	<li>Agitez brièvement les tubes et ajoutez 100 μl de mélange d’anticorps secondaires dans chaque tube d’échantillon et l’anticorps secondaire approprié à chaque contrôle de coloration, agitez à nouveau les tubes, couvrez les tubes de papier d’aluminium et incubez les tubes au réfrigérateur à 4 ºC pendant 15 min 
	REMARQUE : Le tube de contrôle de coloration GLT1 uniquement doit recevoir le mélange d’anticorps secondaire.
	
</li>
	<li>Après l’incubation, agitez brièvement les tubes et ajoutez 2 ml de tampon de lavage dans chaque tube.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 350 x g pendant 5 min à 4 ºC.</li>
	<li>Une fois la centrifugation terminée, versez le surnageant de chaque échantillon dans l’évier et épongez les tubes à l’envers sur une serviette en papier.</li>
	<li>Agitez les tubes et ajoutez 0,25 ml de PBS stérile dans chaque tube. Les échantillons sont prêts à être triés. 
	REMARQUE : Plus de cellules peuvent nécessiter 0,5 ml de PBS stérile ; Cependant, il est préférable de commencer avec un volume plus faible car l’échantillon peut toujours être dilué s’il est trop concentré avec des cellules. 
	REMARQUE : Ajoutez éventuellement de la DNase dans le tube pour éviter l’agglutination des cellules et donc le colmatage du trieur. Les échantillons peuvent également être filtrés à l’aide d’un filtre stérile de 80 microns juste avant le tri afin d’éviter d’obstruer le trieur.
	
</li>
	<li>Apportez les cellules au trieur sur de la glace. Collectez les populations cellulaires dans des tubes à centrifuger sans nucléases de 2 ml avec 0,5 ml de PBS stérile dans chaque tube.</li>
	<li>Après le tri, faites tourner les cellules à 300 x g pendant 2 min à 4 ºC. Aspirez la majeure partie du PBS et congelez les cellules dans le congélateur à -80 ºC jusqu’à ce qu’elles soient traitées pour l’extraction de l’ARN (voir 1 pour plus de détails sur le protocole), l’extraction de l’ADN (voir 2 pour plus de détails sur le protocole) ou la lyse cellulaire pour l’analyse des protéines.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

À l’instar de nombreux autres tissus et systèmes, le cerveau est composé d’une population cellulaire hétérogène qui fonctionne ensemble pour influencer le comportement. L’analyse de l’expression génique, de l’expression protéique ou des modifications épigénétiques à partir de cellules individuelles au sein de cette population hétérogène a le potentiel de révéler des informations sur la fonction du système dans son ensemble, d’identifier les processus cellulaires régulant à la fois le comportement normal et les processus ...

