Name: Génération et greffage des navires par ingénierie tissulaire dans un modèle de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Découvrez la génération de greffes vasculaires par ingénierie tissulaire à partir de cellules souches pluripotentes partiellement induites et leur implantation chez la souris. Cette méthode avance la médecine régénérative.

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Ce travail a été soutenu par la British Heart Foundation et la The Oak Foundation.

Effectuer toutes les expériences sur les animaux selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel pour entretien et utilisation des animaux de laboratoire. 1. Préparation de la Culture, des Médias <ol><li> Faire milieux de culture pour la lignée cellulaire de fibroblaste humain CCL-153 F-12K moyen, 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 100 U / ml de pénicilline et de la streptomycine. </li><li> Assurez Reprogrammation médias pour la production de l&#39;IPFPC: le milieu de l&#39;aigle modifiée de Knockout Dulbecco (DMEM) contenant 20% de remplacement Knockout de sérum, 0,1 mM β-mercaptoéthanol, 0,1 mM milieu essentiel minimum (MEM) acides aminés non essentiels, 10 ng / ml de facteur de croissance des fibroblastes de base 2 (bFGF-2) et 100 U / ml de pénicilline et de la streptomycine. Ajouter bFGF-2 fraîchement à chaque fois avant d&#39;utiliser les médias. </li><li> Faire différenciation Media (DM) pour induire des cellules musculaires lisses (SMC) différenciation: α-MEM contenant 10% de FBS, 0,1 mM de facteur de croissance β-mercaptoéthanol, 100 U / pénicilline et de streptomycine et 25 ml ng / ml dérivé des plaquettes(PDGF-ββ). </li><li> Assurez-endothéliale différenciation Media (EC-DM) pour induire des cellules endothéliales (CE) la différenciation: la croissance endothéliale médias 2 (EGM-2) des milieux contenant 50 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) et 100 U / ml de pénicilline et de la streptomycine. </li></ol> 2. reprogrammation des fibroblastes humains en cellules souches pluripotentes induites partiellement (IPFPC) <ol><li> Culture lignée cellulaire de fibroblaste humain CCL-153 à 0,04% de solution de gélatine dans des flacons revêtus de milieu de culture. </li><li> Passage de cellules tous les 3 jours à un rapport de 1: 6. Utilisez cellules avant passage 9 pour une efficacité optimale de la production de l&#39;IPFPC. Cellules sont prêtes pour la transfection en atteignant 80 à 90% de confluence. </li><li> Linéariser pCAG2LMKOSimO plasmidique polycistronique contenant quatre facteurs de reprogrammation octamère-facteur de transcription liant 4 (OCT4), SOX2, facteur Kruppel-like 4 (KLF4) et C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 ug de plasmide avec 5 unités de l&#39;enzyme de restriction Pvul pendant 3 heures à 37 ° C. Purifierle plasmide avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. </li><li> Transfecter 2 x 10 6 fibroblastes humains avec 4 pg de linéarisé pCAG-OSKM plasmide par électroporation avec le kit de fibroblastes dermiques humains (NHDF) de nucléofection selon le protocole du fabricant. Ensemencer en douceur les cellules transfectées sur pré 0,04% de gélatine revêtu flacon T25 contenant 5 ml de pré-chauffé Reprogrammation médias. </li><li> Après 24 h, avec des suppléments changer moyen de 25 ug / ml de néomycine pour sélectionner une population pure de cellules transfectées. </li><li> Changer le milieu tous les deux jours jusqu&#39;à ce jour 4. Remarque: Des fibroblastes humains deviennent IPFPC après 4 jours de reprogrammation. </li></ol> 3. Différenciation de l&#39;IPFPC en endothéliales et les cellules musculaires lisses <ol><li> Seed IPFPC sur les plats collagène IV pré-enduits contenant DM pour quatre jours pour induire la différenciation en SMC. Changer le milieu tous les deux jours jusqu&#39;à ce jour 4. </li><li> Seed IPFPC sur le collagène IV pré-enduits plats contenant endothéliale-DM pour 6 jours pour induire la différenciation en cellules endothéliales. Changer le milieu tous les jours jusqu&#39;au jour 6. </li></ol> 4. décellularisée Aorte Graft Préparation Remarque: Toutes les solutions et les équipements doivent être stériles. <ol><li> Sacrifiez la souris par dislocation cervicale et fixer la souris dans une position couchée dans la dissection microscope. </li><li> Couper à travers le sternum et autour de la cage thoracique pour ouvrir la cavité