Name: Tension et calcium double cartographie de canal optique de Cultured HL-1 auriculaire myocytes monocouche (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Découvrez la cartographie optique double canal du calcium et du voltage dans des monocouches de myocytes auriculaires HL-1. Cette méthode permet d'analyser simultanément la propagation des signaux électriques et les transitoires calciques.

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Nous tenons à remercier le Dr Claycomb pour fournir des cellules HL-1 et le protocole d&#39;entretien détaillé. Nous tenons également à remercier Mme Elena Carrillo et le Dr Seth Robia pour leur aide à générer le film cellulaire et M. Pete Caron pour son aide à la rédaction des accessoires pour notre double système de cartographie optique canal. Ce travail a été soutenu par l&#39;American Heart Association (10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478 à XA), National Institutes of Health (HL113640 à XA), et le Fonds de l&#39;Université Loyola de recherches pour le développement (à XA).

1. Solution Préparation <ol><li> Noradrénaline (NP) solution <ol><li> Dissoudre 40 mg de NP dans 25 ml de 30 mM d&#39;acide ascorbique (0,1475 g d&#39;acide ascorbique dans 25 ml d&#39;eau Milli-Q (MQ) de l&#39;eau purifiée. Éviter l&#39;exposition lumière directe lors de cette préparation de solution, car la noradrénaline (NP) est sensible à la lumière. </li><li> Filtrer la solution à NP avec un filtre à seringue de 0,22 um. Aliquoter la solution dans 1 ml microtubes stériles et conserver à -20 ° C. Une fois congelés, NP est stable pendant un mois. </li></ol></li><li> Complété Laver et final Claycomb médias <ol><li> Commencez avec 43,5 ml de milieu Claycomb et de compléter avec 5 ml de sérum de veau fœtal (FBS), 0,5 ml de pénicilline / streptomycine, 0,5 ml de NP et 1: 100 diluée L-glutamine pour faire 50 ml de milieu final Claycomb complétée. Éviter l&#39;exposition de la lumière directe pendant cette préparation de la solution parce moyenne Claycomb est sensible à la lumière. </li><li> Préparer le milieu de lavage Claycomb utilisant la même recette que l&#39;supmoyenne complétée Claycomb sauf ajouter 5% de FBS et omettre le NP et les composants de la L-glutamine. NOTE: Les médias final et Wash Claycomb complété sont bons pour deux semaines lorsqu&#39;il est conservé à 4 ° C sans exposition à la lumière directe. </li></ol></li><li> Trypsine de soja solution inhibitrice <ol><li> Dissoudre 25 mg d&#39;inhibiteur de trypsine de soja dans 100 ml de solution saline tamponnée au phosphate sans Ca et Mg libre de Dulbecco (PBS). </li><li> Filtrer la solution à l&#39;aide d&#39;un filtre à seringue de 0,22 um. REMARQUE: La solution stérilisée est stable pendant un mois lorsqu&#39;il est conservé à 4 ° C. </li></ol></li><li> solution de gélatine / fibronectine plat revêtement <ol><li> Dissoudre 0,1 g de gélatine dans 500 ml d&#39;eau MQ pour faire 0,02% de gélatine. </li><li> Autoclave, puis diluer 1 ml de fibronectine dans 199 ml de 0,02% de gélatine et mélanger délicatement. </li><li> Aliquote 6 ml de solution de gélatine dans des tubes séparés et conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> La solution de sel de Hank <ol><li> Utiliser un émoiplaque, dissoudre les sels suivants dans l&#39;eau MQ (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0,4000), MgSO 4 (0,8142), D-Glc (5,051), NaHCO 3 (4,162), HEPES (5,042), CaCl 2 (1,261). </li></ol></li><li> Calcium colorant sensible (Rhod2) solution <ol><li> Diluer 1 mg de poudre sèche Rhod2 dans 400 pi de 20% de Pluronic F-127 dans du DMSO pour faire un Rhod2 colorant solution de stock et conserver à -20 ° C. </li><li> Diluer cette solution de stock 1: 1000 avec la solution de sel de Hanks pour obtenir une solution de travail final avant de commencer l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Tension colorant sensible (Rh237) solution <ol><li> Diluer 5 mg de Rh237 avec 2 ml de DMSO pour faire une solution de stock et conserver à -20 ° C. Diluer la solution de stock 1: 1000 avec la solution de sel de Hanks pour obtenir une solution de travail final avant de commencer l&#39;expérience. </li></ol></li></ol> &amp; #160; REMARQUE: 04.01 solutions sont basées sur le HL-1 Claycomb protocole de culture cellulaire avec des modifications mineures. 