Automated quantification des cellules hématopoïétiques - Interactions cellulaires stromales dans les images histologiques de décalcifiées os

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les associations entre des sous-ensembles cellulaires spécifiques dans la moelle osseuse. Ceci est accompli en collectant d’abord des coupes cryologiques histologiques de tumeurs de fémurs de souris. Dans un deuxième temps, les coupes sont colorées pour l’analyse par immunofluorescence et des images confocales sont acquises.

Les images sont ensuite analysées numériquement. En fin de compte, les positions des différents types de cellules peuvent être simulées pour calculer les taux et la fréquence de contact entre les cellules immunologiques spécifiques d’intérêt et leur microenvironnement. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous analysions les niches microenvironnementales des plasmocytes à longue durée de vie dans la moelle osseuse, et nous avions besoin d’une méthode pour quantifier sans ambiguïté les associations cellulaires dans le tissu de la moelle osseuse.

RA Maya vous montrera la procédure de cryo-aspiration des os fémoraux d’une souris adulte. Tout d’abord, réglez la température de l’échantillon et de la lame d’un microtome standard équipé d’une lame de tissu dur à moins 24 degrés Celsius. Après une acclimatation de 15 minutes.

Fixez un bloc d’échantillon sur le porte-échantillon métallique avec un milieu d’enrobage cryogénique et ajustez l’orientation du bloc si nécessaire. Coupez l’échantillon jusqu’à ce que l’os soit complètement ouvert et que la moelle soit visible. Ajustez ensuite l’épaisseur d’une section à sept microns.

Ensuite, fixez un morceau de ruban adhésif kawamoto avec le côté collant sur le dessus d’un bloc d’échantillon à l’aide d’une spatule en bois recouverte de cuir Sectionnez l’échantillon et à l’aide d’une pince. Tournez le ruban de manière à ce que la section soit positionnée sur la face supérieure. Transférez ensuite la bande sur une lame de microscope en verre.

Fixez le ruban adhésif à la diapositive de verre avec du scotch lorsque la dernière section a été collectée. Laissez les échantillons conduire pendant au moins 30 minutes et stockez les lames à moins 80 degrés Celsius. Deux femmes imaginent que les échantillons colorent les sections cryogéniques décongelées selon les protocoles d’immunofluorescence courants.

Assurez-vous d’inclure une coloration nucléaire pour visualiser l’intégrité des tissus. Une fois les sections colorées, ajoutez une goutte de support au sol à chaque échantillon, suivie d’une lamelle de verre numéro un sur un microscope confocal à balayage laser. Sélectionnez l’objectif 20x et définissez une vue de terrain de 708 points 15 par 708 points 15 microns.

Ensuite, imagez les échantillons un par un à 2048 par 2048 pixels par image pour que les résultats restent comparables. Enregistrement des images dans un canal pour visualiser les structures stromales, un canal pour les noyaux et des canaux supplémentaires pour les cellules hématopoïétiques d’intérêt si nécessaire. Enregistrez les images à l’aide de la moyenne de ligne.

Idéalement, il s’agit de capturer des images uniques adjacentes pour couvrir l’ensemble de la section fémorale. Enregistrez ensuite les images dans un format de fichier image de microscopie. Exportez ensuite un fichier JPEG par canal pour chaque zone imagée, et utilisez un outil d’analyse d’images pour effectuer la quantification de la segmentation d’image de la colocalisation et l’analyse de voisinage avant d’exécuter les simulations de la cellule aléatoire.

Positionnement sur les images de moelle osseuse analysées pour chaque image à simuler. Placez les fichiers suivants dans un seul dossier, les fichiers CSV uniques fournis par l’outil de contact de cellule. Les fichiers JPEG du canal DPI d’origine et les fichiers JPEG du canal stromal d’origine pour effectuer des simulations par lots sur la série d’images d’un seul échantillon fémoral afin de transférer tous les fichiers JPEG d’origine et leurs fichiers CSV uniques correspondants dans un autre dossier à ce moment-là également.

Une fois tous les fichiers assemblés, démarrez l’outil de simulation. Cochez ensuite la case de chargement automatique des données de l’image. Lorsque cette option est cochée, les fichiers CSV correspondant aux images analysées s’ouvrent automatiquement.

