Name: Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez un criblage haut-débit de modulateurs chimiques agissant sur la régulation post-transcriptionnelle via la région 3' UTR. Cette méthode utilise des cellules rapportrices luciférase pour identifier des composés modulant l'expression génique.

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Nous remercions la Fondation Italienne pour le Neuroblastome pour le soutien financier total à ce projet.

NOTE: Le débit de ces systèmes de dosage dépend de l&#39;équipement de laboratoire HTS disponibles. Ce protocole est facilitée par une EVO 200 robots Tecan Freedom, qui effectue la manipulation de liquides en format 96 puits. Miniaturisation au format 384 puits est également possible. Le système de manipulation de liquide robotisé est positionné sous une hotte à flux laminaire afin de maintenir des conditions aseptiques au cours de toutes les mesures expérimentales. Si aucune automatisation de liquide de traitement est disponible, le protocole peut être facilement adapté au format à faible débit. Dépistage primaire 1. Jour 1: Préparer et cellules de semences REMARQUE: Les cellules de semences à un rendement de 80% de confluence au moment de dosage de l&#39;activité de la luciférase, ce est à dire, 48 h après l&#39;ensemencement. <ol><li> Remettre en suspension les cellules de neuroblastome trypsinisées CHP134-mycn3UTR à une concentration de 2 x 10 5 cellules / ml dans du milieu RPMI contenant 10% de FBS et 1% de L-glutamine. Pour 27 plaques préparer au moins 250 ml de<html> suspension cellulaire en tenant manipulation de liquides de compte, rigoles volumes morts et les étapes de pipetage répétées. Verser la suspension cellulaire dans le réservoir stérile et placez-le sur le bureau de robot. </li><li> Placez 9 à code-barres blanches plaques à 96 puits à fond plat et une boîte de 200 pi embouts de pipette stériles sur le bureau de robot. Mélanger la suspension de cellules par pipetage avant chaque étape de distribution pour éviter des cellules de décantation par gravité. Distribuer 75 pi de cellules dans chaque puits de plaques 9 pour obtenir une densité finale de 1,5 x 10 4 cellules par puits. </li><li> Couvrir les plaques avec les couvercles et les laisser à l&#39;extérieur de l&#39;incubateur pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de sédimenter au fond du puits. Ceci permet de minimiser les effets de bord. </li><li> Répétez les étapes 1.2 et 1.3 à deux reprises afin de préparer un nombre total de 27 plaques. </li><li> Placer les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2 et incuber pendant 24 heures. </li></ol> 2. Jour 2: traiter les cellules avec des composés Bibliothèque MÉNAGEMENT &quot;&gt; Remarque: La petite bibliothèque de molécules de spectre Collection consiste en 2000 composés disposées en 8 rangées et 10 colonnes de 25 plaques à 96 puits à la concentration de 10 mM dans le DMSO Les puits sur les première et dernière colonnes sont laissés vides pour les contrôles. . essais de criblage de composés sont généralement effectuées à 1-10 uM concentration du composé 8. Le protocole de dépistage décrit ici fixe 2 uM que la concentration de travail et 24 heures que le point de fin de dosage. <ol><li> Décongeler neuf plaques de bibliothèque composé à la température ambiante. </li><li> Préparer deux creux avec du PBS stérile et% des solutions de DMSO-0,5 PBS et placez-les sur le bureau de robot. Pour chaque plaque bibliothèque, préparer et marquer en conséquence une plaque de dilution - d&#39;un polypropylène de plaque à 96 puits à fond en U avec un volume de travail d&#39;au moins 400 ul. Remplir chaque puits de colonnes 2-11 de plaques de dilution avec 398 pi de PBS stérile en utilisant les conseils fixes du gestionnaire liquide. Remplir les colonnes 1 et 12 avec 50 pi de PBS stérileavec 0,5% de DMSO de façon à reproduire la concentration en véhicule dans les puits témoins (0,02%). </li><li> Placez deux plaques bibliothèque, les plaques de dilution étiquetés en conséquence, deux boîtes de 50 ul embouts de pipette stérile et six cellules plaques sur le bureau de robot. Découvrez cellules plaques. </li><li> Pipet 2 ul de la solution mère 10 mM de l&#39;une des deux plaques