Or nanotige assistée stimulation optique des cellules neuronales

Ce protocole décrit comment utiliser le chauffage transitoire associé à l’absorption optique de nanotiges d’or pour stimuler la différenciation et l’activité intracellulaire du calcium dans les cellules neuronales. Ces résultats ouvrent potentiellement de nouvelles applications dans les prothèses neurales et les études fondamentales en neurosciences.

L’objectif global de cette procédure est de stimuler des cellules neuronales cultivées avec des nano-tiges d’or à l’aide d’une diode laser proche infrarouge. Pour ce faire, il faut d’abord préparer les nanoparticules d’or à la bonne densité optique. La deuxième étape consiste à cultiver les cellules neuronales et à y ajouter les nanoparticules.

L’étape suivante est l’irradiation laser. La dernière étape consiste à vérifier la différenciation cellulaire par l’expression de la bêta-trois à la tubuline. En fin de compte, la microscopie confocale est utilisée pour montrer la transience calcique intracellulaire.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous cherchions un moyen de stimuler le potentiel d’action dans des neurones uniques au sein d’une population cellulaire. Jamie May et des étudiants de premier cycle de notre laboratoire feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, placez un vétérinaire de solution de nanotige d’or dans le spectrophotomètre visible UV.

Mesurez la densité optique initiale en enregistrant les valeurs d’absorption de 300 nanomètres à 1000 nanomètres avec une résolution comprise entre 0,5 et deux nanomètres. Préparez une solution mère d’un millilitre en diluant l’échantillon initial d’anoro d’or à une densité optique d’une centrifugeuse. Un millilitre de solution de nanotige d’or deux fois pour éliminer tout excès de produits chimiques.

Retirez ensuite les surnageants et remettez en suspension les nano-tiges d’or dans de l’eau désionisée. Pour vous préparer à l’utilisation en culture cellulaire, sonicez la solution d’or Anoro pendant cinq minutes, puis stérilisez-la à la lumière UV pendant 30 minutes. Dans cette procédure, préparez 500 millilitres de dmem stérile pour le milieu de culture cellulaire.

Ensuite, cultivez les cellules neuronales NG 1 0 8 15 dans 10 millilitres de milieu de culture cellulaire dans une fiole T 75, puis incubée à 37 degrés Celsius et sous atmosphère humidifiée. Lorsque les cellules sont confluentes à 70 à 80 %, remplacez le milieu par un milieu frais et chaud. Après cela, détachez mécaniquement les cellules en frappant doucement le fond de la fiole confluente.

Centrifuger une suspension cellulaire pendant cinq minutes à 600 G et remettre la palette cellulaire en suspension dans deux millilitres de milieu de différenciation cellulaire chaud. Voyez ensuite les cellules dans une plaque de 96 puits avec 200 microlitres de milieu de différenciation cellulaire. Incuber l’échantillon pendant une journée à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, ajoutez la solution de nanotige d’or et incubez-la pendant 24 heures supplémentaires. Dans cette procédure, couplez le laser avec une fibre optique monomode et terminez-le avec un connecteur FC. Mesurez la puissance de sortie du laser à l’aide d’un wattmètre standard le troisième jour de l’incubation des nanotiges.

Fixez le connecteur FC au puits, irradiez l’échantillon et le contrôle à température ambiante pendant une minute en onde continue à différentes puissances laser le cinquième jour, retirez le milieu de différenciation cellulaire de l’échantillon et fixez-le avec 3,7 % de volume par volume de solution de formaldéhyde pendant 10 minutes. Ensuite, perméable les cellules avec 0,1 % de volume par volume Triton X 100 pendant 20 minutes. Ensuite, ajoutez 3 % de poids par volume de BSA à l’échantillon pendant 60 minutes.

Pour bloquer les sites de liaison aux protéines non réactives, étiquetez l’échantillon avec de la tubuline anti-bêta trois pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, incubez les cellules pendant 90 minutes dans l’obscurité avec un anticorps secondaire approprié. Marquez ensuite les noyaux cellulaires avec du DAP E pendant 10 minutes.

Ensuite, imagez l’échantillon avec une épifluorescence ou une microscopie confocale à l’aide d’un objectif d’au moins 20 x. Choisissez les filtres du microscope en fonction de l’anticorps secondaire et sélectionnez un filtre DAPI pour visualiser les noyaux d’une cellule. Dans cette étape, préparez une solution mère de 20 % en poids par volume d’onique F1 27 en dissolvant deux grammes de soluté dans 10 millilitres de DMSO.

Chauffez la solution d’onic F1 27 à 40 degrés Celsius pendant 20 minutes pour augmenter la solubilité. Le troisième jour de l’incubation de l’anaro, préparez une solution saline équilibrée. Ensuite, retirez le milieu de différenciation cellulaire et remplacez-le par la solution BSS.

Complété par cinq micromolaires de la grippe, 4h00 du matin dans du DMSO et 0,1 % en poids par volume de solution mère onicique F1 27. Ensuite, couplez le laser avec une fibre optique monomode et fendez la pointe. Utilisation de la technique standard.

Observez la pointe résultante sous un microscope optique pour vous assurer que la pointe est plate et perpendiculaire à l’axe de la fibre. Mesurez ensuite la puissance laser de sortie avec le wattmètre standard. Ensuite, insérez la fibre de diffusion de la lumière dans un support de fibre optique et fixez-la au micro-positionneur.

Après cela, connectez un oscilloscope au générateur de signaux. Pour surveiller la modulation optique. Utilisez un signal binaire avec des fréquences et des longueurs d’impulsion variables.

Connectez ensuite le laser et utilisez le signal de modulation comme entrée TTL pour le microscope. Utilisez un laser ionique argon pour exciter le colorant intériorisé de la grippe oh 4:00 AM et le laser synchronisé dde. Pour l’excitation des nano-bâtonnets d’endocytose, placez les cellules sous un microscope confocal inversé et positionnez la fibre de diffusion de lumière à l’écart de la cellule cible en mode d’éclairage de transmission.

Calculez ensuite le rayon du faisceau sur la cible. Effectuez l’imagerie de l’échantillon et contrôlez-le à température ambiante à l’aide d’un objectif 40x et collectez les balayages de séries chronologiques à une résolution de 256 par 256 pixels par image en mode aller-retour. Ensuite, effectuez un enregistrement sans aucune excitation DIO laser afin d’identifier toute interférence laser argon ion de base, illustrée ici est une image épi fluorescence des cellules NG 1, 0, 8, 15 roal différenciées, cultivées seules et irradiées avec la puissance laser de 7,5 watts centimètre carré.

Et voici une image des cellules cultivées avec des nano-tiges d’or irradiées avec la puissance laser de 1,25 watt centimètres carrés. Voici un exemple de cellules neuronales différenciées NG 1 0 8 15 chargées avec l’indicateur calcique de la grippe oh 4:00 AM. L’image a été prise à l’aide d’un microscope confocal inversé avec un objectif d’immersion dans l’huile 40x.

Cette figure montre les échantillons représentatifs des variations calciques induites par le laser en fonction du temps. Dans NG 1 0 8 15, des cellules neuronales cultivées dans des conditions sériques libres pendant trois jours avec des nano-tiges de polystyrène sulfonate d’or, des nano-tiges d’or et sans nano-tigrées. F max sur F zéro indique l’augmentation de la fluorescence maximale détectée dans les cellules neuronales NG 1, 0, 8, 15 après son développement.

Cette technique a ouvert la voie à de futures applications dans la simulation optique des cellules neuronales.