thoracique. Retirer le cœur, les poumons et de l&#39;œsophage pour exposer l&#39;aorte. Retirez délicatement la graisse péri-aorte avec une pince. </li><li> Couper l&#39;aorte de l&#39;extrémité antérieure avec des ciseaux et tenir doucement la fin avec une pince contondants. Détachez l&#39;aorte de la colonne de la colonne vertébrale derrière par dissection. Fermer soigneusement toutes les artères de branchement de l&#39;aorte par ligature avec un électrocoagulateur bipolaire et la coupe de l&#39;extrémité de la ligature avec des ciseaux. </li><li> Utilisez une seringue de 5 ml pour rincer la lumière de l&#39;aorte avec 3 ml de solution saline contenant 100 U d&#39;héparine pour empêcher la formation de caillots sanguins. </li><li> Coupez l&#39;extrémité postérieure de l&#39;aorte saisi branches dans le rénale. Maintenir l&#39;intégrité de l&#39;aorte est très important au cours de toute la procédure. </li><li> Rincer la lumière de l&#39;aorte avec 5 ml de 0,075% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). </li><li> Faire tremper l&#39;aorte thoracique en solution SDS 0,075% dans une boîte de 10 cm de Pétri. Placer la boîte de Pétri sur un agitateur orbital pendant 2 heures à 150 tours par minute à température ambiante. </li><li> Rincer la lumière de l&#39;aorte avec 5 ml de PBS. </li><li> Faire tremper l&#39;aorte dans du PBS dans un plat 10 cm Petri. Placer la boîte de Pétri sur l&#39;agitateur orbital pendant 2 heures à 150 tours par minute à température ambiante. Actualiser PBS toutes les 20 min. </li><li> Rincer la lumière de l&#39;aorte avec 5 ml de PBS. </li><li> Gardez décellularisée greffe de l&#39;aorte dans du PBS à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. </li></ol> 5. Double semis de l&#39;IPFPC et bioréacteur climatisé Remarque: Tous solutions et l&#39;équipement doivent être stériles. Effectuer toutes les opérations dans une hotte de culture de tissu. <ol><li> Assembler le circuit d&#39;écoulement du bioréacteur, comme illustré sur la figure 1. Connecter chambre d&#39;incubation, réservoir à fluide, la pompe péristaltique et la chambre de conformité avec les tubes. Volume minimal de milieu nécessaire pour la circulation est de 40 ml. </li><li> La condition préalable de la cuve décellularisé avec du milieu de culture par trempage de l&#39;aorte dans un milieu de DM dans une boîte de Petri de 10 cm. Placer la boîte de Pétri sur l&#39;agitateur orbital pendant 1 heure à 50 tours par minute à température ambiante. </li><li> Insérer les tubes 1 cm longueur de nylon (OD 0,9 mm, 0,75 mm ID) dans les deux extrémités de l&#39;enceinte sous microscope décellularisé. Attachez le navire et les tubes avec 8-0 sutures de soie. </li><li> Assembler le greffon aortique décellularisé dans la chambre d&#39;incubation en reliant les tubes en nylon avec les orifices d&#39;entrée et de sortie (1/32 &quot;) de tubes de la paroi de la chambre. Maintenir chambre d&#39;incubation avec 5 ml de milieu à chaque fois. </li><li> Trypsiniser IPFPC en ajoutant préchauffétrypsine pour couvrir la boîte de culture et de bercer doucement le plat 10 fois. Jeter la trypsine et de laisser le plat dans l&#39;incubateur pour les 2-3 min. Ajouter milieu de culture préchauffé dans le plat et mélangez le milieu avec les cellules. </li><li> Compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. Centrifugeuse deux aliquotes de suspensions cellulaires contenant 5 x 10 5 cellules chacun pendant 5 minutes à 300 x g. Aspirer le surnageant complètement. </li><li> Après aspiration du surnageant complètement, remettre en suspension une pastille de The Pips culots cellulaires dans 50 pi de DM. Injecter cette suspension de cellules dans la lumière du vaisseau décellularisé. </li><li> Ensuite, remettre en suspension le culot PiPS autre des cellules dans 100 ul de Matrigel. Pipetter prudemment le mélange sur la greffe de l&#39;aorte décellularisée. </li><li> Attendre 10 à 15 min jusqu&#39;à ce que le mélange se transforme en un état de gel et se enroule autour de la surface extérieure de la cuve uniformément. Remplir la chambre d&#39;incubation avec DM. </li><li> Placer l&#39;ensemble dans l&#39;établissement d&#39;un incubateur à CO2 à 5% bioréacteur à 37 ° C. Faire tourner manuellement le greffon décellularisé 90 ° autour de l&#39;axe longitudinal de toutes les demi-heures pendant les 2 premières heures. </li><li> Garder culture statique pendant 12 heures pour permettre l&#39;adhésion cellulaire. </li><li> Délivrer DM à travers la lumière par la pompe péristaltique pour induire la différenciation des cellules des muscles lisses. Lancer débit initial à 5 ​​ml / min et augmentation progressive à 20 ml / min pendant 24 h. </li><li> Gardez le débit moyen de circulation à 20 ml / min pendant 24 heures. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement moyen et déplacer le réglage de l&#39;incubateur bioréacteur. </li><li> Re-graines de la lumière de la greffe avec l&#39;IPFPC. Trypsiniser, compter et centrifuger 1 x 10 6 IPFPC comme dans les étapes 5.5 à 5.6. Remettre en suspension les cellules dans 50 ul de milieu EGM-2 contenant 50 ng / ml de VEGF. Injecter le mélange de cellules dans la lumière du greffon. </li><li> Changer le milieu dans la chambre d&#39;incubation et de la circulation de tout le milieu EGM-2 contenant le VEGF 50 ng / ml pour induire la différenciation endothéliale. </li><li> Déplacez le bioréacteur mise revenir à the incubateur. Faites tourner manuellement la greffe 90 ° toutes les 30 min dans les 2 premières heures, puis maintenir une culture statique pendant 12 heures. </li><li> Lancer flux circulant à partir de 5 ml / min et augmentation progressive à 35 ml / min. Gardez le débit à 35 ml / min pendant cinq jours. Changer de circulation et le milieu de la chambre tous les deux jours. </li><li> Récolter la greffe d&#39;ingénierie pour de plus amples greffage souris. </li></ol> 6. Intensification des Double-tête de série IPFPC Graft à des souris <ol><li> Utilisez NOD.CB17-Prkdc SCID / NcrCrl souris mâles que les greffés du navire. Toujours se assurer que les souris sont âgés d&#39;environ 10 semaines, pèsent environ 25 à 35 g, et sont dans de bonnes conditions de santé. </li><li> Anesthetize souris receveuse par administration d&#39;une combinaison d&#39;Hypnorm (25 mg / kg) et Hypnovel® (25 mg / kg) par voie intraperitoneale. Appliquer la vaseline pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Confirmez anesthésie efficace en se assurant que les souris ont des muscles détendus et respirent régulièrement. <ol><li> Fixer la souris dans une position couchée avec son cou rasé et étendu. Administrer le sulfate d&#39;atropine (1,7 mg / kg) en combinaison avec les anesthésiques pour se assurer que les voies respiratoires de la souris reste claire. </li></ol></li><li> Préparer une incision médiane de la mandibule pour sternum de la souris. Sous un microscope de dissection avec 5 à 10 fois amplification, lever les glandes salivaires droite latéralement et retirer le muscle cleidomastoid droit d&#39;exposer le droit artère carotide commune. </li><li> Retirez délicatement les tissus attachés à mobiliser le droit artère carotide commune de l&#39;extrémité distale vers l&#39;extrémité proximale. Ligaturer la partie centrale de l&#39;artère carotide commune à deux reprises avec une suture de soie 8-0 et disséquer entre les deux traverses. </li><li> Traverser un brassard en nylon tube autoclavable dans chaque extrémité de l&#39;enceinte et fixer chaque extrémité avec des colliers de microhemostat. </li><li> Retirer tie suture à une extrémité et appliquer une goutte de l&#39;héparine (100 U / ml). Immédiatement après, inverser l&#39;extrémité distale du the artère pour couvrir l&#39;ensemble du corps de gaine et fixer le navire inversée avec une suture de soie 8-0 à la manchette. <ol><li> Répéter la même opération à l&#39;autre partie de l&#39;artère. Artère Rincer avec une solution saline pour éliminer les caillots sanguins. </li></ol></li><li> Implanter un greffon de vaisseau décellularisé entre deux extrémités de l&#39;artère carotide par coulissement les extrémités des vaisseaux de la décellularisées sur les poignets de l&#39;artère et le fixant avec des sutures en soie 8-0. Retirer de clamps vasculaires soit se termine avant l&#39;évaluation de la pulsation de la greffe. </li><li> Placez la glande salivaire de retour à sa position initiale. Fermer la peau à l&#39;emplacement chirurgical avec une suture interrompue en utilisant une suture 6-0 de polyglactine. </li><li> Constamment observer les signes vitaux de souris après la procédure est terminée, jusqu&#39;à ce qu&#39;il reprenne conscience. Sacrifiez souris receveuses par dislocation et des vaisseaux de la récolte des greffons col de l&#39;utérus soit 24 h ou trois semaines plus tard pour une analyse ultérieure. </li></ol>