de la bibliothèque dans la plaque de dilution correspondant et bien mélanger. Cela se traduira par une concentration des composés intermédiaires de 50 uM. En utilisant la même série de conseils, passer 3 pi de la dilution de 50 uM dans 3 plaques à 96 puits avec des cellules blanches à code-barres. Cette dilution des résultats du régime en deux uM concentration de chaque composé testé de travail. REMARQUE: Pour éviter les manipulations inutiles avec les conseils, utilisez un ensemble complet de 96 conseils dès le début, même si les plaques de la bibliothèque ne contiennent que 80 composés. Ceci est possible car la première et la dernière colonne des plaques de bibliothèques sont vides. </li><li> Remplacez les embouts de pipette et répéter Step 2,4 pour la deuxième plaque de bibliothèque. </li><li> Couvrir les plaques de cellules et de les retourner à l&#39;incubateur pendant 24 heures. </li><li> Répéter les étapes 2.3 à 2.6 plus deux fois pour les plaques de bibliothèque restantes. </li></ol> 3. Jour 3: Effectuez Luciferase Assay REMARQUE: Avant d&#39;effectuer le dosage de la luciférase, il est possible de multiplexer avec un dosage de viabilité cellulaire basé sur la réduction de la résazurine pour obtenir un indice de la viabilité des cellules de chaque puits 9. Multiplexage luciférase et test de viabilité résultats d&#39;analyses dans une réduction de signal de la luciférase qui, cependant, peut être ignoré si les cellules fournissent de haut niveau de l&#39;activité luciférase assez. L&#39;activité luciférase peut être détectée par une variété de réactifs de dosage de luciférase 10,11 commerciales et artisanales avec signal luminescent stable. <ol><li> Équilibrer le réactif de luciférase de choix reconstitué à température ambiante. Assurez-vous que le volume est suffisant pour toutes les plaques dosées. Pour 27 plaques 170 ml de réactif de luciférase devront tenant manipulation de liquide de compte, auges volume mort et des étapes répétées de pipetage. Verser le réactif de luciférase dans un réservoir et placez-le sur le bureau de robot. </li><li> Retirer neuf plaques avec des cellules de l&#39;incubateur, placez-les sur le bureau de robot, découvrir et attendre équilibrée à la température ambiante. Ajouter 50 ul du réactif de luciférase par plaque et par la plaque. Entre les plaques, introduire un retard égal au temps de lecture de la luminescence une plaque. Ceci garantit que toutes les plaques sont mesurées à l&#39;intérieur de l&#39;intervalle de temps égal à partir de l&#39;addition des réactifs. </li><li> Après une incubation de 30 min, placer la première plaque dans le luminomètre et mesurer la luminescence après une brève étape secouant. Répétez l&#39;opération pour toutes les plaques. Enregistrer le code-barres de chaque plaque et l&#39;associer au fichier de données correspondant pour éviter les erreurs résultant d&#39;un grand nombre de plaques traitées. </li><li> Répétez les étapes 3.2 à 3.3 deux fois pour les 18 autres plaques avec des cellules. </li&gt; <li> Recueillir le réactif de luciférase restant et le stocker à -20 ° C. </li></ol> 4. Jour 4: Analyse des données <ol><li> Processus données expérimentales en utilisant la normalisation de tous les échantillons à la moyenne des contrôles sur plaque traités avec le véhicule. Pour chaque composé bibliothèque, calculer la valeur moyenne de x et SD sur triple. </li><li> Sélectionnez jusqu&#39;à-régulation et la régulation négative de résultats en fixant un seuil de X ± k × SD, où le X de valeur moyenne et SD sont calculés sur toutes les valeurs d&#39;essai transformé, et k est une constante définie. </li><li> Sélectionnez un seuil arbitraire de coupure &lt;20% des témoins traités avec le véhicule quand une réduction de signal de la luciférase est probablement associée à la toxicité de composé. Jeter les résultats ci-dessous de ce seuil permettra de réduire considérablement un certain nombre de hits faux-positifs dans le contre-dépistage. REMARQUE: Au lieu de normalisation axée sur le contrôle, les données expérimentales peuvent être traitées application score Z ou son analogue robuste B snoyau 12. En outre, les approches statistiques alternatives pour la sélection de succès sont disponibles 