amplification isotherme (LAMP) Essais de boucle médiation pour la détection des espèces spécifiques de

L’objectif global de cette procédure est de diagnostiquer l’apparition de parasites de l’espèce I myea dans un poulet ou un troupeau de poulets. Pour ce faire, il faut d’abord préparer les réactifs pour l’amplification isotherme médiée par boucle ou la réaction de lampe. Ensuite, l’ADN génomique total est préparé à partir d’un ou plusieurs sites intestinaux post-mortem.

Ensuite, l’ADN génomique est ajouté au mélange maître de lampe et incubé. Enfin, le résultat de l’essai de la lampe est évalué. En fin de compte, le LAMP est utilisé pour déterminer l’occurrence d’espèces spécifiques d’Imiria afin d’améliorer la gestion des stocks et comme outil de diagnostic des maladies.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes traditionnelles comme la microscopie morphologique ou la PCR est qu’elle est moins subjective et qu’elle ne nécessite pas d’installations de laboratoire coûteuses. L’utilisation de cette approche peut améliorer la santé et le bien-être des poulets en améliorant le diagnostic de l’infection à Arian. Pour préparer le modèle de la lampe Erea ase, choisissez la section de l’intestin à tester.

Utilisez ce tableau comme guide pour le choix du site d’échantillonnage et des espèces d’éria les plus susceptibles d’être présentes. Ceci est d’une importance capitale car chaque espèce qui infecte les poulets est définie par la région intestinale qu’elle cible à l’aide de ciseaux stériles ou d’un scalpel. Exciser des longueurs de cinq centimètres ou plus des sections intestinales sélectionnées pour tester l’éria.

Ouvrir l’échantillon longitudinalement. Retirez la majeure partie du contenu intestinal et utilisez le bord d’un microscope en verre stérile. Faites glisser ou stérilisez la lame des ciseaux pour gratter les cellules de la couche muqueuse.

Placez le matériau gratté dans un micro-tube à centrifuger stérile à vis de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de TE stérile avec 10 % de poids, mais de volume de cellule X 100 de résine et vissez fermement le dessus. Agitez vigoureusement les échantillons pendant une minute, puis incubez dans un bain d’eau bouillante pendant 10 minutes. Après ébullition, laissez chaque échantillon refroidir à la température ambiante pendant une à deux minutes.

Centrifuger les échantillons à 10 000 fois G pendant une minute avant de prélever deux microlitres de surnageant par essai à lampe pour servir de modèle pour préparer des stocks d’amorces de lampe à miria suffisants pour 100 essais. Reconstituez chaque amorce de lampe miria lyophilisée en ajoutant de l’eau de qualité moléculaire à une concentration de 100 pipettes micromolaires, 60 microlitres d’eau de qualité moléculaire dans un tube à micro-centrifuger relevable séparé de 0,5 millilitre pour chaque espèce d’iria à doser. En utilisant le volume indiqué dans ce tableau.

Ajoutez à l’eau des amorces, F-I-P-B-B-I-P-F, trois, B, trois, LF et LB, spécifiques à l’espèce d’eria cible. Création d’une série de sept mélanges d’amorces spécifiques à l’espèce. Inversez brièvement les solutions d’amorce pour les mélanger, pulsez-les micro-fuge et congelez-les jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

À l’aide des volumes énumérés dans ce tableau et des directives du protocole de texte, préparer un mélange maître de réaction à la lampe pour chaque espèce d’iria à analyser afin d’effectuer le dosage à la lampe pipette de 23 microlitres de mélange maître de lampe polymérase B-S-G-D-N-A spécifique à l’espèce IEA DANS UN TUBE DE MICRO-CENTRIFUGEUSE de 0,5 millilitre. Ajoutez deux microlitres de matrice d’ADN préalablement préparée, ce qui fait un volume de réaction final de 25 microlitres comme contrôle positif. Ajoutez deux microlitres d’ADN génomique spécifique à l’espèce eria à une réaction.

Ajoutez deux microlitres d’eau de qualité moléculaire à une réaction en tant que témoin négatif en incubant un bain-marie ou un bloc de chaleur à 62 degrés Celsius pendant 30 minutes. En option, désactivez la polymérase B-S-T-D-N-A en chauffant à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Si la réaction ne doit pas être lue immédiatement à la fin de l’incubation sous la lumière intérieure, évaluez la couleur de chaque réaction à l’œil nu.

Les résultats négatifs apparaîtront de couleur rose à violette et les résultats positifs apparaîtront. Bleu ciel en option. Pour confirmer le résultat du test à la lampe, mélangez cinq microlitres de produit de réaction à la lampe avec un microlitre de tampon de chargement de gel d’ADN et exécutez sur un gel de précoloration à 2 % ARO.

Utilisez une échelle d’ADN de taille moléculaire de base tueuse pour déterminer la taille des fragments, en testant trois. Des oiseaux prélevés dans un élevage de poulets de chair aux États-Unis dans le cadre d’un programme de surveillance ont permis d’obtenir trois séries d’échantillons intestinaux, comme le montre ici. Application ciblée des tests à la lampe spécifiques à l’espèce et hiérarchisation des sites intestinaux préférés pour chaque Imiria.

L’espèce a permis l’identification visuelle d’une infection à l’irian chez tous les oiseaux testés en utilisant le bleu hydroxynatal comme indicateur. La couleur obtenue avec une réaction négative de la lampe lors de l’utilisation de l’hydroxy peut aller du violet au rose, mais est toujours distincte du bleu obtenu par un résultat positif. La confirmation par électrophorèse sur gel d’aose a donné des résultats comparables à ceux présentés ici.

La préparation de l’ADN à partir d’un échantillon prélevé par oiseau représentant le matériel recueilli dans chacun des sites intestinaux spécifiques et testé avec les sept tests à la lampe a permis d’obtenir le même résultat que lorsque chaque site intestinal a été traité séparément. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 45 minutes si elle est effectuée correctement en suivant cette procédure. D’autres techniques comme le scoring des lésions peuvent également être effectuées afin d’évaluer la santé intestinale globale.