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Les auteurs ne ont aucun intérêts financiers divergents.

Le protocole actuel indique un son, rapide, stratégie simple, efficace et reproductible dans lesquelles les navires de l&#39;ingénierie tissulaire fonctionnels peuvent être générés en utilisant l&#39;IPFPC à partir de fibroblastes humains. Cette technique représente un outil précieux pour la médecine régénérative, l&#39;ingénierie tissulaire et la thérapie cellulaire potentiellement patient spécifique dans le proche avenir. Des mesures essentielles pour assurer l&#39;efficacité du protocole comprennent la préparation de...

La construction de conduits vasculaires est une stratégie fondamentale pour la réparation chirurgicale des vaisseaux endommagés et les blessés résultant de maladies cardiovasculaires. À ce jour, les matériaux utilisés dans la chirurgie de greffe comprennent les polymères synthétiques biocompatible (polytétrafluoroéthylène [Teflon], polytétrafluoroéthylène expansé [ePTFE; Gore-Tex] ou polyéthylène téréphtalate [Dacron]), allogreffes, tissus autologues (péricarde ou la veine saphène) et une xénogreffes. Alors que les greffes artificiels (par exemple, Gore-Tex et Dacron) sont les plus couramment utilisés, ces matériaux est susceptible de causer de nombreuses complications à court et à long terme qui incluent la sténose, le dépôt de calcium, thrombo-embolisation et les infections. Bien que les patients avec des greffes biologiques présents à une diminution des événements thrombo-emboliques, ils rencontrent encore des limitations comme échec de la greffe secondaire et la durabilité raccourcie en raison de la dégradation de la calcification 2. Par conséquent, malgré des améliorations significatives chirurgicale techniques au cours des années, les chercheurs et les cliniciens sont encore accablés par la nécessité d&#39;identifier le conduit idéal pour les maladies vasculaires. Plus récemment, le domaine de l&#39;ingénierie tissulaire vasculaire de recherche a généré un concept dans lequel les cellules sont incorporées dans des échafaudages biodégradables, avec le but de créer un environnement biomimétique qui incarne un navire fonctionnel pour une greffe réussie. Fondamentalement, le succès des constructions vasculaires dépendent de trois composantes essentielles; cellules qui comprennent l&#39;échafaudage, ce est à dire, une couche interne de cellules endothéliales et une couche de cellules de muscle lisse, un échafaudage contenant la matrice extracellulaire approprié pour fournir des propriétés mécaniques comparables au système vasculaire d&#39;origine, et la signalisation moléculaire / cellulaire qui est nécessaire pour initier / régulation réparation. Longue perméabilité du greffon à long terme et le développement durable des néo-tissus sont fortement tributaires de l&#39;ensemencement des cellules efficace des échafaudages, eereby rendu la décision du type d&#39;une importance critique de la cellule. Plusieurs rapports démontrent l&#39;utilisation de endothéliales matures et les cellules musculaires lisses de diverses sources pour développer conduits de petit diamètre 3-6. Bien que prometteuse, le manque de navires autologues suffisantes pour obtenir endothéliales matures et les cellules musculaires lisses restent un fardeau considérable. Plus récemment, les cellules souches provenant de diverses sources ont été exploitées pour des applications de génie tissulaire vasculaires. Cellules mononucléaires effet, les cellules souches pluripotentes une variété de types de cellules souches, y compris les cellules souches embryonnaires 7, induite (iPSCs) 8,9, Institut 10,11, dérivées de moelle osseuse 12, les cellules souches mésenchymateuses 13, les cellules progénitrices endothéliales et les parois des vaisseaux adultes -derived cellules souches antigène-1 (Sca-1) + cellules souches / progénitrices 14,15 ont tous été démontré être capable de différenciation en cellules endothéliales soit fonctionnel ou musculaires lisses en réponse à des milieux définis etconditions de culture. En outre, la capacité d&#39;auto-renouvellement illimité des cellules souches rendre de meilleurs candidats contrairement endothéliales matures et les cellules musculaires lisses qui ne peut diviser un nombre fini de fois avant de subir arrestation et la sénescence croissance. Le choix du matériel d&#39;échafaudage puissent générer des tissus succès navire conçu pour la greffe dépend de plusieurs facteurs tels que la biocompatibilité, propriétés biomécaniques, et le taux de biodégradation. Fondamentalement, les matériaux utilisés pour créer des échafaudages pour les greffes devrait être biodégradable et ne seront pas monter réponses immunitaires bénéficiaires inutile. En outre, elle doit englober une porosité appropriée pour la fixation et de la microstructure et la survie cellulaire ultérieure. À ce jour, les matériaux les plus couramment utilisés pour les échafaudages en ingénierie tissulaire vasculaire comprennent les polymères d&#39;acide glycolique, acide polylactique, et poly ε-caprolactone 16. Plus récemment, des matériaux biologiques ont décellulariséeségalement été appliquée avec un certain succès. Plusieurs laboratoires ont montré que l&#39;ensemencement des navires porcine humaine décellularisée, canin ou avec des cellules autologues fourni une greffe biologique qui a résisté à la coagulation et l&#39;hyperplasie intimale 17-19. Autres stratégies en génie tissulaire vasculaire comprennent extracellulaires greffes vasculaires base-protéines de la matrice par exemple des cellules d&#39;ensemencement en gel de fibrine et 13 feuilles de cellules générant sans le soutien d&#39;échafaudage 20, 21. Le protocole actuel démontre la différenciation de l&#39;Institut humaine dans l&#39;endothélium fonctionnel et les cellules musculaires lisses, la génération d&#39;un bioréacteur constitué d&#39;un échafaudage de vaisseau décellularisé pour héberger des cellules vasculaires Institut dérivés fonctionnels, et le greffage des vaisseaux de l&#39;ingénierie tissulaire en déficit immunitaire combiné sévère (SCID ) souris. IPFPC sont un type de cellule optimale à utiliser pour l&#39;ingénierie tissulaire des greffes de vaisseaux parce que ces cellules ne forment pas de tumeurs chez la souris ou soulèvent éthique etréponses allo-immunes. En outre, nous avons montré que la stratégie pour générer des cellules musculaires pips-cellules endothéliales et les pépins-lisses est efficace et reproductible 10,11. Par la suite, nous avons conçu un vaisseau décellularisé pour l&#39;ensemencement de cellules vasculaires dérivés de l&#39;Institut pour imiter étroitement les protéines de la matrice qui existent au sein d&#39;un vaisseau natif, améliorant ainsi l&#39;efficacité de greffage et de survie. En outre, la décellularisation des vaisseaux avant IPFPC ensemencement empêche l&#39;apparition de réactions inflammatoires montés par des types de cellules immunitaires telles que les macrophages. Plus important encore, ce protocole ne représente pas seulement une méthodologie pour générer promettant conduits vasculaires pour la traduction dans les humains, mais fournit également des moyens précieux d&#39;étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent la régénération des tissus vasculaires grâce à des modèles de souris.