12. </li></ol> 5. Contre-dépistage NOTE: Les composés identifiés dans l&#39;écran primaire (étiquetés «hits») sont confirmées et évalués pour la spécificité par une contre-dépistage. <ol><li> Cerise choisir les résultats sélectionnés des aliquotes stockées dans des tubes à code-barres 2D simples et créer de nouveaux &quot;a frappé plaques&quot;, sauvant la mise en page correspondante. Ne oubliez pas de laisser positions libres pour les contrôles. NOTE: En l&#39;absence d&#39;un système picorage efficace, on pourrait tester à la fois le contrôle et la 3 &#39;UTR cellules porteuses en parallèle dans le dépistage primaire. Dans ce cas, la sélection spécifique de composés ayant des effets sur la charge seulement introduit 3 &#39;UTR sera possible après la projection primaire qui élimine la nécessité de contre-dépistage. Cependant, la projection parallèle dans deux lignées cellulaires doublera le dosagecoûts. </li><li> En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section &quot;Jour 1: Préparer et cellules de semences»), pour chaque «plaque hit&quot; préparer trois plaques à 96 puits de chaque cellules stables CHP134-mycn3UTR et CHP134-CTRL. </li><li> En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section «Jour 2: traiter les cellules avec Bibliothèque composés&quot;), utiliser chaque plaque de succès pour traiter trois CHP134-mycn3UTR et trois plaques CHP134-CTRL à 2 uM concentration de travail. NOTA: L&#39;écran du compteur décrit ici est réalisée en triple à la dose unique de 2 uM, il pourrait être avantageux de remplacer les répétitions standard et tester les résultats dans trois concentrations aussi des dilutions de 10 fois allant de 2 pM à 20 nM. L&#39;application de cette approche permettrait non seulement de confirmer les données de l&#39;écran primaire, mais aussi d&#39;obtenir des données préliminaires dose-réponse sur les résultats primaires, en minimisant les taux de faux-positifs. Dans ce cas, un pipeline d&#39;analyse différente doit être applied pour traiter les données expérimentales et confirmer les résultats. </li><li> En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section «Jour 3: Effectuez Luciferase Assay&quot;), mesurer l&#39;activité de la luciférase dans toutes les plaques CHP134-mycn3UTR et CHP134-CTRL. </li><li> En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section «Jour 4: Analyse des données&quot;), normaliser les données expérimentales de puits traités à la moyenne des sur-plaque contrôles traités avec le véhicule et calculer la moyenne et l&#39;écart par rapport aux répétitions. Pour chaque composé testé, calculer le facteur de variation de l&#39;activité luciférase dans CHP134-mycn3UTR vs cellules CHP134-CTRL. Sélectionnez arbitraire changement fois les seuils de&gt; 1,5 et la signification des valeurs p de &lt;0,01. NOTE: Dans les paramètres de dosage décrites le paramètre déterminant pour la spécificité de succès est un facteur de variation significative de l&#39;activité luciférase dans CHP134-mycn3UTR vs cellules CHP134-CTRL. Si nécessaire, on peut également évaluer la toxicité composé en effectuant en même temps un test de viabilité cellulaire sur la SEcomposés tionné. Cela pourrait être particulièrement bénéfique si les résultats primaires sont contre-examinés dans une analyse dose-réponse. Pour une dose unique, notre expérience indique une forte corrélation de l&#39;activité luciférase réduite à une diminution de la viabilité des cellules 6. Par conséquent, une diminution de l&#39;activité luciférase dans les cellules cibles ainsi que des cellules de commande peut être considérée comme un indicateur de la toxicité du composé à la concentration testée. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole décrit un test de gène rapporteur basé sur des cellules visant à identifier des modulateurs qui ciblent les processus post-transcriptionnels dépendants de 3' UTR. Il englobe le criblage primaire et le contre-criblage et, si nécessaire, peut être accompagné d’un test de cytotoxicité. Le résultat du criblage primaire est un certain nombre de composés candidats précieux, dont la reproductibilité et la spécificité sont encore validées dans le contre-criblage.
L’identification des résu...

