Name: Th17 Inflammation modèle de la candidose oropharyngée chez des souris immunodéficientes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Découvrez un modèle d'inflammation orale dépendante de l'infection par Candida albicans médiée par les cellules Th17 chez des souris immunodéficientes. Cette méthode permet d'étudier l'immunopathologie T cellulaire et les stratégies d'immunothérapie orale.

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Nous remercions le Dr Helene Bernstein de nous avoir donné accès à son cytomètre en flux. Nous remercions également l’installation de cytométrie en flux CFAR pour les services de cytométrie en flux. Ce projet a été en partie soutenu par le financement de l’utilisation de base du CTSC et la subvention de la société STERIS / University Hospitals-Division des maladies infectieuses à PP.

REMARQUE: Les expériences utilisant des souris ont été effectués conformément au comité de protection des animaux institutionnelle (IACUC) des lignes directrices. 1. La reconstitution de l&#39;Rag-1 - / - souris avec des cellules I n vitro de culture Th17 (Trois jours avant l&#39;infection) <ol><li> Pour l&#39;établissement des cellules Th17, culture CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25 des lymphocytes T naïfs (3 x 104) en U à fond plaques à 96 puits seuls ou co-culture eux avec 3 x 104 cellules CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg en présence d&#39;soluble α-CD3 (1 pg / ml), α-CD28 (2 pg / ml) d&#39;anticorps et de cellules présentatrices d&#39;antigène, dans des conditions Th17 (polarisées à l&#39;aide d&#39;IL-6 (25 ng / ml), TGF β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) et α -IL-4 (2 ng / ml)) pendant trois à quatre jours. REMARQUE: les cellules T naïves et regs ont été triés à l&#39;aide cellulaire activé par fluorescence (FACS) und procédures d&#39;isolement cellulaire magnétique et cultivées comme décrit précédemment 19-22. </li><li> Le jour 4, après remise en suspension des cellules Th17 utilisant la pipette, les recueillir à partir de cultures, et les centrifuger dans des conditions stériles. <ol><li> Prenez une petite aliquote de ces cellules à examiner leur viabilité et pour le phénotypage. Remettre en suspension dans les 500 pi de milieu RPMI, ajouter l&#39;iodure de propidium (200 ng / ml) et d&#39;évaluer leur viabilité immédiatement par cytométrie en flux. Effectuer phénotypage en cytométrie de flux évaluation de la production d&#39;IL-17A après restimulation (voir rubrique 6.3). </li></ol></li><li> Centrifugeuse de lavage et l&#39;essentiel des cellules dans du PBS stérile à 480 g pendant 6 min à 4 ° C dans toutes les étapes sauf indication contraire. </li><li> Utilisez ces cellules pour le transfert adoptif dans la vieille 6-8 semaines CD45.2 Rag1 - / - souris immunodéficientes. <ol><li> Remettre en suspension les cellules à une densité cellulaire 1 x 10 7 cellules / ml en utilisant froide PBS stérile. </li><li> Injecter 100 ul de cellules par intraperitoneal injection, en utilisant 25 g d&#39;aiguilles de seringues de 1 ml de tuberculine, de telle sorte que une souris reçoit 1 x 10 6 cellules. Certaines souris recevront PBS, les cellules Th17 ou uniquement, et d&#39;autres souris recevront Th17 cellules qui étaient co-cultivées avec des cellules Treg. REMARQUE: Effectuez toutes les étapes de manière aseptique. </li></ol></li></ol> 2. Croissance C. albicans l&#39;infection (un jour avant l&#39;infection) <ol><li> Avant l&#39;inoculation, disperser cinq colonies de la CAF2-1 C. albicans souche de laboratoire dans 100 pi de suspension PBS stérile, et ajouter la suspension au bouillon stérile. </li><li> Inoculer cinq colonies de la C. albicans dans 50 ml de la base azotée de levure (YNB sans acides aminés) / peptone / bouillon dextrose et incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C pendant 15 à 18 heures à 130 rpm. </li><li> Surveiller le bouillon de trouble, car ce est une indication de la croissance du champignon. </li></ol> 3. CandidaRécolte et de la procédure de comptage (Le Jour des maladies infectieuses) <ol><li> Recueillir 10 ml de bouillon Candida dans 15 