Le but du protocole décrit ci-dessous est d’isoler des types de cellules individuels à partir d’une population hétérogène de tissu neural pour l’analyse ultérieure de l’expression génique spécifique au type de cellule, de l’expression des protéines ou même des marqueurs épigénétiques. Le cerveau est composé de nombreux types de cellules dérivées de cellules progénitrices distinctes et qui ont des propriétés et des fonctions spécifiques au type de cellule. Malgré ces différences, ces types de cellules neurales distincts peuvent exprimer des récepteurs et des molécules de signalisation intracellulaire similaires, ce qui rend l’analyse de ces protéines plus omniprésentes difficile à mesurer ou à interpréter d’une manière spécifique au type de cellule à l’aide des méthodes conventionnelles. Les neuroscientifiques doivent identifier la fonction et l’activation de ces types de cellules distincts dans le cerveau et comment ils peuvent avoir un impact individuel sur le comportement, car ce sera finalement la première étape vers l’identification de médicaments et de cibles thérapeutiques plus spécifiques pour les maladies neurologiques et neuropsychiatriques. Malgré cet objectif primordial de la recherche en neurosciences, il peut être difficile d’isoler des types de cellules neurales individuelles du cerveau pour l’analyse de l’expression de gènes ou de protéines, l’activation de molécules de signalisation ou la modification de marqueurs épigénétiques sur l’ADN. Parmi les techniques actuellement utilisées, l’immunohistochimie peut identifier l’expression des protéines d’une manière spécifique au type de cellule lorsqu’elle est combinée à une coloration supplémentaire d’un marqueur spécifique au type de cellule, bien que cela repose sur des anticorps spécifiques qui peuvent correctement colorer les protéines d’intérêt et qu’il puisse être difficile à quantifier. L’hybridation in situ permet d’identifier la localisation spécifique de l’acide ribonucléique messager (ARNm) dans les cellules individuelles du cerveau, mais il s’agit d’un processus laborieux qui limite également la co-analyse de types cellulaires spécifiques et ne permet l’analyse que d’un ou peut-être de quelques gènes d’intérêt. La micro-dissection par capture laser utilise un laser pour isoler des sous-populations de cellules qui sont visualisées par microscopie ; cependant, la nature chronophage de ce processus et le rendement relativement faible peuvent limiter considérablement l’analyse ultérieure des niveaux de protéines ou d’ARNm, en particulier si l’expression de ces molécules est faible au départ. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est une technique relativement nouvelle dans le domaine des neurosciences pour isoler des types de cellules individuelles du cerveau en vue d’une analyse ultérieure de l’expression génique1 et/ou des cibles épigénétiques2. Ce processus peut également être utilisé pour trier des types spécifiques de cellules neurales afin d’analyser ultérieurement l’expression génique spécifique au type de cellule, l’expression des protéines ou les marqueurs épigénétiques. Le FACS est utilisé dans un certain nombre de domaines de recherche médicale tels que le cancer et l’immunologie depuis des décennies pour compter et trier différentes cellules en fonction de caractéristiques physiques ou biochimiques3. De plus, la cytométrie en flux a été classiquement utilisée pour analyser l’expression des protéines sur une base cellulaire, à l’aide d’anticorps spécifiques. La procédure décrite ci-dessous tire parti des techniques classiques de cytométrie en flux pour isoler des types de cellules individuels en vue d’une analyse ultérieure des paramètres de biologie moléculaire. Le cytomètre en flux peut analyser plusieurs milliers de cellules en une seconde, ce qui en fait une alternative rapide et efficace aux techniques décrites ci-dessus. De plus, les cellules peuvent être isolées sur la base de l’expression cellulaire d’une protéine spécifique (par exemple un récepteur de neurotransmetteur) ou d’une combinaison de deux protéines ou plus (colocalisation de plusieurs protéines dans un type de cellule spécifique). Cela permet à l’utilisateur d’isoler des types de cellules neurales très sélectifs en fonction de leurs propriétés moléculaires afin d’identifier leur fonction dans le cerveau.