<table><tbody><tr><td>Fibroblastes humains CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Fibroblastes embryonnaires humains prénataux</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Medium (modification de Kaighn du milieu F-12 de Ham)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM medium optimisé pour les cellules souches embryonnaires</td><td>Life technologies (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Technologies de remplacement du sérum knockout</td><td>Life (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human Basic FGF-2&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM medium</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>Humain PDGF</td><td>R& D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Solution de gélatine 2 %</td> <td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide 20866 : pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Enzyme de restriction PvuI</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nucelofection (kit NHDF)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, Éclairage pour microscopie stéréo</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Éclairage à lumière froide pour microscopie stéréo</td></tr><tr><td>Nikon Zoom Stéromicroscope SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Héparine sel de sodium</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10 % SDS Stock Solution Biologie moléculaire</td><td>Réactif Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10mg/ml)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Shaker IKA Vibrax avec plate-forme vibrante VX 7&nbsp ;</td><td>Jepson Bolton’s, Janke& Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Entraînement de pompe numérique</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Tête de pompe à 6 canaux et 6 rouleaux Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Grandes cartouches Masterflex L/S pour tête de pompe</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Tube de pompe en silicone durci au platine Masterflex, L/S 14, 25 ft</td><td>Cole-Parmer&nbsp ;</td><td>WZ-96410-14</td><td>Le tube passe par la pompe péristaltique</td></tr><tr><td>0,5 mm de diamètre intérieur, 0,8 mm de diamètre extérieur Le tube en silicone</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>Les tubes relient la chambre d’incubation, le réservoir de média et la chambre de conformité.</td></tr><tr><td>Raccord Réducteur 0,5 à 1,6, polypropyline naturelle</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adaptateur connecter ci-dessus deux types de tubes</td></tr><tr><td>1/32 » Tube, ID 0,01 » (250&micro ; m) Matériel : PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Tube à travers la paroi de la chambre d’incubation qui relie le greffon avec le tube extérieur</td></tr><tr><td>Raccords monoblocs&nbsp ;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Fixez les tubes ci-dessus à travers la paroi de la chambre d’incubation</td></tr><tr><td>Tubes en nylon (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm)&nbsp ;</td><td>Les tubes Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>s’insèrent dans les deux extrémités du NOD du greffon d’aorte</td></tr><tr><td>. CB17-Prkdcscid/NcrCrl</td> souris <td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutures chirurgicales, 8-0 soie</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgésique pour souris</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Induction de l’anesthésie</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Tube en nylon</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0,65 mm de diamètre et 1 mm de longueur ; pour fabriquer un ballonnet artériel</td></tr><tr><td>Électrocoagulateur</td><td>Martin&nbsp ;</td><td>SN 54.131</td><td>Ligature des branches artérielles sur l’aorte</td></tr><tr><td>Pince bipolaire micro-hémostatique</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Fixation des extrémités des</td></tr><tr><td>vaisseaux Dilatateur de vaisseaux</td><td>S& T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Dilatateur de cuve</td><td>S& T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>Dilatateur de cuve</td><td>S& T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini apploir&nbsp ;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Micro clips d’hémostats</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Sutures chirurgicales, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