ml tubes. Pour des volumes plus importants, de recueillir Candida dans 50 ml tubes. </li><li> Centrifuger les blastospores à 1900 xg pendant 5 min à température ambiante dans toutes les étapes sauf indication contraire. Pellet les blastospores par centrifugation, suivie par l&#39;élimination du surnageant. </li><li> Se il ya plus d&#39;un tube, mutualiser les blastospores de Candida à partir de tubes multiples, ajoutant PBS stérile pour les boulettes et les remettre en suspension dans 10 ml de PBS pour le comptage. </li><li> Prenez 20 pi de blastospores dans 1,5 ml microtubes, ajouter 20 pi de la paraformaldéhyde 2X et incuber à température ambiante pendant 15 à 20 min. Comptez les blastospores fixes utilisant l&#39;hémocytomètre sous le microscope. REMARQUE: Paraformaldéhyde est cancérogène. Ouvrez la solution non diluée seulement dans la hotte. </li><li> En attendant, répéter le lavage des blastospores au moins deux fois par centrifugation tourlet dans du PBS, et la granulation blastospores. Gardez les pastilles dans 15 ml tubes à température ambiante, dans la hotte ABSL1, prêt pour l&#39;infection. </li><li> Laissez un peu de PBS stérile à température ambiante pendant remise en suspension des blastospores de l&#39;infection. </li><li> Après comptage, ajouter du PBS stérile à la pastille de blastospores à ajuster les nombres de cellules de levure à deux blastospores de levure x10 8 cellules / ml. Ce est la suspension de blastospores qui sera utilisé pour infecter les souris. REMARQUE: Effectuez toutes les étapes de manière aseptique. </li></ol> 4. Souris Infection (3-5 jours après transfert de cellules) NOTE: La procédure de l&#39;infection de base est effectuée comme décrit précédemment 19,23-25. <ol><li> Peser le Rag-1 - / - souris qui ont reçu PBS ou les cellules trois jours plus tôt. </li><li> Calculer la dose à l&#39;aide d&#39;agents anesthésiques leur poids corporel. Anesthésier les souris par administration de kétamine / xylazine mélange (16,1 mg / ml et 1,6 mg / ml), en utilisant 25 g d&#39;aiguilles sur les seringues de tuberculine de 1 ml, par intraperitoneal injection. <ol><li> Administrer 50 pl par 10 g de poids corporel. (Ce est-0,8 mg de kétamine et 0,08 mg de xylazine / 10 g de poids corporel ou 80 mg de kétamine et de xylazine 8 mg par kg de poids corporel respectivement). Observer la réponse orteil pincée toutes les 15 min après l&#39;anesthésie. NOTE: Ce dosage va induire 60-90 min de l&#39;anesthésie, ce qui est suffisant pour la procédure d&#39;infection. </li><li> Appliquer le lubrifiant pommade ophtalmique dans les yeux des souris pour éviter les cornées de se dessécher. Comme le lubrifiant oculaire peut se dessécher, répétez la lubrification ophtalmique toutes les 45 min. </li></ol></li><li> Injecter 1 ml de solution saline (NaCl 0,9%) sous-cutanée sur le dos à côté de la patte avant, pour aider à la réhydratation de la souris pendant l&#39;anesthésie. </li><li> Obtenir un nouveau, cage propre. Suivre la procédure infection une souris à la fois, en plaçant chaque souris dans la nouvelle cage une fois infecté. Effectuez la / infection simulacre PBS abord, et ensuite procéder aux gro d&#39;infection à Candidaups. </li><li> Ramassez la souris anesthésiée et ouvrez la bouche pour révéler la base de la langue. <ol><li> Placer une balle de coton diamètre de 3 mm saturé avec 50 pl de PBS ou blastospore suspension, sublinguale dans la cavité buccale pendant 90 min. Retournez la souris tous les fronts 15 min et à l&#39;arrière pour éviter une congestion pulmonaire, veiller à ce que les boules de coton ne se déplacent pas. </li></ol></li><li> Mettre en place une minuterie pour chaque souris 90 min pour se assurer de Sham ou Candida inoculation dans la cavité buccale. </li><li> Gardez-les dans une cage sous la lampe de chaleur (4 mètres), et chaque souris sur coussinets de gel de chaleur. </li><li> Assurez-vous que la langue est retirée à l&#39;intérieur et à l&#39;écart des dents, pour éviter dents lacérants la langue. </li><li> A la fin de 90 min, retirer la boule de coton à partir de l&#39;embouchure de la souris. Surveillez toute souris qui peut remettre