Pour effectuer un FACS, les cellules neurales sont préparées en une suspension unicellulaire qui passe à travers une cellule d’écoulement qui porte et aligne les cellules de sorte qu’elles passent en file indienne à travers un faisceau lumineux et des lasers pour l’analyse. Un ordinateur acquiert les données de chaque cellule et les trace sur un histogramme pour l’analyse de paramètres spécifiés (taille, granularité et fluorescence). Sur la base de ces paramètres, les cellules peuvent être immédiatement triées dans des tubes séparés pour leur mémorisation et leur analyse ultérieure de tout point final souhaité. Le protocole décrit ci-dessous utilise trois anticorps pour trier les neurones (à l’aide d’un anticorps antigène 1 et d’un anticorps Thy1), les astrocytes (à l’aide d’un transporteur glial de glutamate, l’anticorps GLT1) et la microglie (à l’aide d’un groupe de molécules de différenciation 11B, anticorps CD11b). Ce protocole peut être utilisé comme décrit ci-dessous ou modifié avec différents anticorps en fonction du type de cellule que l’on souhaite isoler pour ses propres expériences.
Il y a quelques mises en garde à prendre en compte pour déterminer si ce protocole est approprié pour des expériences spécifiques. Une mise en garde majeure peut concerner le type de cellule spécifique que l’on souhaite isoler. Dans ce protocole, les trois anticorps utilisés sont des anticorps extracellulaires, qui permettent à l’expérimentateur de garder les types de cellules intacts pendant la procédure de coloration, préservant ainsi l’intégrité de l’ARN, de l’ADN et des protéines à l’intérieur. Il est possible que l’on veuille isoler un type spécifique de cellules neurales à l’aide d’un anticorps qui identifie une protéine qui n’est exprimée qu’à l’intérieur de cette cellule particulière. Par exemple, on pourrait vouloir isoler les neurones dopaminergiques à l’aide d’un anticorps contre la tyrosine hydroxylase ou isoler les neurones acétylcholine à l’aide d’un anticorps contre la choline acétyltransférase. Ces protéines sont intracellulaires et nécessiteraient donc la fixation et la perméabilisation de la membrane cellulaire pour une coloration ultérieure avec les anticorps appropriés. Bien que cela ait été fait avant 4,5, ce processus peut diminuer considérablement le rendement de l’ARN ou de l’ADN de ces cellules perméabilisées. Une autre mise en garde peut être que tous les anticorps ne sont pas appropriés pour le FACS. Par exemple, on peut actuellement utiliser un anticorps qui fonctionne très bien pour le western blot, une technique qui nécessite la dénaturation des protéines. Cet anticorps n’est pas nécessairement adapté à l’identification de ces types de cellules à l’aide de FACS, étant donné que les protéines ne sont dénaturées à aucun moment de ce protocole et que l’anticorps peut donc n’avoir aucun moyen de se lier à son antigène inhérent. Les entreprises fournissent des fiches techniques qui identifient les applications pour lesquelles un anticorps a été approuvé. Si un anticorps n’a pas été approuvé pour la cytométrie en flux, cela ne devrait pas décourager quelqu’un d’essayer ce protocole avec un anticorps particulier ; cependant, il faut savoir qu’il n’est pas garanti de fonctionner pour FACS. Une troisième mise en garde de ce protocole concerne le nombre de cellules que l’on essaie d’isoler. Le FACS est une excellente technique pour produire le plus de cellules possible à partir d’un petit morceau de tissu, mais il est également possible que si l’on souhaite isoler une population relativement clairsemée de cellules d’une région cérébrale relativement petite, le rendement d’un seul animal soit intrinsèquement faible. Dans ce cas, il peut être nécessaire de regrouper le tissu cérébral de quelques animaux du même groupe de traitement afin d’obtenir le nombre de cellules nécessaires à l’analyse ultérieure ; cependant, une publication récente a utilisé la pré-amplification de l’ADNc ciblée sur les gènes pour l’analyse ultérieure de l’expression génique d’un petit nombre de neurones activés (5-6 %) à partir d’un plus grand ensemble de neurones triés, indiquant qu’il est possible d’analyser l’expression génique même de petits sous-ensembles de cellules neurales sans regrouper un grand nombre d’animaux6Une dernière mise en garde de cette technique est que l’on devrait avoir accès à un trieur de cellules qui n’est pas trop loin. Le trieur de cellules est une machine compliquée qui nécessite une formation importante afin de l’utiliser correctement. Ainsi, ces machines sont souvent exploitées par un technicien qualifié dans une installation centrale. De plus, le but de cette procédure est de dissocier le tissu neural, de le colorer pour des anticorps spécifiques et d’apporter immédiatement ces échantillons à un trieur dans un court laps de temps (peut-être une demi-journée). Ce délai permettra d’augmenter la survie et le rendement des cellules isolées et de maintenir l’intégrité des cellules pour le traitement et l’analyse ultérieurs. Si tous les paramètres décrits ci-dessus sont remplis, le FACS est une excellente méthode pour analyser l’expression spécifique des gènes et des protéines du tissu neural.
Toutes les expériences ont été réalisées conformément au Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Delaware et au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