génération et greffage des navires par ingénierie tissulaire dans un modèle de souris

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

La construction de conduits vasculaires est une stratégie fondamentale pour la réparation chirurgicale des vaisseaux endommagés et blessés résultant de maladies cardiovasculaires. Le protocole actuel présente une stratégie efficace et reproductible dans laquelle des greffes de vaisseaux fonctionnels issus de l’ingénierie tissulaire peuvent être générées à l’aide de cellules souches pluripotentes partiellement induites (PiPSC) à partir de fibroblastes humains. Nous avons conçu un bioréacteur d’échafaudage de vaisseaux décellularisés, qui imite étroitement la structure des protéines matricielles et le flux sanguin existant dans un vaisseau natif, pour l’ensemencement de cellules endothéliales PiPSC ou de cellules musculaires lisses avant la greffe chez la souris. Cette approche s’est avérée avantageuse car les souris immunodéficientes greffées avec les greffons dérivés de PiPSC présentaient un taux de survie nettement accru 3 semaines après la chirurgie. Ce protocole représente un outil précieux pour la médecine régénérative, l’ingénierie tissulaire et la thérapie cellulaire potentiellement spécifique au patient dans un avenir proche.

La production réussie de l&#39;Institut a été confirmé 4 jours après nucleofecting fibroblastes humains avec un plasmide linéarisé pCAG2LMKOSimO portant quatre facteurs de transcription, Oct4, Sox2 Klf4 et c-Myc (OSKM). IPFPC affiché un phénotype nettement distincte par rapport aux fibroblastes (figure 2A) et a exprimé les facteurs de reprogrammation au 4 ARNm (figure 2B) et de protéines (figure 2C) 10 niveaux. L&#39;efficacité d&#39;une greffe vasculaire bas...

Ici, nous présentons un protocole pour générer de l&#39;ingénierie tissulaire greffes de vaisseaux qui sont fonctionnels pour le greffage dans des souris en double ensemencement partiellement induite sur les cellules souches pluripotentes (IPFPC) - dérivé des cellules musculaires lisses et l&#39;IPFPC - cellules endothéliales dérivées sur une décellularisée navire échafaudage bioréacteur.

Génération et greffage des navires par ingénierie tissulaire dans un modèle de souris