de l&#39;anesthésie plus tôt que 75 minutes. Dans un tel cas, anesthésier à nouveau avec de la kétamine (40 mg / kg) seul. </li></ol> 5. Poster PROCEDURe surveillance (pendant les 90 min anesthésie) <ol><li> Utilisez coussinets de gel de chaleur au cours de la 90 min anesthésie. <ol><li> Pour maintenir la température du corps et pour prévenir la suffocation, ne permettent pas de récupérer souris sur la literie de la souris épi de maïs régulier. </li></ol></li><li> Après la récupération de l&#39;anesthésie, administrer un 1 ml supplémentaires de NaCl 0,9% stérile voie sous-cutanée à deux endroits sur le dos. </li><li> Gardez jusqu&#39;à cinq PBS (sham) de souris inoculées par cage. Maison seulement 1-2 souris infectées par cage. </li><li> Remplissez la carte de procédure avec les initiales tous les jours après la procédure de noter les changements dans le poids du corps, les habitudes et la santé globale de toilettage. </li></ol> 6. Évaluation de l&#39;inflammation 6.1) La perte de poids <ol><li> Peser la souris tous les jours pendant l&#39;infection, à partir du jour avant l&#39;intervention de l&#39;infection. NOTE: En règle générale, les souris immunodéficientes injectées avec des cellules Th17 et sans regs T succombent à 20-30% De perte de poids due à l&#39;accroissement de la charge fongique 19 et exacerbé l&#39;inflammation. </li></ol> 6.2) histologie notation de la langue <ol><li> Sacrifier les souris par asphyxie au CO2, suivie par dislocation cervicale. </li><li> Ouvrir les mâchoires et disséquer la langue avec des ciseaux et des pinces. Utilisez le forceps émoussé pour tenir la langue, et l&#39;aide des ciseaux tendre la main à l&#39;arrière de la bouche à inciser la fin arrière de la langue. </li><li> Pour hématoxyline immunocytochimique et de l&#39;éosine (H &amp; E) coloration des tissus de la langue, rincer les tissus de la langue avec PBS glacé. Ajouter 5 ml de formol à 10% pendant 2-3 langues et les fixer O / N en tubes de 15 ml. <ol><li> Le lendemain, éliminer le formol et plongez les tissus dans 5 ml d&#39;éthanol à 70% pour éviter l&#39;hyper-fixation. Envoyez-les en service commercial de poursuivre inclusion dans la paraffine, la coupe et la coloration des coupes en paraffine. NOTE: le service d&#39;histologie commerciale est utilisée pour effectuer ces étapes. </li&gt; </ol></li><li> Une fois les diapositives sont de retour à partir du service d&#39;histologie commerciale, la qualité de l&#39;inflammation en observant les sections de tissu sous un microscope optique. <ol><li> Score de 0 à 5, 0 étant pas d&#39;inflammation, inflammation et 5 étant le plus sévère. Note l&#39;inflammation en utilisant le tableau 1. </li></ol></li></ol> 6.3) La production de cytokine par les cellules Th17 REMARQUE: Une production excessive de TNF-α est l&#39;une des lectures pour immunopathologie excessive. Lorsque les souris sont transférées de manière adoptive avec des cellules Th17 seulement, il provoque l&#39;immunopathologie qui est associée à une production excessive de TNF-α dans les cellules Th17. <ol><li> Recueillir une suspension cellulaire unique à partir de la rate, les ganglions cervicaux, axillaires ganglions lymphatiques, et de la langue, en utilisant des méthodes décrites précédemment 19,26. </li><li> Restimuler les cellules avec du phorbol myristate acétate (PMA) (50 ng / ml) et de l&#39;ionomycine (500 ng / ml) pendant 4 heures avec Brefeldine A (10 ug / ml) a été ajouté dans la last 2 h. Laver les cellules avec du PBS et fixer à l&#39;aide d&#39;un kit de fixation / de perméabilisation commerciale selon les instructions du fabricant. </li><li> Effectuer intra coloration de cytokine cellulaire en utilisant l&#39;anticorps anti-TNF-α conjugués à un fluorochrome, anti-IL-17A et d&#39;anticorps ROR-yt 19 comme décrit précédemment. </li><li> En bref, remettre en suspension les cellules dans le tampon de perméabilisation 1X avec le cocktail d&#39;anticorps anti-TNF-α, l&#39;anti-IL-17A et ROR-yt anticorps, chaque anticorps à 2-3 ug / ml de concentration finale. </li><li> Incuber les cellules pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Après l&#39;incubation, laver les cellules avec le tampon de perméabilisation 1X. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de PBS avec 0,5% de sérum albumine bovine pour l&#39;analyse de cytométrie en flux. </li></ol>