2. Le repiquage et culture des HL-1 auriculaire myocytes sur des lamelles NOTE: Les cellules HL-1 peuvent être obtenus auprès du Dr. Claycomb (Louisiana State University). <ol><li> Cultivez HL-1 cellules dans des flacons T25 et nourrir avec 5 ml d&#39;complétée Claycomb moyenne quotidienne. Passage des cellules en flacons T25 tous les cinq jours selon la Claycomb HL-1 protocole de culture cellulaire (décrite ci-dessous) 10. </li><li> La place des lamelles rondes (diamètre 20 mm) en culture à 12 puits des plaques de 24 heures avant que les cellules dans le flacon T25 sont entièrement confluentes et prêtes à être repiquées, puis couvrir les lamelles avec de la gélatine / de la fibronectine pendant une nuit à 37 ° C. </li><li> Le lendemain, aspirer et jeter la gélatine / fibronectine des plaques de culture et le remplacer par 1,5 ml de milieu supplémenté final Claycomb dans chaque puits. </li><li> Fractionner les cellules d&#39;une cultur T25e flacon après avoir atteint pleine confluence au jour 5. Aspirer le milieu du flacon T25 contenant la culture de confluence et rincer la culture rapidement avec du PBS à 37 ° C. </li><li> Aspirer le PBS et ajouter 3 ml de 0,05% de trypsine / EDTA à 37 ° C en pipetant la trypsine / EDTA dans le fond du flacon T25 pour éviter le contact direct avec les cellules. Incuber à 37 ° C pendant 1 min. </li><li> Retirer la trypsine / EDTA par aspiration et ajouter un autre 1,3 ml de trypsine / EDTA par flacon T25. Incuber à température ambiante pendant 1 min. Examiner sous un microscope et si les cellules sont encore attachés au ballon, appuyez sur pour déloger entièrement cellules restantes. </li><li> Ajouter 1,3 ml d&#39;inhibiteur de trypsine de soja pour les cellules et les cellules de transfert à partir de la fiole dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Rincer la fiole vide avec 5 ml de milieu de lavage Claycomb. Ajouter le liquide de rinçage pour les cellules dans le tube de 15 ml de la centrifugeuse. Centrifuger à 500 g pendant 5 min. </li><li> Après centrifugation, aspirer le surnageant et remettre en suspension doucement le culot cellulairedans 6 ml de milieu supplémenté final Claycomb. </li><li> Ensemencer chaque puits d&#39;une plaque à 12 puits avec 0,5 ml de suspension de cellules à partir de passages de cellule. Nourrir les cellules avec un milieu frais complété final Claycomb quotidienne. REMARQUE: Surveiller de près la croissance des cellules, généralement les monocouches de cellules confluentes atteindre le statut le jour 4 et les activités spontanées restent visibles. Ensuite, la culture monocouche sera prêt pour la cartographie optique sur 4-5 jours. </li></ol> 3. Chargement de calcium et de tension colorants sensibles aux cellules <ol><li> Pour les études de cartographie optique, retirez délicatement la lamelle de la plaque de culture cellulaire de 12 puits et rincer avec la solution de sel de Hanks. </li><li> Pour colorer les cellules avec le colorant sensible Ca Rhod2, incuber la monocouche de cellules sur la lamelle couvre-objet avec 3 ml de la oxygénée (barbotage avec 5% de CO2 / 95% d&#39;O 2 gazeux) de la solution de travail Rhod2 à 37 ° C dans un bain d&#39;eau pendant 30 min . </li><li> Pour colorer les cellules avec V m colorant sensibleRh237, immerger la monocouche cellulaire Rhod2 chargé dans 3 ml de solution de travail Rh237 oxygénée à 37 ° C dans un bain d&#39;eau pendant 15 min. </li></ol> Cartographie 4. Double canal optique <ol><li> Placer la monocouche cellulaire, qui est coloré avec du double-V m colorants et Ca, dans une chambre de circulation sur un microscope à fluorescence inversé. Utiliser un système de circulation chauffé pour maintenir la température de la chambre de cellule à 35 ± 1 ° C. Contrôler soigneusement la température du liquide de perfusion en réglant la vitesse du flux circulant à travers la chambre afin d&#39;éviter un gradient de plus de 0,3 ° C à travers la chambre. <ol><li> Avant d&#39;enregistrer V m / signaux Ca, laver la monocouche cellulaire avec une solution fraîche Hanks pendant environ 5 min pour éliminer le colorant reste des étapes de coloration précédentes. </li></ol></li><li> Pace monocouches de cellules en bonne santé en utilisant une électrode bipolaire composée d&#39;une pipette en verre rempli d&#39;une solution saline de Hanks et un silver fil enroulé autour de la pointe de la pipette comme décrit précédemment 12,17. </li><li> Pace monocouches de cellules saines à une longueur de cycle de 200-500 ms et de largeur d&#39;impulsion de 2 ms, attendent un seuil de stimulation à environ 1 mV. NOTE: Pour chaque lot de monocouches de culture, au moins deux monocouches non traitées doivent être utilisés pour tester l&#39;état de la charge de la cellule. Monocouches témoins en bonne santé devraient être en mesure d&#39;être capturé par la stimulation électrique à la durée du cycle de 200-500 ms. Si les monocouches de contrôle ne parviennent pas à être électriquement rythme, cela suggère que l&#39;ensemble du lot de cellules peut ne pas convenir pour des expériences de cartographie optique. </li><li> Pour exciter à la fois m et V Ca colorants sensibles, utiliser une source de lumière à LED (520 nm de longueur d&#39;onde) couplé à un filtre d&#39;excitation (510 