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

L'objectif général de cette procédure est de produire des greffons vasculaires ingénierisés fonctionnels pour la greffe chez la souris. Cette étape est réalisée en reprogrammant d'abord des fibroblastes humains en cellules souches pluripotentes partiellement induites in vitro, capables de se différencier en cellules endothéliales et en cellules musculaires lisses. Une aorte est ensuite prélevée sur une souris sacrifiée et décellularisée à l'aide d'une solution de dodécylsulfate de sodium ou solution SDS afin de préparer les greffons aortiques décellularisés.Ensuite, le circuit d'écoulement du bioréacteur est configuré pour l'ensemencement double de cellules souches pluripotentes partiellement induites. La dernière étape consiste en la greffe du greffon de cellules souches pluripotentes partiellement induites, préalablement ensemencé deux fois, chez des souris. Enfin, l'analyse des taux de mortalité chez les souris trois semaines après la greffe permet de démontrer le fonctionnement des greffons vasculaires conçus par génie tissulaire.Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement des maladies cardiovasculaires, car il a été démontré qu'elle permet de générer efficacement des vaisseaux sanguins fonctionnels à partir de cellules PIPS en un court laps de temps. En général, il est très important de maintenir la greffe vasculaire intacte et stérile tout au long de la procédure, particulièrement pour les personnes novices dans cette méthode. Commencez cette procédure par la reprogrammation de fibroblastes humains en cellules souches pluripotentes partiellement induites, ou cellules PIPS, en transfectant les cellules avec quatre microgrammes de plasmide OSKM linéarisé à l’aide d’un kit de transfection nucléaire pour fibroblastes dermiques humains.Les fibroblastes humains deviennent des cellules PIPS après quatre jours de reprogrammation. Suite à l'euthanasie de la souris par dislocation cervicale. Placer la souris en position dorsale sous un microscope stéréo.Ensuite, sectionner le sternum et contourner la cage thoracique pour ouvrir la cavité thoracique. Retirer le cœur, les poumons et l'œsophage afin d'exposer l'aorte, puis retirer délicatement la graisse péri-aortique à l'aide de pinces. Couper l'aorte à partir de l'extrémité antérieure avec des ciseaux et tenir doucement l'extrémité avec des pinces contondantes.Ensuite, détacher l'aorte de la colonne vertébrale en arrière par dissection émoussée. Fermer soigneusement toutes les artères collatérales provenant de l'aorte par ligature à l'aide d'un électrocoagulateur bipolaire, puis sectionner au-delà du point de ligature avec des ciseaux. Utiliser une seringue de cinq millilitres pour rincer la lumière de l'aorte avec trois millilitres de solution saline contenant 100 unités d'héparine.Pour éviter la formation de caillots sanguins, sectionner l'extrémité postérieure de l'aorte avant qu'elle ne se divise en artères rénales. Préserver l'intégrité de l'aorte est très important tout au long de la procédure. Ensuite, rincer la lumière de l'aorte avec cinq millilitres de 0,075.Solution de dodécylsulfate de sodium ou SDS diluée dans du tampon phosphate salin ou PBS imbibant l'aorte rascis dans une solution de SDS à 0,075 % dans une boîte de Pétri de 10 centimètres placée sur un agitateur orbital pendant deux heures à 150 tr/min à température ambiante. Ensuite, rincer la lumière de l'aorte avec cinq millilitres de PBS. Puis, imbibez l'aorte dans du PBS dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et placez la boîte de Pétri sur l'agitateur orbital à 150 tr/min pendant deux heures à température ambiante.Renouveler le PBS toutes les 20 minutes après deux heures. Rincer la lumière de l'aorte avec cinq millilitres de PBS. Pour commencer, monter le circuit d'écoulement du bioréacteur comme décrit dans le protocole écrit.Ensuite, reconditionnez le vaisseau décellularisé avec du milieu de culture en faisant tremper l'aorte dans un milieu de différenciation dans une boîte de Pétri de 10 centimètres placée sur un agitateur orbital pendant une heure à 50 tr/min à température ambiante. Insérez des tubes en nylon d'un centimètre de longueur aux deux extrémités du vaisseau décellularisé sous microscope. Puis fixez le vaisseau et les tubes à l'aide de fils de soie de calibre zéro huit.Assembler le greffon d'aorte décellularisée dans la chambre d'incubation en reliant les tubes en nylon aux orifices d'entrée et de sortie situés sur la paroi de la chambre. Maintenir la chambre d'incubation avec cinq millilitres de milieu à chaque fois. Ensuite, la trypsine examine les cellules PIPS en ajoutant du trips préchauffé dans.Couvrir la boîte de culture et agiter doucement la boîte 10 fois. Éliminer les rinçages et laisser la boîte dans l’incubateur pendant deux à trois minutes. Ensuite, ajouter le milieu de culture préchauffé dans la boîte et mélanger le milieu avec les cellules.Ensuite, comptez le nombre de cellules à l’aide d’un centrifugeuse cytométrique sanguine. Deux aliquots de suspensions cellulaires contenant chacune un demi-million de cellules sont centrifugées pendant cinq minutes à 300 ×g. Après la centrifugation, resuspendez complètement un des pellets de cellules PIPS. Dans 50 microlitres de dm, injectez la suspension cellulaire dans la lumière du vaisseau décellularisé.Ensuite, resuspendre l'autre culot de cellules PIPS dans 100 microlitres de matrigel. Prélever soigneusement le mélange au pipetteur et l'appliquer sur la greffe d'aorte décellularisée. Attendre de 10 à 15 minutes jusqu'à ce que le mélange prenne un état similaire à un gel et recouvre uniformément la surface externe du vaisseau.