<table><tbody><tr><td>Kit de Dissociation Neuronale (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Billes d’Élimination de la Myéline II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-733</td><td></td></tr><tr><td>LS Colonnes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Feuille de maille de nylon</td><td>Amazon</td><td>CMN-0074-10YD</td><td>40 pouces de largeur, maille de taille 80 microns</td></tr><tr><td>Fc Block / anti-CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB550270</td><td>réactivité pour le rat</td></tr><tr><td>APC Anticorps CD11b conjugué</td><td>Biolegend</td><td>201809</td><td>pour le rat</td></tr><tr><td>Lapin anti-GLT1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-20136</td><td>réactivité pour le rat ou l’homme</td></tr><tr><td>conjugué PE anti-lapin anticorps secondaire</td><td>eBioscience</td><td>1037259</td><td>anticorps secondaire contre l’anticorps anti-rat</td></tr><tr><td>CD90 (Thy1) anti-rat conjugué à la GLT1 (FITC)</td><td>Biolegend</td><td>202504</td><td>réactivité chez le rat</td></tr></tbody></table>

utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence pour examiner l’expression génique spécifique d’un type de cellule dans le tissu cérébral du rat

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Le cerveau est composé de quatre types de cellules primaires, à savoir les neurones, les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Bien qu’ils ne soient pas le type de cellule le plus abondant dans le cerveau, les neurones sont les plus étudiés de ces types de cellules en raison de leur rôle direct dans l’impact sur les comportements. D’autres types de cellules dans le cerveau ont également un impact sur la fonction neuronale et le comportement via les molécules de signalisation qu’ils produisent. Les neuroscientifiques doivent comprendre les interactions entre les types de cellules dans le cerveau pour mieux comprendre comment ces interactions affectent la fonction neuronale et la maladie. À ce jour, la méthode la plus courante d’analyse de l’expression des protéines ou des gènes utilise l’homogénéisation d’échantillons de tissus entiers, généralement avec du sang, et sans tenir compte du type de cellule. Cette approche est une approche informative pour examiner les changements généraux dans l’expression des gènes ou des protéines qui peuvent influencer la fonction neuronale et le comportement ; Cependant, cette méthode d’analyse ne se prête pas à une meilleure compréhension de l’expression génique spécifique au type de cellule et de l’effet de la communication de cellule à cellule sur la fonction neuronale. L’analyse de l’épigénétique comportementale est un domaine d’intérêt croissant qui examine comment les modifications de la structure de l’acide désoxyribonucléique (ADN) affectent l’expression et le comportement des gènes à long terme ; Cependant, ces informations ne peuvent être pertinentes que si elles sont analysées d’une manière spécifique au type de cellule, compte tenu de la lignée différentielle et donc des marqueurs épigénétiques qui peuvent être présents sur certains gènes de types de cellules neurales individuelles. La technique de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) décrite ci-dessous fournit un moyen simple et efficace d’isoler des cellules neurales individuelles pour l’analyse ultérieure de l’expression des gènes, de l’expression des protéines ou des modifications épigénétiques de l’ADN. Cette technique peut également être modifiée pour isoler des types de cellules neurales plus spécifiques dans le cerveau en vue d’une analyse ultérieure spécifique au type de cellule.

L'importance de l'appauvrissement en myéline et de la perfusion tissulaire
Figure 1 illustre l'importance de l'élimination de la myéline. La suppression de la myéline (étapes 5.1 à 5.12 du protocole ci-dessus) se produit lorsque la suspension unicellulaire est incubée avec les billes d'élimination de la myéline, lavée, puis passée à travers la colonne du trieur magnétique. L'objectif de ces étapes est de réduire la quantité de débris cellulaires présents dans chaque échantillo...

L’objectif de ce protocole est d’utiliser la technique de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour trier des types spécifiques de cellules neurales en vue d’une analyse ultérieure de l’expression génique spécifique au type de cellule, des marqueurs épigénétiques et/ou de l’expression des protéines.

Utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence pour examiner l’expression génique spécifique d’un type de cellule dans le tissu cérébral du rat

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des types cellulaires neuronaux individuels à partir de tissu cérébral en vue d'une analyse ultérieure. Cela est réalisé en dissociant d'abord le tissu neural en une suspension monocellulaire. Dans une deuxième étape, la myéline est éliminée de la suspension, puis les cellules sont marquées par des anticorps spécifiques du type cellulaire.Dans la dernière étape, les populations cellulaires individuelles sont triées par cytométrie en flux. En fin de compte, cette méthode d'isolement spécifique aux types cellulaires permettra aux utilisateurs d'analyser les modifications de l'expression des gènes ou des protéines, ou encore les modifications épigénétiques, de manière spécifique à chaque type cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que quels types cellulaires expriment certains récepteurs, quels types expriment certaines protéines et quels types présentent certaines modifications épigénétiques, afin que nous puissions mieux comprendre les mécanismes spécifiques aux types cellulaires dans le cerveau.Commencez la dissociation neuronale en utilisant des lames de rasoir stériles pour découper chaque échantillon prélevé à partir de tissus cérébraux adultes en petits morceaux de 30 à 400 milligrammes sur le couvercle d'une plaque de culture à six puits. Ensuite, immergez le tissu dans un millilitre de HBSS sans calcium ni magnésium et utilisez une pipette pour transférer les échantillons dans des tubes de centrifugation stériles de deux millilitres une fois que tous les tissus ont été collectés. Centrifugez les échantillons et aspirez les surnageants.Ajouter 1 900 microlitres d'enzyme tiède. Mélanger une fois et incuber les échantillons pendant 15 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, en inversant le tube plusieurs fois toutes les cinq minutes pour resuspendre les fragments de tissu sédimentés.À la fin de l'incubation, ajouter 30 microlitres d'enzyme fraîchement préparée. Mélanger deux fois chaque échantillon en retournant doucement les tubes. Puis, à l'aide d'une pipette Pasteur étiquetée un, dissocier chaque échantillon par 30 mouvements verticaux ascendants et descendants.En prenant soin d'éviter la formation de bulles. Incuber les échantillons pendant encore 15 minutes à 37 degrés Celsius avec inversion toutes les cinq minutes, puis dissocier les échantillons à l'aide de la pipette à piston numéro deux, comme vient d'être démontré.Ensuite, passez à la pipette numéro trois, répétez la dissociation et incubez les échantillons pendant encore 10 minutes. Dans le bain-marie, effectuez un retournement toutes les cinq minutes ; à la fin de l'incubation, filtrez les suspensions monocellulaires à travers des tamis cellulaires de 80 microns dans des tubes Falcon de 15 millilitres. Après filtration du dernier échantillon, rincez chaque tamis avec 10 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium pour arrêter les réactions enzymatiques, centrifugez les tubes puis aspirez les surnageants afin d'éliminer la myéline des cellules.Les suspensions redispersent complètement les culots dans 400 microlitres de tampon de retrait de la myéline, puis ajoutent la quantité appropriée de billes de retrait de la myéline à chaque tube. Pipeter les solutions vers le haut et vers le bas jusqu'à ce que les cellules et les billes soient complètement mélangées. Incuber ensuite l'échantillon à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.Après l'incubation, laver chaque échantillon dans cinq millilitres de tampon de retrait de la myéline pendant que les cellules sont en centrifugation, placer une colonne pour chaque échantillon dans le champ magnétique d'un séparateur magnétique et poser un filtre neuf de 80 microns sur le dessus de chaque