Une technique Temps différentiel coloration Couplé avec Full Gill bilatérale dénervation pour étudier ionocytes à Fish

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la prolifération des cytes brachiaux dans les branchies des poissons rouges, sans innervation extrinsèque. Ceci est accompli en plaçant d’abord le poisson dans un bain de colorant spécifique aux mitochondries pour colorer les mitochondries préexistantes, riches en cytes brachiaux. La deuxième étape consiste à effectuer une dénervation bilatérale complète des branchies.

Ensuite, les poissons sont euthanasiés. Les branchies sont récoltées. Les cytes An sont marqués à l’aide d’un anticorps contre le sodium et le potassium au niveau des TPA.

Ensuite, la dernière étape consiste à imager et à compter les cytes préexistants et nouvellement différenciés. En fin de compte, cette technique de coloration différentielle dans le temps avec dénervation de guilde bilatérale est utilisée pour montrer la prolifération et la distribution des cytes branchiaux chez les poissons rouges sans aucun apport nerveux du système nerveux central. Le principal avantage de cette technique est donc qu’elle peut être utilisée pour comprendre l’absorption dynamique des ions et examiner la redistribution des cytes dans les épithéliums gastro-intestinaux des poissons.

Tout d’abord, préparez une solution mère rouge mitrale millimolaire en dissolvant 50 microgrammes dans 94 microlitres de sulfoxyde de diméthyle, et protégez-la de la lumière. Ensuite, préparez trois à six boîtes sombres d’un volume maximal de 600 millilitres. Remplissez chaque boîte avec 400 millilitres d’eau du système et placez une pierre à air dans chacune pour fournir une source d’oxygène.

Placez les poissons rouges de 30 à 40 grammes dans les boîtes. Après 30 minutes, ajoutez la solution de suivi Mitre pour obtenir une concentration complète de colorant micromolaire de 0,1 % et de DMSO à 0,01 %. Baignez le poisson pendant quatre heures.

Après quatre heures, ouvrez le débit d’eau vers les boîtes et laissez le colorant s’écouler. S’il s’agit d’animaux témoins, récupérez le poisson pendant trois à cinq jours, puis passez à l’immunohistochimie, sinon passez à la procédure de dénervation bilatérale complète. Tout d’abord, anesthésez le poisson en le plaçant dans un bain d’eau benzocaïne aérée.

Une fois que la respiration a cessé, placez le poisson sur une table d’opération et insérez un tube dans la cavité buccale. Pour irriguer les branchies avec une solution anesthésique aérée, positionnez le poisson de manière à ce que la tête soit légèrement inclinée vers le bas pour permettre un meilleur accès à la zone située derrière le quatrième arc branchial. Soulevez doucement l’opercule avec une pince à motif standard droit, puis placez des écarteurs de tissu entre l’opercule et l’intérieur de la tête. Ouvrez soigneusement les écarteurs de tissus pour éloigner l’opercule de la tête et gardez les branchies exposées.

Posez les poignées de l’écarteur à côté de la tête pour permettre l’accès aux quatre arcs branchiaux. Vérifiez que la solution anesthésique irrigue les branchies et placez des pinces à motif standard incurvées ou droites entre le quatrième arc branchial et l’arrière de la tête. Ouvrez doucement la pince pour créer une tension dans le ligament.

Attacher le quatrième arc branchial à la tête avec une paire de pinces numéro cinq. Créez une ouverture de deux à trois millimètres en perçant l’épithélium, reliant l’extrémité dorsale des arcs branchiaux à la cavité auriculaire. Attention à ne pas entrer trop profondément car il y a un risque d’endommager un vaisseau sanguin important.

Ensuite, tenez un petit coton-tige avec la pince numéro cinq et utilisez-le pour élargir soigneusement l’incision afin d’exposer les neuvième et dixième nerfs. Libérez les nerfs de tout tissu conjonctif à l’aide de la pince chiffre cinq. Encore une fois, en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins.

Une fois que les nerfs ont été exposés et identifiés, utilisez les ciseaux à ressort incurvés pour couper soigneusement les nerfs tout en tenant l’incision. Ouvrez avec la pince droite de forme standard. Après avoir sectionné les nerfs, rétractez doucement la pince incurvée et retirez le tissu.

Les sutures de l’écarteur ne sont pas nécessaires car l’incision doit se fermer d’elle-même dans les 24 à 48 heures. Après avoir répété la procédure de l’autre côté de la tête, passez de l’irrigation des branchies de l’anesthésie à l’eau douce aérée et laissez le poisson se remettre de l’anesthésie. Une fois que les mouvements auriculaires ont repris, déplacez le poisson dans des bassins expérimentaux pour qu’il récupère pendant au moins 24 heures.