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<li>Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+functions+of+TNF-alpha+in+the+regulation+of+the+intestinal+epithelial+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation.</a> International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).</li>
<li>Bishu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+CARD9+is+required+for+adaptive+but+not+innate+immunity+to+oral+mucosal+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections.</a> Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).</li>
<li>Quintin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+NK+cells+against+Candida+albicans+infection+in+immunocompetent+or+immunocompromised+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice.</a> Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).</li>
<li>Ramirez-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+cancer%3A+Can+this+yeast+induce+cancer+development+or+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression.</a> Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce modèle est basé sur l&#39;induction par voie orale C. albicans infection inflammation Th17 dépendante. En raison de l&#39;absence de T regs, l&#39;inflammation cellulaire Th17 induite est effrénée et conduit à l&#39;immunopathologie mal résolu. In vitro dérivés des cellules CD4 naïfs polarisés que les cellules Th17 ont été utilisés pour le transfert adoptif. 40-50% de la culture CD4 + cellules montrent détectable expression de l&#39;IL-17A autour de 3 jours (cellules Th17), et donc ont ét...

Les infections buccales et l’inflammation ont été liées au cancer et aux maladies cardiovasculaires, et ont un impact dramatique sur la santé humaine globale2,3. Les infections opportunistes et l’inflammation causées par C. albicans sont associées à des immunodéficiences primaires (AIP)4,5, à des troubles inflammatoires tels que la parodontite 6,7, le syndrome de Sjögren et la maladie des glandes salivaires8,9, ainsi qu’à un carcinome épidermoïde buccal 10-12. C. albicans est un champignon commensale dimorphe qui colonise la bouche de 60 % des humains en bonne santé de manière asymptomatique, mais c’est l’agent pathogène fongique le plus courant provoquant des infections lorsque la défense de l’hôte est affaiblie13-15. Il provoque des infections et des inflammations récurrentes et chroniques chez les patients atteints du sida et de la MIP, ainsi que chez d’autres personnes immunodéprimées. En tant que commensaux, sa charge de colonisation est associée à la modification de la diversité de l’ensemble du microbiome buccal16. En tant qu’agent pathogène, il provoque plusieurs formes de candidose oropharyngée telle que la chéilite pseudomembraneuse aiguë, l’atrophie aiguë, l’atrophie chronique, l’hypertrophie/hyperplasie chronique et la chéilite angulaire. 
La protection contre C. albicans est déterminée non seulement par la résistance immunitaire de l’hôte, mais aussi par la capacité à contrôler de manière appropriée l’immunopathologie induite par Candida. Bien que les commensaux tels que C. albicans contribuent à la modulation et à l’exacerbation d’autres affections inflammatoires buccales, les mécanismes par lesquels la dysbiose se produit lors d’infections opportunistes ne sont pas clairs. Outre le rôle connu des cellules Th17 adaptatives dans la réponse mémoire à C. albicans17, leur rôle dans l’initiation et la perpétuation de la pathologie inflammatoire au cours d’infections chroniques reste incertain. De plus, les maladies inflammatoires buccales telles que le syndrome de Sjögren et la parodontite sont associées à une pathologie médiée par Th17. Il est intéressant de noter que ces maladies sont également fortement associées à des OPC fréquents. Cependant, les interactions entre les cellules Th17, l’immunopathologie buccale de l’OPC et d’autres maladies inflammatoires orales ne sont pas étudiées. 