Ensuite, entrez la balise commune pour les fichiers CSV et le nombre de visionneuses d’images à utiliser pour la simulation en mode batch. Chargez ensuite le fichier J peg généré à partir du canal stroma S avec un nom de fichier se terminant par trois pour générer le masque pour le canal DPI. Cochez la case Appliquer un masque et définissez le seuil de conversion de l’image PPP en masque binaire sur 10.

Cochez les cases huit bits et dilate et réglez le degré de dilatation sur cinq pixels. Cochez ensuite la case d’érosion de la largeur. Entrez ensuite la valeur souhaitée pour le rayon de voisinage utilisé pour l’analyse des images simulées, et cochez la case utiliser OSU pour utiliser l’algorithme OSU pour la détection automatique des structures stromales des cellules hématopoïétiques.

Simulé sous forme de formes circulaires. Mesurez la distribution de la taille des cellules des types de cellules analysés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images qui inclut les fonctions de segmentation d’objets appropriées, et déterminez le sigma pour tous les types hématopoïétiques à partir de ces mesures. La limite de taille de cellule, c’est-à-dire le diamètre en pixels qui décrit le plus petit objet encore reconnu comme cellule complète par l’outil d’analyse d’image, peut être déterminée.

Entrez ensuite la limite de taille de cellule et le sigma en pixels pour la simulation de la distribution de la taille de cellule pour les cellules rouge, verte et bleue. Ensuite, dans l’onglet Cellules et masque, cochez la case Supprimer pour permettre au programme de choisir une nouvelle position pour une cellule si elle chevauche au moins un pixel dans une zone interdite du masque. Sous l’onglet d’exclusion de cellule, cochez également la case Éviter le chevauchement des cellules.

Entrez ensuite la distance minimale autorisée entre les centres de deux cellules en pixels. Si le chevauchement est défini par la distance minimale entre le centre d’une cellule et le centre d’une autre, définissez la zone maximale de chevauchement sur 100 %Ensuite, réglez l’outil de simulation sur 1000 répétitions. Cochez ensuite la case de vente d’enregistrement automatique pour enregistrer les coordonnées des objets simulés pour toutes les répétitions de chaque image du lot sous forme de fichiers détruits au format texte.

Entrez également une balise commune pour les fichiers enregistrés. Enfin, cliquez sur exécuter la simulation et déterminez les fréquences moyennes de contact et de voisinage des ensembles de 1000 images simulées correspondant à chaque image enregistrée. Pour cette division, le contact et le voisinage moyens sont comptés par le nombre de cellules enregistrées par image, et comparent les fréquences aux résultats de l’analyse de colocalisation automatisée de l’image enregistrée.

Dans cette figure, une analyse de localisation des éosinophiles, des plasmocytes et des lymphocytes B avec le microenvironnement des cellules stromales avec une moelle osseuse chimérique fluorescente est présentée. Les fichiers CSV générés par les outils de contact et de voisinage de cellule contiennent le nombre de cellules et la surface totale de chaque population de cellules en pixels, ainsi que le nombre de contacts ou de voisinage. Avant d’effectuer une simulation du positionnement aléatoire des cellules, les paramètres qui décrivent la distribution de la taille des cellules comme une distribution gaussienne doivent être déterminés dans cette simulation, les valeurs relatives du sigma mesuré pour les trois populations cellulaires ont été maintenues.

Alors que les valeurs Sigma définies en pixels ont été définies pour correspondre à l’aspect visuel des cellules enregistrées afin de définir les zones où les cellules peuvent être placées, un masque a été généré à partir du canal DAPI. Une valeur de 10 a ensuite été déterminée comme étant le seuil de densité optimal pour générer les images binaires. La pertinence des contacts des plasmocytes, éosinophiles ou lymphocytes B avec les cellules stromales a ensuite été testée comme prévu.

Ces analyses ont révélé des taux de contact significativement plus élevés dans les images enregistrées par rapport à la simulation pour les plasmocytes et les lymphocytes B. En revanche, aucune différence nette n’a été observée pour le contact avec les cellules stromales éosinophiles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans n’importe quel domaine nécessitant l’analyse de la structure tissulaire complexe de la moelle osseuse, comme l’immunologie, l’hématologie, la pathologie ou la biologie des cellules souches.