colonne. Rincer chaque filtre et chaque colonne trois fois avec un millilitre de tampon de retrait de la myéline, en récupérant tout l'écoulement dans un récipient de déchets. Après le dernier rinçage, placer des tubes ronds en polystyrène de cinq millilitres directement sous chaque colonne afin de recueillir l'éluate.Ensuite, aspirez le surnageant des échantillons et resuspendez les culots dans 500 microlitres de tampon de retrait de la myéline. Appliquez immédiatement les suspensions cellulaires sur les colonnes, en récupérant les cellules dans les tubes situés en dessous. Rincez ensuite chaque filtre et chaque colonne quatre fois avec un millilitre de tampon de retrait de la myéline par lavage.Après le dernier lavage, centrifuger les cellules et aspirer les surnageants pour colorer les cellules en vue de leur tri par cytométrie en flux. Vortexer chaque échantillon pendant environ deux secondes afin de dissocier les culots, puis transférer un microlitre de cellules de chaque tube dans des tubes individuels. Pour les témoins de coloration, ajouter immédiatement cinq microlitres de blocage FC à chaque tube, y compris aux témoins de coloration.Ensuite, vortexer à nouveau les échantillons et les incuber à quatre degrés Celsius. Après cinq minutes, ajouter 100 microlitres du cocktail d'anticorps primaires approprié. Couvrir les tubes pour protéger les anticorps de la lumière et incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.À la fin de l'incubation, laver les échantillons dans deux millilitres de tampon de lavage, puis aspirer les surnageants et étiqueter chaque échantillon avec 100 microlitres d'anticorps secondaire approprié. Couvrir les tubes et les placer à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Laver ensuite les échantillons dans deux millilitres de tampon de lavage, centrifuger les échantillons, puis aspirer le surnageant.Supernatants Resus, suspendre les culots dans 250 microlitres de PBS stérile et trier les cellules ; ici, des populations représentatives de cellules neuronales triées en flux provenant d'un hippocampe mâle unique sont présentées. Les cellules ont d'abord été sélectionnées parmi tous les événements possibles en fonction de leurs propriétés de diffusion avant et latérale. Ensuite, les cellules uniques, ou « singulets », ont été sélectionnées en excluant les doublets ou agrégats cellulaires plus gros en se basant sur leur taille, afin de permettre un tri précis des types cellulaires individuels. Les cellules uniques ont ensuite été triées en populations cellulaires CD 11B positif et CD 11B négatif, avec un tri supplémentaire des cellules CD 11B négatif en cellules GT1 et TH1 positives. Le programme d'analyse a ensuite été utilisé pour déterminer le nombre total d'événements dans chaque population ainsi que le pourcentage par rapport aux populations parentes, afin de confirmer la pureté des cellules triées.Dans cet exemple particulier, l'expression génique relative de gènes spécifiques à différents types cellulaires a été analysée par PCR en temps réel. Comme prévu, ces données ont confirmé la pureté des cellules triées et permis d'identifier certaines différences intéressantes entre les régions cérébrales étudiées. Après confirmation de la pureté du tri, l'expression d'autres gènes d'intérêt peut être mesurée afin de déterminer le type cellulaire spécifique dans lequel ils sont exprimés, ou si leur expression est modifiée de manière dépendante du type cellulaire suite à un traitement.Par exemple, ici, l'expression de la calbindine, une protéine fixant le calcium souvent utilisée pour identifier les neurones dans l'hippocampe et le cervelet, a été étudiée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler des types cellulaires neuronaux spécifiques d'intérêt, tels que le type cellulaire neuronal illustré ici, en utilisant des anticorps spécifiques dirigés contre des antigènes de surface cellulaire appropriés.