Bien qu’il existe des modèles murins d’infection primaire et secondaire de la candidose buccale, il n’existe pas de modèle murin pour étudier l’inflammation Th17 associée à l’infection à Candida, en particulier dans le contexte de l’immunodéficience. Cette étude présente une méthode pour établir l’inflammation orale Th17 associée à l’infection orale à Candida chez la souris. L’infection à Candida chez la souris se caractérise par des lésions fongiques, une inflammation de la langue, une diminution de l’apport alimentaire, une perte de poids et finalement un état moribond. La pathologie buccale ressemble aux lésions chroniques d’infection à Candidal, ainsi qu’à la dysplasie épithéliale dans des modèles murins de cancer de la bouche12,18.

<table><tbody><tr><td>CAF-2</td><td>Université de Pittsburgh (Sarah Gaffen)</td><td>-</td><td>Culture Candida</td></tr><tr><td>U-bottom 96 plaques de puits&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>055588</td><td>Utilisé pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>a-CD3&nbsp ;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>Polarisation des cellules aux conditions Th17</td></tr><tr><td>a-CD28&nbsp ;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>Polarisation des cellules aux conditions Th17</td></tr><tr><td>m-IL-6</td><td>Bio Basic</td><td>RC232</td><td>Polarisation des cellules aux conditions Th17</td></tr><tr><td>h-TGF-b&nbsp ;</td><td>R& D</td><td>240-B</td><td>Polarisation des cellules aux conditions Th17</td></tr><tr><td>a-IFN-g&nbsp ;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7311-85</td><td>Polarisation des cellules aux conditions Th17</td></tr><tr><td>a-IL-4&nbsp ;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7041-85</td><td>Polarisation des cellules aux conditions Th17</td></tr>&<tr><td>alpha ;-IL17A ef660</td><td>eBiosciences</td><td>50-7177-82</td><td>Utilisé pour la culture cellulaire - 1:50</td></tr><tr><td>&alpha ;-TNFa-PE-Cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-7423-41</td><td>Utilisé pour la culture cellulaire - 1:100</td></tr><tr><td>&alpha ;-RORgt PE&nbsp ;</td><td>eBiosciences</td><td>12-6981-82</td><td>Utilisé pour la culture cellulaire - 1:50</td></tr><tr><td>YNB sans acides aminés)/Peptone/Dextrose milieu de bouillon&nbsp ;</td><td>Bio Basic</td><td>S507. TAILLE</td><td>Mediium pour la croissance du candida</td></tr><tr><td>Incubateur Shaker&nbsp ;</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4300</td><td>Croissance d’incubation pour candida</td></tr><tr><td>Tubes de 15 ml</td><td>Bio Basic</td><td>BT888-SY</td><td>Utilisé pour la culture cellulaire et la croissance du candida</td></tr><tr><td>Tubes de 50 ml</td><td>Bio Basic</td><td>CT 788-YS</td><td>Utilisé pour la culture cellulaire et la croissance du candida</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>VWR International LLC</td><td>82017-654</td><td>Pour la granulation du candida -900 g</td></tr><tr><td>Allegra Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>392302</td><td>Culture cellulaire - 480 g</td></tr><tr><td>1,5 ml Tubes eppendorf</td><td>Bio Basic</td><td>BT620-NS</td><td>Préparation de la concentration finale de candida</td></tr><tr><td>2x paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td>Fixation du candida pour le comptage</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>VWR International LLC</td><td>15170-172</td><td>Comptage des cellules</td></tr><tr><td>PBS - Phosphate Buffered Saline</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td>Préparation des tampons</td></tr><tr><td>kétamine/xylazine&nbsp ;</td><td>Case Western Reserve University - Centre de ressources animales</td> <td>-</td> <td>Obtenu à partir du protocole approuvé par l’ARC pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>Pommade lubrifiante ophtalmique.