nm / 40) et un miroir dichroïque (561 nm). <ol><li> Recueillir les signaux fluorescents émis par les cellules par l&#39;intermédiaire d&#39;un objectif 40X et divisée avec un miroir dichroïque (594 nm) dans un composant de m V et d&#39;un composant de Ca.On filtre la lumière émise dans le canal de m V avec un filtre passe longue (700 nm) et la lumière émise dans le canal de Ca avec un filtre passe-bande (585/40 nm). </li><li> Collecter la lumière fluorescente filtrés en utilisant deux caméras CCD (80 x 80 pixels, 1000 fps; redshirt imagerie). </li><li> Pour éviter colorant photoblanchiment, faire des enregistrements pour les moins de 2 s sur chaque champ de vue de limiter le temps d&#39;exposition à la lumière. Ici, l&#39;image généralement quatre domaines différents pour chaque monocouche. </li></ol></li></ol> 5. Traitement des données de V m ou Ca Recordings <ol><li> Pour les deux V m et signaux Ca (80 x 80 pixels), la moyenne des valeurs d&#39;intensité de vingt-cinq (5 x 5) pixels voisins dans une valeur d&#39;intensité à différents points de temps d&#39;enregistrement pour réduire le bruit de fond. NOTE: Après le calcul de la moyenne de données, chaque point de la durée d&#39;enregistrement d&#39;un potentiel d&#39;action individuelle ou transitoire Ca donne une matrice de données contenant 16 x 16 valeurs d&#39;intensité moyenne (moyennedes canaux de données) avec une résolution spatiale de 50 um. </li><li> Définir temps d&#39;activation (AT) des signaux enregistrés Ca m V ou. <ol><li> Pour définir un temps d&#39;activation (AT) d&#39;un potentiel d&#39;action individuel ou Ca transitoire, déterminer le temps de 50% de l&#39;amplitude de crête des signaux de Ca en utilisant un algorithme basé sur MATLAB sur mesure m V ou comme décrit précédemment. 12 </li><li> Manuellement relire l&#39;AT analysé pour éliminer les erreurs qui peuvent survenir lors de l&#39;analyse du programme. </li><li> Stocker les AT matrice définie (16 x 16 en moyenne canaux de données) de potentiel d&#39;action enregistrée et transitoire de calcium, respectivement, dans le logiciel utilisé. </li></ol></li><li> Calculer potentiel d&#39;action ou de calcium transitoires vitesse de conduction (CV) des vecteurs de la matrice à l&#39;aide de la méthode d&#39;analyse du champ de vecteur tel que décrit précédemment avec des modifications mineures 12,18. <ol><li> Calculer le vecteur de CV d&#39;un canal de données par rapport à son environnement à des points de données (5 ×; 5 voisine moyenne canaux de données) pour simuler une surface polynomiale lisse du temps d&#39;activation (à la surface) en utilisant un algorithme des moindres carrés dans le programme MATLAB 12,18. </li><li> Calculer vecteur de conduction en utilisant les formules ci-dessous Formule 1: <img alt="Equation 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> Formule 2: θ = arctan [(dy / dt) / (dx / dt)] REMARQUE: Ve est un vecteur de CV projeté à x et y axes; dx / dt est la projection du vecteur de CV en abscisse; dy / dt est la projection du vecteur de CV dans l&#39;axe y. T est la surface AT; x, y désignent les coordonnées de la 2-D; T x = ∂T / ∂x est la dérivée partielle de T par rapport à x; T y = ∂T / ∂y est la dérivée partielle de T par rapport à y; θ est la direction finale d&#39;un vecteur de CV. </li><li> Groupe tous les vecteurs de la matrice AT dans 36 voies, dont chacun couvre un secteur de dix degrés sur la boussole. &lt;/ Li&gt; <li> Sélectionnez la voie contenant la plus grande population des vecteurs CV parmi les 36 voies de conduction. Calculer le CV moyen de cette voie pour représenter le CV de la monocouche. </li></ol></li></ol> 6. Visualisation de la Propagation front d&#39;onde <ol><li> Normaliser l&#39;intensité du signal d&#39;un potentiel d&#39;action individuelle ou Ca transitoire à différents points par rapport à sa valeur maximale en utilisant un logiciel MATLAB de temps d&#39;enregistrement. </li><li> Stocker temporairement les données d&#39;intensité normalisées de tous les points de temps enregistrée dans une matrice de 16 x 16 intensité dans le logiciel MATLAB utilisé. </li><li> Construire une carte à code couleur intensité de la matrice d&#39;intensité stockées de chaque point de temps d&#39;enregistrement en utilisant la fonction de surf.m. NOTE: Dans la carte d&#39;intensité, rouge représente haute intensité des signaux Ca m V ou, et bleu reflète faible intensité des signaux de fluorescence. </li><li> Créer un fichier .avi en utilisant la fonction de avifile.m. </li><li> Conservez toutes les icartes ntensity à différents points de temps d&#39;enregistrement du potentiel d&#39;action ou Ca transitoire en utilisant la fonction de addframe.m. NOTE: A ce stade, deux fichiers avi séparés de V m et Ca propagation seront générés. </li></ol>