Pendant une longue période régulation transcriptionnelle de l&#39;expression génique a été pensé pour jouer un rôle majeur si ce ne est le rôle exclusif dans le contrôle de la production de protéines. L&#39;accumulation de preuves, cependant, indique que régulation post-transcriptionnelle contribue autant, sinon plus, que, la régulation transcriptionnelle de déterminer protéine cellulaire abondance 1,2. Contrôle post-transcriptionnelle de l&#39;expression génique est beaucoup plus complexe et élaborée que fut d&#39;abord pensée. En fait, toutes les différentes étapes de contrôle post-transcriptionnel ont émergé pour être réglementés, y compris le traitement de l&#39;ARNm, la localisation, le chiffre d&#39;affaires, la traduction 3 ainsi que l&#39;ARN réversible méthylation 4 nouvellement décrit. De nombreux processus de régulation post-transcriptionnels potentiellement affectés, le dosage décrit ci-dessous se concentre sur celles impliquant &#39;non traduite (3&#39; UTR de l&#39;ARNm 3). 3 &#39;UTR affecte globalement ARNm sort principalement par interaction spécifique de pr liaison à l&#39;ARNoteins et ARN non-codants à ses séquences régulatrices et / ou structures secondaires 5. Par conséquent, de petites molécules qui modifient ces interactions ou interfèrent avec en amont des voies de transduction du signal se déplacera l&#39;équilibre qui régit abondance des protéines. Cette approche thérapeutique est d&#39;une importance particulière pour les pathologies humaines pour lesquelles la preuve existe montrant que des gènes de maladies pertinents sont soumis à régulation post-transcriptionnelle, qui représente ainsi une cible potentielle pour une intervention pharmacologique. Par conséquent, les systèmes permettant le dépistage des modulateurs de niveaux d&#39;ARNm par interférence avec les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel dans un format à haut débit peuvent devenir des outils précieux dans l&#39;identification de nouveaux traitements potentiels. Le dosage de gène rapporteur à base de cellules décrit permet l&#39;identification de composés capables de moduler l&#39;ARNm sort par des mécanismes dépendant de son extrémité 3 &#39;UTR. Il se compose de plusieurs c principaleomposantes (Figure 1) et nécessite quelques étapes préliminaires pour valider la faisabilité de l&#39;essai. Tout d&#39;abord, la construction de rapporteur est conçu pour inclure l&#39;UTR en 3 &#39;d&#39;un gène d&#39;intérêt. La 3 &#39;UTR est fusionnée à l&#39;extrémité d&#39;un gène rapporteur tel que la luciférase de luciole (figure 1). Tout changement dans les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercées par la inséré 3 &#39;UTR vont modifier la stabilité et / ou l&#39;efficacité de traduction de ce transcrit chimérique, résultant en des niveaux de luciférase variés. Par conséquent, des changements dans l&#39;activité de luciférase servent comme mesure indirecte de la régulation post-transcriptionnelle affectée du gène d&#39;intérêt. Le deuxième composant du système est une construction rapporteur témoin, un plasmide d&#39;expression qui exprime identique le même gène rapporteur, mais ne contient pas de 3 &#39;UTR. Les deux plasmides rapporteurs peuvent être conçus dans le laboratoire en utilisant les protocoles classiques de biologie moléculaire ou achetés auprès de sources commerciales. La sélection d&#39;une lignée cellulaire appropriée est essentielle pour la construction de dosage. Quelle ligne de cellule est le modèle optimal dépend de nombreux facteurs, allant des exigences cliniques comme ressemblance maximale à la pathologie à des questions pratiques comme juste caractéristiques disponibilité, transfectabilité, et de croissance. Il est important, avant de procéder il faut se assurer que la fusion des 3 &#39;UTR du gène rapporteur a un effet attendu sur le niveau de la transcription chimérique. L&#39;absence de différence significative dans le signal de la luciférase à partir de la 3 &#39;UTR-palier et le contrôle constructions rapporteurs transfecté de manière transitoire dans les cellules sélectionnées indiquerait que la 3&#39; UTR ne est pas fonctionnelle dans ce modèle cellulaire, ce qui incite à rechercher d&#39;autres possibles. Pour le format à haut débit, les 3 &#39;UTR-porteurs et de contrôle luciférase constructions rapporteurs devraient être intégrés de manière stable dans la lignée cellulaire choisie. Utilisation d&#39;un intégré de manière stable sur transitoirement transfectéeslignée cellulaire est préférable pour plusieurs raisons. Cela élargira le choix d&#39;un modèle cellulaire incluant des lignées cellulaires difficiles à transfecter, diminuer la variabilité dans les données découlant des fluctuations de l&#39;efficacité de transfection, calmer les coûts. En outre, sur les cellules de transfection transitoire sont très souvent surchargé avec un plasmide d&#39;ADN qui conduit à la saturation du système. Dans ces paramètres une nouvelle augmentation de l&#39;expression de journaliste peut être difficile, entraînant une diminution