</td><td></td><td>Allergan-Pommade</td> <td>pour les yeux pour les animaux pour prévenir la sécheresse</td></tr><tr><td>Saline (0,9 % NaCl)</td><td>G Biosciences</td><td>786-561</td><td>Administrée aux animaux pour prévenir la déshydratation</td></tr><tr><td>Boule de coton de 3 mm de diamètre&nbsp ;</td><td>VWR International LLC</td><td>BP7603</td><td>Boules de 3 mm pour l’infection à candida</td></tr><tr><td>Coussinets de gel chauffant</td><td>Case Western Reserve University - Centre de ressources animales</td> <td>-</td> <td>pour le maintien de la température corporelle et la récupération rapide</td></tr><tr><td>Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine</td><td>Histoserv - MD</td> <td>-</td> <td>Histologie tissulaire</td></tr><tr><td>10 % de formol&nbsp ;</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>JC1111/MC</td><td>Histologie tissulaire</td></tr><tr><td>70 % éthanol&nbsp ;</td><td>VWR International LLC</td><td>97064-490</td><td>Objectif de stérilisation</td></tr><tr><td>PMA - Phorbol 12-myristate 13-acétate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>Restimulation des cellules</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Life Technologies</td><td>124222 1mg</td><td>Restimulation des cellules</td></tr><tr><td>Kit de perméabilisation de fixation</td><td>eBiosciences E16913-106</td><td></td><td>Cellules de fixation pour cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Seringues à tuberculine</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>Souris injection</td></tr><tr><td>25 G x 3/8 aiguilles</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>souris</td></tr><tr><td>injection Rag1 -/- souris</td><td>Jackson laboratories</td><td>N° stock : 002216</td><td>Souris receveuses</td></tr><tr><td>CD45.1 souris congéniques Jackson</td><td>laboratories</td><td>N° stock :002014&nbsp ;</td><td>Cellules Th17 du donneur</td></tr><tr><td>Souris CB17-SCID Jackson</td><td>laboratories</td><td>N° de stock : 001303</td><td>Souris receveuses</td></tr><tr><td>Souris Balb/c Jackson</td><td>laboratories</td><td>N° de stock : 000651</td><td>Cellules Th17 du donneur</td></tr></tbody></table>

th17 inflammation modèle de la candidose oropharyngée chez des souris immunodéficientes

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

La candidose oropharyngée (OPC) est causée non seulement par l’absence de résistance immunitaire de l’hôte, mais aussi par l’absence de régulation appropriée de l’immunopathologie induite par l’infection. Bien que les cellules Th17 soient impliquées dans la défense antifongique, leur rôle dans l’immunopathologie n’est pas clair. Cette étude présente une méthode pour établir l’immunopathologie orale Th17 associée à l’infection orale à Candidal chez les souris immunodéficientes. La méthode est basée sur la reconstitution de souris lymphopéniques avec des cellules Th17 cultivées in vitro, suivie d’une infection buccale par Candida albicans (C. albicans). Les résultats montrent que les cellules Th17 non restreintes entraînent une inflammation et une pathologie, et sont associées à plusieurs lectures mesurables, notamment la perte de poids, la production de cytokines pro-inflammatoires, l’histopathologie de la langue et la mortalité, montrant que ce modèle peut être précieux dans l’étude de l’immunopathologie OPC. Le transfert adoptif de cellules régulatrices (Tregs) contrôle et réduit la réponse inflammatoire, ce qui montre que ce modèle peut être utilisé pour tester de nouvelles stratégies pour contrer l’inflammation buccale. Ce modèle peut également être applicable à l’étude de l’immunopathologie orale Th17 en général dans le contexte d’autres maladies bucco-dentaires.