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Neurosciences

Utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence pour étudier l’expression des gènes spécifiques au type cellulaire dans le tissu cérébral de rat

Cette vidéo montre une méthode permettant d’isoler des neurones marqués par fluorescence dans le cerveau d’une souris.

Isolement de neurones marqués par fluorescence à partir d’un cerveau murin

Cette vidéo montre la procédure d’isolement et de tri des noyaux de tissus cérébraux humains fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence (FANS), ce qui permet d’étudier différentes populations cellulaires pour diverses applications neurologiques.

Isolement de populations cellulaires à partir de tissus cérébraux à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence

Cette vidéo présente un protocole permettant d’isoler les cellules de l’hippocampe du rat, y compris les neurones, les astrocytes et la microglie.

Obtention de diverses populations de cellules neurales à partir d’un hippocampe de rat

Cette vidéo démontre la dissociation de tissu cérébral de rat congelé en une suspension unicellulaire par digestion enzymatique et trituration mécanique. Les cellules préparées sont fixées et perméabilisées à l’éthanol pour des applications en aval telles que la cytométrie en flux ou l’analyse de l’expression génique.

Obtention d’une suspension unicellulaire à partir de tissu cérébral de rat congelé

Gene analyse de l'expression d'un sous-ensemble de cellules dans un tissu spécifique représente un défi majeur. Cet article décrit comment isoler l'ARN total de haute qualité à partir d'une population de cellules spécifiques en combinant une méthode de immunomarquage rapide avec microdissection laser.

Isolement de l&#39;ARN à partir de sous-populations cellulaires spécifiques en utilisant le laser capture microdissection Combiné avec Rapid immunomarquage

Nous rapportons une méthode basée sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler les cellules souches neurales (NSC) et leur descendance de la zone sous-ventriculaire (SVZ) du cerveau de souris adulte. Appliqué aux souris transgéniques FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator), il permet l’étude de la progression du cycle cellulaire par imagerie en direct.

Tri cellulaire des neurones cellules souches et progénitrices de la souris adulte-ventriculaire Zone et Live-imagerie de la dynamique de leur cycle cellulaire

Nous présentons ici un Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) protocole pour étudier les altérations moléculaires à Fos-exprimant ensembles neuronaux de tissu cérébral à la fois frais et congelés. L'utilisation de tissus congelés permet FACS isolement de nombreuses zones du cerveau sur plusieurs sessions afin de maximiser l'utilisation de sujets d'animaux précieux.

Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) et Gene Expression Analyse de Fos exprimant Neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat

Ici, nous présentons une approche combinatoire pour classer les types de cellules neuronales avant l'isolement et pour la caractérisation ultérieure des transcriptomes monocellulaires. Ce protocole optimise la préparation d'échantillons pour un séquençage d'ARN réussi (RNA-Seq) et décrit une méthodologie conçue spécifiquement pour une meilleure compréhension de la diversité cellulaire.

L&#39;ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

Ici, nous présentons un protocole qui utilise des colorants quasi-infrarouges en conjonction avec l’immunohistochimie et la numérisation à haute résolution pour les protéines de dosage dans les régions du cerveau.

Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) est un outil puissant pour étudier le rôle de la protéine translocatrice 18 kDa ou de l’expression du récepteur 5HT2A de la sérotonine dans la maladie d’Alzheimer à l’échelle cellulaire. Ce protocole décrit l’application ex vivo de FACS-RTT dans le modèle de rat TgF344-AD.

Tri cellulaire activé par fluorescence - Tissu traité par radioligand (FACS-RTT) pour déterminer l’origine cellulaire du signal radioactif

Présenté ici est une méthode pour séquencer des noyaux uniques isolés du gyrus denté de la souris qui exclut la plupart des neurones par tri des noyaux activés par fluorescence (FAN). Cette approche génère des profils d’expression de haute qualité et facilite l’étude de la plupart des autres types de cellules représentées dans la niche, y compris les populations rares telles que les cellules souches neurales.

Tri négatif des neurones par noyaux activés par fluorescence combiné au séquençage de l’ARN à noyau unique pour étudier la niche neurogène de l’hippocampe

Apprenez le tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler des types cellulaires neuronaux spécifiques dans le tissu cérébral du rat. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique spécifique à chaque population cellulaire.

Utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence pour examiner l’expression génique spécifique d’un type de cellule dans le tissu cérébral du rat (Vidéo) | JoVE Journal

Utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence pour examiner l’expression génique spécifique d’un type de cellule dans le tissu cérébral du rat

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