Enfin, effectuez une procédure simulée sur un ensemble séparé de poissons en perçant l’épithélium derrière le quatrième arc branchial sans sectionner les nerfs avant d’euthanasier le poisson. Placez trois à quatre millilitres de PFA à 4 % dans un flacon à scintillation. Utilisez une fiole par arc branchial.

De plus, prenez un petit bateau de lactosérum et remplissez-le d’un XPBS. Cela sera utilisé pour laver le tissu après qu’il ait été excisé. Gardez toutes les solutions sur la glace.

Après avoir euthanasié le poisson avec une surdose de benzocaïne, utilisez des pinces émoussées pour soulever la permanente d’un côté de la tête et des ciseaux incurvés pour sectionner chaque extrémité du panier branchial brachial. Ensuite, utilisez une pince émoussée pour ramasser soigneusement les branchies par les rackers et les retirer de la cavité auriculaire. Lavez immédiatement les branchies dans un XPBS glacé pour éliminer l’excès de benzène et de sang et placez les branchies excisées dans un flacon rempli de 4 % de PFA, fixez toutes les branchies excisées pendant la nuit à quatre degrés Celsius après la fixation.

Lavez X-S-P-F-A dans un XPBS et placez le mouchoir dans un tube de balle de deux millilitres rempli de 1,5 millilitre de 1 % de Tritton x. Placez les tubes de balle sur un shaker pendant six heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Pour perméer le tissu, préparez une dilution de un à 250 de chaque anticorps primaire en ajoutant quatre microlitres d’anticorps primaires NKA et ZN 12 dans 992 microlitres d’un XPBS.

Assurez-vous que les deux anticorps primaires ont été élevés chez le même hôte. Aspirez la solution de Triton X et, sans laver d’abord, les tissus et la solution d’anticorps primaires et incubez sur un agitateur pendant six heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, aspirez la solution d’anticorps primaires et lavez-la trois fois pendant trois minutes chacune.

En utilisant un XPBS. Préparez l’anticorps secondaire à une dilution de un à 200 en mélangeant cinq microlitres d’anticorps secondaire de base dans 995 microlitres d’un XPBS. Après avoir aspiré le PBS du dernier lavage, appliquez l’anticorps secondaire et incubez pendant six heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur.

Enfin, éliminez tout excès d’anticorps secondaire en lavant le tissu trois fois pendant cinq minutes chacune comme auparavant, après les lavages, montez le tissu en plaçant d’abord une branchie dans une goutte de 200 microlitres d’un XPBS sur une lame de microscope plate. Pour s’assurer que le tissu ne se dessèche pas. Séparez les branchies hemi Brinks avec des micro-ciseaux incurvés.

Placez ensuite une goutte d’un XPBS et une goutte de support de montage dans la dépression d’une lame concave. Placez les hémisphères séparés dans la lame concave avec le bord d’attaque du filament vers le haut et recouvrez d’une lamelle de vernis à ongles. Afin d’éviter que la lamelle ne se déplace et ne déplace le tissu, laissez le tissu se déposer au fond de la lame concave pendant 10 à 15 minutes avant l’imagerie.

Pour chaque arc branchial, sélectionnez six filaments branchiaux au hasard pour l’imagerie, produisant six images par arc branchial. Utilisez la microscopie confocale conventionnelle pour imager le tissu en prenant des coupes optiques d’un à trois micromètres dans les images suivantes, les cytes indiqués par des pointes de flèches ont été colorés avec l’anticorps alpha cinq et les nerfs indiqués par des flèches ont été colorés avec l’anticorps ZN 12. Cette image confocale d’un filament branchial d’un poisson témoin montre une innervation extrinsèque avec une ramification laculaire étendue d’un faisceau nerveux central, provenant probablement des neuvième et dixième nerfs, comme on le voit sur l’image en médaillon.

Certains des cytes indiqués sont également innervés. Cette image montre un filament branchial deux jours après une dénervation bilatérale complète. Il y avait une réduction du faisceau nerveux central tandis que l’innervation laminaire semblait largement intacte.

Ici, un filament branchial montré cinq jours après une dénervation bilatérale complète démontre que l’innervation extrinsèque est maintenant largement absente. L’analyse qualitative suggère que la dénervation bilatérale complète provoque la dégradation de l’innervation branchiale extrinsèque tout en maintenant les nerfs avec des corps cellulaires à l’intérieur du filament branchial, créant un réseau de nerfs à travers le filament et dans le boiteux. Cette procédure peut être couplée à d’autres méthodes telles que la mesure des flux d’ions, en utilisant des ions radioactifs comme le sodium 22 afin de répondre à des questions de recherche supplémentaires.