Dans ce modèle, les deux souris infectées par Candida et les souris non infectées dans Rag-1 - / - fond immunodéficientes ont été adoptive transféré avec des cellules Th17 3-5 jours avant l&#39;infection. Un total de 10 à 12 souris ont été utilisés pour les expériences, avec deux souris dans chaque groupe Sham infecté et 4-5 dans chacun des groupes infectés Candida. Cellules naïves ont été obtenues à partir de souris congéniques CD45.1 ou Thy1.1, de sorte que les cellules Th17 injectés ont é...

Bien qu’il existe des modèles d’infection à Candida pour étudier la résistance immunitaire de l’hôte, il n’existe aucun modèle pour étudier l’immunopathologie induite par les lymphocytes T dans le contexte de l’infection à Candida. Nous décrivons ici une méthode pour établir l’immunopathologie Th17 associée à l’infection orale à Candida chez les souris immunodéficientes.

Th17 Inflammation modèle de la candidose oropharyngée chez des souris immunodéficientes

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

L'objectif général de cette procédure est de développer un modèle d'inflammation orale dépendant d'une infection médiée par des cellules TH17 pathologiques. Cela est réalisé en injectant d'abord des cellules TH17 dans des souris immunodéficientes. L'étape suivante consiste à cultiver le champignon Candida albicans, à recueillir les blastospores et à les préparer dans du PBS.La dernière étape consiste à injecter oralement les souris avec les spores de blasto afin de stimuler la prolifération des cellules TH17 injectées et d'induire une inflammation buccale. Les résultats montrent que les souris ayant reçu des cellules TH17 présentent une perte de poids et une inflammation de la langue, comme en témoignent les analyses par cytométrie en flux et par immunohistochimie de la langue. Les implications de cette technique s'étendent donc à l'immunothérapie orale grâce à ce modèle murin.Le modèle d'inflammation TH17 peut également être utilisé pour étudier l'inflammation TH17 dans le contexte d'autres maladies buccales, ce qui montre que la procédure sera assurée par moi-même et par un chercheur postdoctoral spécialisé en vascularisation azotée dans mon laboratoire. Cette procédure nécessite des lymphocytes T naïfs triés par cytométrie en flux, ainsi que, facultativement, des cellules Treg, afin d'établir une culture de cellules TH17 : cellules T naïves CD4 positif, CD44 faible, CD62L élevé, CD25 négatif, placées dans des plaques UBO 96 puits à raison de 30 000 cellules par puits, dans des conditions favorisant le développement TH17, pendant trois à quatre jours. À titre de contrôle, les cellules T naïves peuvent être cultivées conjointement avec 30 000 cellules Treg CD4 positif, CD25 positif, FOX P3 positif, dans les mêmes conditions de culture afin de générer des cellules TH17. Après quatre jours de culture, récupérez les cellules TH17 à l’aide d’une pipette.Mettons de côté un petit aliquot afin d'examiner leur viabilité. Suspendons ces cellules dans un demi-millilitre de RPMI et ajoutons-leur 100 nanogrammes de propidium iodure. Pour l'analyse par cytométrie en flux, la majeure partie des cellules est récoltée et préparée pour l'injection cellulaire.La majeure partie des cellules doit être lavée dans du PBS, centrifugée, puis préparée pour l'injection chez les souris. À raison de 10 millions de cellules par millilitre dans du PBS froid, injecter 100 microlitres de la suspension cellulaire par voie intrapéritonéale à l’aide d’une aiguille de 25 gauge. D’autres souris doivent être injectées avec du PBS ou avec des cellules Treg TH17 contrôles co-cultivées. Prévoir d’injecter les souris avec C. albicans entre trois et cinq jours plus tard, la veille. Après infection des souris par C albicans, dispersez cinq colonies de la souche de laboratoire CAF deux tiret un dans 100 microlitres de PBS stérile et ajoutez la suspension à 20 millilitres de bouillon stérile. Incubez le milieu inoculé toute la nuit à 30 degrés Celsius avec une agitation de 130 tr/min. Le jour suivant, prélèvez 10 millilitres de la culture dans un tube de 15 millilitres, puis centrifugez l'Éloqua à 1900 ×g pendant cinq minutes.