de sensibilité à l&#39;égard des composés de régulation positive potentiels. Enfin, lorsque tous les composants d&#39;analyse sont mis en place, il est essentiel avant de passer au format à haut débit afin de déterminer la faisabilité de l&#39;essai, ce est à dire, si l&#39;activité luciférase peut être fait en amont et en réglementation spécifique via le inséré 3 &#39; UTR. Les meilleurs contrôles seraient rapportés de petites molécules pour moduler la stabilité de l&#39;ARNm ou traduisibilité par UTR en 3 &#39;d&#39;intérêt. Si ceux-ci est ayantpas possible, les contrôles de substitution imitant l&#39;effet désiré sont acceptées. Il peut se agir miARN ou des protéines liant l&#39;ARN connus pour exercer leurs effets en se liant à la 3 &#39;UTR de l&#39;intérêt. L&#39;évaluation de ces contrôles avant la projection primaire indique non seulement la fonctionnalité de l&#39;essai développé, mais permet également à l&#39;estimation de sa gamme dynamique, la sensibilité et la performance dans le format à haut débit. En utilisant le protocole décrit nous avons criblé une bibliothèque composé 6-2000. Neuroblastome, la tumeur solide extra plus courante de l&#39;enfance, a été utilisé comme un modèle biologique et 3 &#39;UTR de l&#39;oncogène MYCN, dont l&#39;amplification prédit fortement issue défavorable du neuroblastome, comme un gène cible 7. La figure 2 présente les dispositif expérimental. La projection a été divisée en trois courses avec la taille du lot de 27 plaques projetés en une seule fois. Le lot de 27 plaques inclus bibliothèque Spectrum Collectionplaques n.1-n.8 + n.25 (première manche), n.9-n.16 + n.25 (deuxième manche) et n.16-n.24 + n.25 (troisième terme), chaque plaque projeté en trois exemplaires. Ainsi, une plaque de la bibliothèque (n.25) a été dosé dans les trois courses rendant possible la comparaison inter-terme. Le protocole ci-dessous décrit une seule série de neuf plaques de bibliothèque testés en triple exemplaire.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture 96 puits</td><td>Blanc PerkinElmer</td><td>6005688</td><td></td></tr><tr><td>StorPlate 96 puits Fond en U (plaque de dilution)</td><td>PerkinElmer</td><td>6008190</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Auge jetable pour réactifs</td><td>Tecan</td><td>10 613 048</td><td></td></tr><tr><td>300 ml Réservoir robotisé jetable</td><td>VWR</td><td>PB12001301</td><td></td></tr><tr><td>Robot tips DITI 50&nbsp ; &mu ; l Stérile</td><td>Tecan</td><td>30038607</td><td></td></tr><tr><td>Robot tips DITI 200&nbsp ; &mu ; l Stérile</td><td>Tecan</td><td>30038617</td><td></td></tr><tr><td>Matrix 1,4 ml 2D code-barres w, Tubes à fond plat</td><td>Thermo Scientific</td><td>3711</td><td></td></tr><tr><td>ONE-Glo Luciferase Assay System&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>E6120</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-918F</td><td></td></tr><tr><td>PBS-1x, sans Ca2+, Mg2+</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200&nbsp ; mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>La collection Spectrum (bibliothèque de composés)</td><td>MicroSource Discovery Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO200 robot&nbsp ;</td><td>Lecteur</td> multiplaques Tecan <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan F200</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Les deux régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle ont un impact profond sur l&#39;expression des gènes. Cependant, des essais de criblage à base de cellules couramment adoptées se concentrent sur la régulation transcriptionnelle, étant essentiellement destinées à l&#39;identification de molécules de promoteur-ciblage. En conséquence, des mécanismes post-transcriptionnels sont en grande partie non couvert par l&#39;expression du gène cible de développement de médicaments. Nous décrivons ici un essai à base de cellules visant à étudier le rôle de «région non traduite (3 &#39;UTR 3) dans la modulation du sort de son ARNm, et à identifier des composés capables de le modifier. Le dosage est basé sur l&#39;utilisation d&#39;une construction de rapporteur luciférase contenant la 3 &#39;UTR d&#39;un gène d&#39;intérêt intégré de façon stable dans une lignée cellulaire maladie pertinent. Le protocole est divisé en deux parties, avec l&#39;accent initial sur le dépistage primaire visant à l&#39;identification de molécules affectant l&#39;activité de la luciférase après 24 h de traitement. La seconde partie du protocoledécrit la contre-criblage nécessaire de discriminer composés modulant l&#39;activité de luciférase en particulier par la UTR 3 &#39;. En plus du protocole détaillé et des résultats représentatifs, nous fournissons des considérations importantes sur le développement de l&#39;essai et la validation du tube (s) sur la cible endogène. Le dosage du gène rapporteur décrit à base de cellules permettra aux scientifiques d&#39;identifier des molécules modulant les taux de protéines par des mécanismes post-transcriptionnel dépendant d&#39;un &#39;UTR 3.