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Cet article décrit les aspects clés de la cartographie optique dans une culture HL-1 auriculaire myocytes monocouche colorées avec calcium et de tension colorants fluorescents sensibles. Il comprend la culture d&#39;un HL-1 monocouche cellulaire optimale, la configuration de l&#39;équipement de la cartographie, la cartographie d&#39;une monocouche de culture, et l&#39;analyse des données. Pour cartographier avec succès des cellules en culture, l&#39;essentiel est de préparer une monocouche d...

Un uniques calcium (Ca) et la tension (V m) technique de cartographie optique double canal 1-5 est en train de devenir un outil efficace pour enregistrer simultanément V m et Ca signaux dans les deux coeurs intacts et des monocouches de cellules cultivées. Cette technique permet d&#39;obtenir des informations puissante concernant la relation entre les transitoires de calcium et potentiels d&#39;action afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents électrophysiologiques d&#39;arythmies cardiaques. Des monocouches de cellules cultivées se sont avérés être un modèle utile pour étudier cellulaire électrophysiologie cardiaque et le mécanisme sous-jacent d&#39;arythmies. 4,6-8 HL-1 sont des cellules d&#39;une ligne de culture des myocytes auriculaires bien caractérisé. cellules HL-1 maintiennent également un génotype et le phénotype différencié unique qui comprend morphologique, électrophysiologique, et les caractéristiques pharmacologiques de myocytes auriculaires adultes. Ces cellules expriment des gènes et des protéines cardiaques, y compris important canaux ioniques cardiaque (ce est à dire, L et canaux calciques de type T) 9 et matures isoformes de protéines contractiles sarcomériques trouvent normalement dans les myocytes auriculaires adultes que les autres et nous avons indiqué précédemment. 10-13 En outre, HL-1 cellules peuvent être cultivées pour former un 2 dimensions (2-D) myocytes monocouche. Ainsi, les avantages de l&#39;utilisation de culture des monocouches de HL-1 comprennent: 1) coût relativement bas et plus facile à maintenir une ligne de la culture des myocytes que d&#39;isoler et cultiver les myocytes néonataux primaires; 2) une monocouche confluente de cellules réduit la complexité de structure qui résultent de la structure 3-D du coeur; 3) une monocouche cellulaire peut éliminer l&#39;interférence de la fibrose interstitielle qui se produit dans le coeur intact. Ceci peut être utilisé pour disséquer les fonctions électrophysiologiques spécifiques d&#39;un groupe de myocytes sans interférence des fibroblastes et la matrice interstitielle; 4) l&#39;évaluation des conséquences fonctionnelles de la manipulation pharmacologique ou génétique en culmonocouches de cellules turés peuvent être effectivement atteints. Par conséquent, HL-1 cellules sont devenues un modèle cellulaire largement utilisé pour étudier divers aspects de la physiologie myocytes ainsi que les activités électriques anormales induite stimulation. 13-16 Cependant, un traitement spécial et des soins est requis à la culture des monocouches de cellules saines qui répondent à l&#39;extérieur la stimulation électrique pour les études de cartographie optiques. En outre, double procédure colorant fluorescent coloration peut facilement endommager l&#39;intégrité des monocouches de cellules confluentes cultivées. Ainsi, l&#39;exécution V m / CA double canal cartographie optique de culture HL-1 monocouches a été un grand défi. L&#39;objectif de cette méthode est de fournir les étapes clés pour effectuer avec succès cartographie optique double canal en culture HL-1 monocouches. Ici, nous avons fourni de nombreux détails sur un protocole optimisé pour une préparation monocouche HL-1 de la cellule, cartographie optique à deux canaux d&#39;une monocouche de cellules cultivées, et le traitement des données de cartographie.