À température ambiante, le culot contient les spores blasto et le surnageant doit être éliminé. Rassemblez toutes les spores blasto recueillies dans 10 millilitres de PBS stérile et transférez 20 microlitres d'Eloqua dans un tube microfuge. Ajoutez 20 microlitres de deux XPFA à l'Eloqua et, après 15 à 20 minutes de fixation, comptez les spores blasto à l'aide d'un hématocytomètre pendant la période de fixation.Lavez les spores blasto abondamment avec du PBS au moins deux fois supplémentaires. Conservez les culots de spores blasto dans une hotte AB SL à température ambiante jusqu'à ce que le nombre soit connu. Ensuite, resuspendez les spores blasto dans du PBS à température ambiante à une concentration de 200 millions de cellules par millilitre.Gardez les cellules prêtes à infecter les souris. Cette méthode a déjà été examinée précédemment, mais sera brièvement revue dans cette section. Tout d'abord, anesthésiez les souris, confirmez leur état d'anesthésie et appliquez une pommade ophtalmique.L'application doit être répétée après 45 minutes. Ensuite, par voie sous-cutanée. Injecter un millilitre de sérum physiologique pour l'hydratation, en travaillant un souris à la fois.Commencez par infecter le groupe témoin, puis le groupe candida. Préparez une boule de coton de trois millimètres de diamètre en la saturant avec 50 microlitres de PBS ou de suspension de spores blasto. Ensuite, accédez à la base de sa langue et placez-y la boule de coton.Veillez à ce que la langue soit retirée à l'intérieur et éloignée des dents afin d'éviter toute lacération. Ensuite, transférez la souris dans sa cage de récupération placée sur un coussin chauffant. La litière en copeaux de maïs ne doit pas être utilisée dans la cage, car le coussin chauffant ne transférerait pas suffisamment de chaleur ; placez une lampe chauffante à environ un mètre au-dessus de la position des cages de récupération.La boule de coton doit rester en place pendant 90 minutes. Chaque souris doit avoir son propre minuteur de 90 minutes. Pendant cette période, chaque souris doit être retournée d'un côté à l'autre toutes les 15 minutes afin d'éviter une congestion pulmonaire.Ainsi, l'étape la plus critique de l'ensemble de la procédure consiste à s'assurer que la boule de coton reste en place pendant toute la durée de l'inoculation. Si un animal commence à se réveiller prématurément de l'anesthésie, réanesthésiez-le en utilisant uniquement de la kétamine. Après 90 minutes, retirez la boule et observez la récupération de l'animal.Une fois le rétablissement obtenu, administrer un millilitre supplémentaire de solution saline à deux endroits du dos pour une hydratation accrue. Après la procédure, jusqu'à cinq souris inoculées au placebo peuvent partager une cage en utilisant des lymphocytes T naïfs provenant de souris thigh 1.1 ou CD 45.1. La procédure décrite a été suivie et les lymphocytes T injectés ont été suivis à l’aide de leurs marqueurs respectifs.Les Treg issues d'un transfert conjoint ont été obtenues à partir de souris CD 45,2 et ont également été suivies uniquement par ce marqueur. Les souris infectées par Candida ont présenté un recrutement et une expansion des cellules TH 17 injectées. Après l'infection, la perte de poids a été suivie.Les souris injectées uniquement avec des cellules TH17 ont perdu du poids progressivement et certaines ont dû être euthanasiées. En revanche, la perte de poids chez les autres groupes s'est finalement arrêtée. Les souris injectées avec la co-culture de Treg présentaient beaucoup moins de cellules productrices de TNF alpha quatre jours après l'infection.La présence prolongée de cellules productrices de TNF alpha montre que les souris ayant reçu uniquement des TH17 présentaient des infections et une inflammation non résolues. Les langues des souris ayant reçu des tregs présentaient également beaucoup moins d'infiltrats inflammatoires et une croissance fongique réduite. Au même point temporel, la présence prolongée d'infiltrats inflammatoires indique que les souris ayant reçu uniquement des TH17 avaient des infections et une inflammation non résolues. Une fois maîtrisée, cette technique d'infection peut être réalisée en trois heures pour quatre souris, avec 15 minutes supplémentaires par souris à infecter.

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