À ce stade, montez la chambre d'incubation avec dm. Placez l'ensemble du système de bioréacteur dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Ensuite, placez le tube reliant le réservoir de milieu et la chambre de compliance sur la pompe péristaltique.Dans l'incubateur. Tournez manuellement le greffon décellularisé de 90 degrés autour de l'axe longitudinal toutes les demi-heures pendant les deux premières heures, après avoir maintenu la culture en statique pendant 12 heures, afin de permettre la livraison du DM par le lumen à l'aide d'une pompe péristaltique pour induire la différenciation des cellules musculaires lisses. Commencez avec un débit initial de cinq millilitres par minute.Ensuite, appliquez une augmentation progressive de 20 millilitres par minute sur une période de 24 heures après avoir maintenu le débit du milieu circulant à 20 millilitres par minute pendant 24 heures, arrêtez l'écoulement du milieu et retirez le bioreacteur de l'incubateur. Ensuite, réensemencez la lumière du greffon avec des cellules PIPS par comptage à la trypsine et centrifugation en utilisant 1 million de cellules PIPS. Comme précédemment, resuspendez les cellules dans 50 microlitres de milieu de croissance endothélial.Deux contenant 50 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance endothélial vasculaire. Ensuite, injecter le mélange cellulaire dans la lumière du greffon. Changer le milieu dans la chambre d'incubation et dans toute la circulation en milieu GM deux contenant du VEGF pour induire la différenciation endothéliale.Après avoir replacé le bioreacteur dans l’incubateur, faire tourner manuellement la greffe de 90 degrés toutes les demi-heures pendant les deux premières heures, puis maintenir une culture statique pendant 12 heures. Après 12 heures, commencer un écoulement circulant à raison de cinq millilitres par minute, en augmentant progressivement jusqu’à 35 millilitres par minute, puis maintenir le débit à 35 millilitres par minute pendant cinq jours. Ensuite, récupérer évidemment la greffe ingénierie en coupant les extrémités des tubes en nylon.Placer le greffon dans une boîte de Petri contenant du milieu e GM deux frais en prévision de la greffe chez la souris, après anesthésie du receveur. Fixer la souris en position supine, le cou rasé et étendu. Practiquer une incision médiane allant de la mandibule au sternum de la souris au microscope stéréo avec un grossissement de cinq à dix fois.Soulevez latéralement les glandes salivaires droites et retirez le muscle stylo-mastoïdien droit. Pour exposer l'artère carotide commune droite, retirez délicatement les tissus adjacents afin de mobiliser l'artère carotide commune droite depuis son extrémité distale vers son extrémité proximale. Ligez deux fois la portion médiane de l'artère carotide commune avec un fil de soie de calibre 8-0 et sectionnez entre les deux ligatures. Faites passer un manchon en tube de nylon stérilisable dans chaque vaisseau.Terminez et fixez chaque extrémité avec des pinces hémostatiques microchirurgicales. Retirez ensuite les ligatures de suture à une extrémité et appliquez immédiatement une goutte d'héparine. Retournez l'extrémité distale de l'artère afin de recouvrir entièrement le corps du manchon, puis fixez le vaisseau retourné au manchon à l'aide d'une suture en soie zéro huit.Après avoir répété la même procédure sur l'autre extrémité de l'artère, rincez l'artère avec une solution saline pour éliminer les caillots sanguins. Ensuite, implantez une greffe vasculaire décellularisée entre les deux extrémités de l'artère carotide en glissant les extrémités du vaisseau décellularisé sur les manchons artériels et en les fixant à l'aide de huit points de suture en soie 0000. Retirez les pinces vasculaires des deux extrémités avant d'évaluer la pulsation de la greffe, puis replacez la glande sous-maxillaire droite dans sa position d'origine.Fermer la peau au niveau du site chirurgical par des points séparés à l’aide d’un fil de prolactine six zéro. Poursuivre avec les soins postopératoires décrits dans le protocole représentatif du texte. La morphologie des fibroblastes humains après quatre jours de reprogrammation en cellules PIPS est présentée ici.Les cellules PIPS présentaient un phénotype nettement différent par rapport aux fibroblastes. Comme prévu, la décéléllularisation complète de l'aorte a été obtenue par un traitement au SDS pendant deux heures. En conséquence, l'aorte décellularisée apparaissait comme une matrice acellulaire translucide comparée à une aorte fraîchement prélevée.Après la double implantation de cellules PIPS dans une aorte décellularisée, les greffons vasculaires ingénierisés présentent des propriétés de cellules endothéliales et de cellules musculaires lisses, contrairement aux greffons vasculaires décellularisés. Ceci est visualisé ici par la coloration verte des cellules endothéliales et la coloration rouge des cellules musculaires lisses. Les souris greffées avec des greffons vasculaires composés de cellules PIPS ont présenté un taux de survie de 60 % trois semaines après la transplantation, comme attendu.Les souris greffées avec des vaisseaux décellularisés ont présenté des taux de mortalité nettement plus élevés dès le premier jour suivant leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la cardiologie pour explorer l'utilisation des cellules PIPS et des greffons vasculaires décellularisés dans la génération de conduits vasculaires fonctionnels obtenus par ingénierie tissulaire. Après avoir visionné cette vidéo, j'espère que vous aurez bien compris comment préparer le greffon vasculaire décellularisé, comment assembler le bioréacteur, et comment réimplanter le greffon régénéré dans des souris.

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Bioengineering

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