<table><tbody><tr><td>Rhod2 poudre sèche</td><td>AAT Bioquest</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>pluronic</td><td>AAT Bioquest</td><td>20050</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Rh237</td><td>Invitrogen</td><td>S-1109</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr></tbody></table>

tension et calcium double cartographie de canal optique de cultured hl-1 auriculaire myocytes monocouche

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Cartographie optique se est avérée être une technique utile pour détecter l&#39;activité électrique cardiaque à la fois ex vivo intact cœurs et dans des monocouches de myocytes cultivés. cellules HL-1 ont été largement utilisés comme un modèle cellulaire 2 dimensions pour étudier divers aspects de la physiologie cardiaque. Cependant, il a été un grand défi à la carte optiquement calcium (Ca) transitoires et potentiels d&#39;action simultanément à partir du même champ de vision dans une culture cellulaire HL-1 auriculaire monocouche. Ce est parce que la manipulation spéciale et de soins est nécessaire pour préparer les cellules saines qui peuvent être capturées électriquement et optiquement mappés. Par conséquent, nous avons développé un protocole de travail optimal pour la cartographie optique double canal. Dans ce manuscrit, nous avons décrit en détail comment réaliser l&#39;expérience de cartographie optique double canal. Ce protocole est un outil utile pour améliorer la compréhension de l&#39;action potentielle propagation et la cinétique Ca dans le développement de l&#39;arythmie.

Une monocouche confluente culture présente un rythme intrinsèque régulière comme l&#39;a démontré dans Movie 1. Nous avons ensuite effectué V m / Ca cartographie optique double canal dans un cadre entièrement confluentes HL-1 monocouche. Figure 1A montre des exemples de traces de V m et signaux Ca à partir d&#39;une seule enregistrée battre. Cartes isochrones propagée uniformément représentatifs de m V et des signaux de Ca en utilisant le système de cart...

Cet article décrit la technique utilisée pour effectuer une cartographie optique à double canal dans des monocouches de cellules auriculaires HL-1 en culture. Ce protocole unique permet de visualiser simultanément l’activité du calcium (Ca) et de la tension (Vm) dans la même zone pour la détection et l’analyse détaillées des propriétés électrophysiologiques des monocouches de culture.

Tension et calcium double cartographie de canal optique de Cultured HL-1 auriculaire myocytes monocouche

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

L'objectif général de cette procédure est de cartographier simultanément les potentiels transmembranaires et les transitoires calciques dans des monocouches atriales HL-1 chargées avec des colorants calciques et potentiométriques. Cela est réalisé en premier lieu en cultivant les cellules HL-1 sur un lamelle jusqu'à une densité confluente adéquate. La deuxième étape consiste à charger les cellules avec les colorants sensibles au calcium et à la tension.Ensuite, la monocouche HL est stimulée à l’aide d’une électrode bipolaire. L’étape finale consiste à enregistrer les potentiels d’action et les signaux transitoires calciques par microscopie de fluorescence. En définitive, les tracés des potentiels d’action et des transitoires calciques peuvent être compilés afin de montrer la propagation des signaux à travers la monocouche confluente au fil du temps.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'électrophysiologie cardiaque, telles que la relation entre le calcium, les transitoires calciques et les potentiels d'action. Elle permet d'obtenir des informations sur les motifs de propagation des potentiels d'action et des transitoires calciques au niveau microscopique dans les propriétés électrophysiologiques de cellules HL-1 en culture soumises à divers traitements pharmacologiques. Elle peut également être appliquée à des systèmes biologiques tels que les cœurs humains remaniés pathologiquement et les modèles animaux arrhythmogènes.En général, les personnes novices avec cette méthode éprouvent des difficultés, car les cellules HL-1, qui conservent les phénotypes cardiaques de souris, sont difficiles à cultiver et nécessitent une optimisation minutieuse. Le protocole requis comprend le passage des cellules et la formation d'une monocouche. Pour commencer, préparez toutes les solutions mères pour l'expérience comme indiqué dans le protocole écrit, faites croître les cellules HL-1 dans des flacons T 25 et remplacez le milieu par cinq millilitres de milieu Claycomb complété frais chaque jour.Les cellules doivent être prêtes à être repiquées au jour 5, 24 heures avant que les cellules HL1 n'atteignent la confluence. Placer des lamelles rondes de 20 millimètres dans les puits d'une plaque de culture 12 puits. Ajouter un millilitre de solution de gélatine-fibronectine dans chaque puits afin d'enduire les lamelles, puis incuber la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, aspirez la solution de gélatine et de fibronectine des puits de la plaque de culture, puis ajoutez 1,5 millilitre de milieu de culture final enrichi à chaque puits. Ensuite, aspirez le milieu du flacon T 25 contenant les cellules HL one, puis rincez brièvement la culture avec du PBS à 37 degrés Celsius. Aspirez le PBS du flacon et ajoutez trois millilitres de la solution de trypsine-EDTA au fond du flacon T 25 afin de ne pas perturber les cellules ; inclinez délicatement le flacon et faites-le tourner pour recouvrir les cellules avec la solution, puis placez le flacon dans l’incubateur pendant une minute à 37 degrés Celsius.Ensuite, aspirez soigneusement la solution de tripsine-EDTA de la culture afin de ne pas perturber les cellules. Puis ajoutez 1,3 millilitre supplémentaire de la solution de tripsine-EDTA au flacon. Incubez le flacon à température ambiante pendant une minute supplémentaire.Observer les cellules au microscope afin de déterminer si elles se sont détachées de la surface du flacon. Tapoter doucement le flacon pour détacher les cellules qui resteraient encore adhérentes. Une fois que toutes les cellules sont détachées, ajouter 1,3 millilitre de la solution d'inhibiteur de la trypsine de soja aux cellules, puis transférer les cellules dans un tube de centrifugation de 15 millilitres.Rincez le flacon vide avec cinq millilitres du milieu de lavage et ajoutez le rinçage aux cellules dans le tube. Centrifugez le tube à 500 ×g pendant cinq minutes, puis aspirez le surnageant S sans perturber le culot cellulaire. Resuspendez délicatement le culot cellulaire dans six millilitres de milieu supplémenté.Ajoutez 0,5 millilitre de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de culture. Incubez les plaques à 37 degrés Celsius, en renouvelant le milieu quotidiennement jusqu'à ce que les cultures soient confluentes. Pour préparer les solutions de colorant de travail, diluez les solutions mères Road 2 et RH 2 37 au 1/1000 dans la solution saline de Hank.Observer les plaques de culture à 12 puits au microscope afin de déterminer si les cellules HL-60 sont confluentes. Généralement quatre jours après le semis, lorsque les cellules sont confluentes, retirer délicatement le lamelle du puits et rincer le lamelle avec une solution saline de Hank. Placer le lamelle dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant trois millilitres de solution working road two.Placer la boîte de Pétri dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et insuffler un flux continu de gaz dans la solution pour l'oxygéner. Incuber pendant 30 minutes afin de colorer les cellules avec le colorant sensible au calcium. Ensuite, transférer la lame couvre-objet dans trois millilitres de solution RH 2 37 oxygénée et incuber pendant 15 minutes.La monocouche cellulaire doit maintenant être marquée avec des colorants sensibles au calcium et au voltage. Pour préparer les cellules à l’imagerie, placez la lame recouverte de la monocouche cellulaire doublement marquée dans une chambre de circulation sur un microscope à fluorescence inversé. Ajustez la vitesse d’écoulement dans la chambre afin de maintenir la température à 35 degrés Celsius avec un gradient ne dépassant pas 0,3 degré Celsius à travers la chambre.Faites circuler une solution saline de Hank à travers la monocouche cellulaire pendant cinq minutes afin d'éliminer tout excès de colorant. Après le lavage de la monocouche, placez une électrode bipolaire dans la solution aussi près que possible de la monocouche sans toucher les cellules. Évaluez l'état de santé de la monocouche conformément au protocole décrit dans le texte.Pour stimuler le monocouche. Programmer l'électrode afin d'appliquer des impulsions d'une durée de deux millisecondes pendant une période allant jusqu'à 500 millisecondes par cycle. Pendant la stimulation du monocouche, acquérir des images des cellules à l'aide d'un objectif 40 x et exciter les capteurs sensibles au calcium et à la tension membranaire.À l’aide d’une source lumineuse à LED couplée à un filtre d’excitation et à un miroir dichroïque, faire passer la fluorescence émise à travers un miroir dichroïque afin de séparer les signaux sensibles au calcium et à la tension, puis recueillir les signaux fluorescents séparément à l’aide de deux caméras CCD. Imager quatre zones différentes de la monocouche pour obtenir une couverture complète, en veillant à enregistrer le signal moins de deux secondes par champ. Pour éviter le photoblanchiment.Une monocouche confluente de HL one présente un rythme de contraction régulier lorsqu'elle est stimulée par l'électrode. Les signaux de tension et de calcium ont été enregistrés pour un battement unique, stimulé électriquement, de la monocouche de HL one, avec un cycle de 500 millisecondes ; le début du signal de tension survient peu avant le transitoire calcique. Le signal calcique persiste plus longtemps que le signal de tension en surface.Des cartes d'intensité ont été générées à partir des signaux fluorescents de voltage et de calcium provenant de la monocouche de cellules HL. Au cours d'un intervalle de temps de 200 millisecondes, le bleu indique un signal faible tandis que le rouge indique un signal élevé. Les deux signaux commencent à gauche de la monocouche et se propagent à travers celle-ci vers la droite.Au fil du temps, les potentiels d'action se propagent et reviennent à la ligne de base beaucoup plus rapidement que le signal calcique Une fois. Cette procédure de cartographie peut être réalisée en une heure si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des cellules ayant une densité optimale et de faire preuve de prudence lors du positionnement des électrodes de stimulation afin d'éviter d'endommager la monocouche.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d'une monocouche de cellules atriales optiquement cartographiées, en utilisant des colorants sensibles au calcium et au voltage.

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Multiparamétrique cartographie optique du Cœur lapin perfusé de Langendorff

Ce document détaille la procédure de dissection, la configuration instrumentale, et des conditions expérimentales lors de la cartographie optique de potentiel transmembranaire (Vm) et de calcium intracellulaire transitoire (CAT) dans Langendorff isolés perfusés intacte cœur de la souris.

Cartographie optique de potentiels d&#39;action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

Cet article décrit le protocole détaillé et l'équipement nécessaire pour une double cartographie optique du potentiel transmembranaire (V m) et d'une connexion intra-réticulum sarcoplasmique (SR) Ca 2+ dans le coeur de lapin Langendorff perfusé. Cette méthode permet l'observation directe et la quantification de V m et SR Ca 2+ dynamique dans le coeur intact.

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Nous décrivons ici l’acquisition optique et la caractérisation des potentiels d’action à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites à l’aide d’un système de photométrie modulaire à grande vitesse.

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Tension et calcium double cartographie de canal optique de Cultured HL-1 auriculaire myocytes monocouche

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