En utilisant l&#39;approche décrite, nous avons criblé une bibliothèque 2000 composé de modulateurs potentiels de mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercée par la 3 &#39;UTR du gène N-MYC. La figure 3 illustre les résultats de l&#39;examen initial illustré par une plaque seule bibliothèque. signal de la luciférase affichée en pourcentage des contrôles traités avec le véhicule a été obtenu par mesure de l&#39;activité luciférase dans des plaques en triple des cellules CHP134 mycn3UTR-...

Ici, nous décrivons un test de gène rapporteur basé sur des cellules comme un outil précieux pour cribler les bibliothèques chimiques à la recherche de composés modulant les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercés par 3' UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Cette expérience permet de cribler des bibliothèques chimiques à la recherche de composés capables de moduler les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel via la région non traduite en trois prime des ARN messagers. Dans un premier temps, identifiez la région non traduite en trois prime d'intérêt dans le gène ciblé. Insérez cette région UTR 3′ dans un plasmide rapporteur de contrôle de la luciférase El afin de créer un transcrit chimérique de luciférase El portant une région UTR 3′.Ensuite, intégrez de manière stable les deux plasmides dans une lignée cellulaire pertinente pour la maladie, semez les cellules portant le transcrit chimérique dans des plaques de 96 puits, traitez-les avec une bibliothèque de composés pendant 24 heures, puis identifiez les molécules qui modulent l'activité de la luciférase.Sélectionner manuellement les molécules choisies pour un criblage de validation supplémentaire, puis traiter à la fois les cellules témoins et les cellules portant le transcrit chimérique luciférase avec un sous-ensemble de bibliothèque sélectionné manuellement. Les résultats permettront de distinguer si l'effet d'un composé est médié par la région non traduite en trois prime ou par d'autres séquences du vecteur. Contrairement à la plupart des essais de criblage basés sur des marqueurs rapporteurs.Des tests axés sur la régulation de la transcription, ces essais cellulaires se concentrent sur l'identification de composés modulant les niveaux d'ARNm via la région trois prime et la région traduite. Récolter les cellules de neuroblastome stables transfectées par trypsine. Diluer les cellules à une concentration de deux fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre.Dans RPMI contenant 10 %FBS et 1 %L-glutamine pour 27 plaques. Préparer au moins 250 millilitres de suspension cellulaire, en tenant compte de la manipulation des liquides, des volumes morts des réservoirs et des pipetages répétés. Ensuite, verser la suspension cellulaire dans un réservoir stérile et le placer sur le plateau du robot.Placer neuf plaques blanches plates 96 puits plates et une boîte de pipettes stériles de 200 microlitres sur le plateau du robot. Mélanger la suspension cellulaire, puis distribuer 75 microlitres de cellules dans chaque puits des neuf plaques.Couvrez les plaques et laissez les cellules sédimenter au fond des puits pendant 30 minutes afin de minimiser les effets de bord. Ensuite, placez les neuf plaques à 37 degrés Celsius et sous 5 % de dioxyde de carbone, et incubez pendant 24 heures. Procédez de la même manière avec les plaques restantes, neuf à la fois.Décongeler les plaques de la bibliothèque de composés à température ambiante. Remplir un réservoir avec du PBS stérile et un autre avec une solution de PBS contenant 0,5 % de DMSO, puis les placer sur le plateau du robot. Pour chaque plaque de bibliothèque.Préparez et étiquetez en conséquence. Une plaque de dilution. Remplissez maintenant chaque puits des colonnes deux à onze des plaques de dilution avec 398 microlitres de PBS stérile.Ensuite, remplir les colonnes 1 et 12 avec 50 microlitres de DMSO à 0,5 % dans du PBS stérile. Puis charger les deux plaques de dilution. Deux plaques de bibliothèque, deux boîtes de pointes stériles de 50 microlitres et six plaques de cellules sur le plateau du robot.Découvrez maintenant les plaques de cellules, pipetez deux microlitres de la solution mère de 10 millimolaire à partir de l'une des deux plaques de bibliothèque dans la plaque de dilution correspondante et mélangez soigneusement. En utilisant le même jeu de pointes, transférez trois microlitres de la dilution de 50 micromolaire dans les trois plaques blanches de 96 puits, codées par codes-barres, contenant les cellules.Remplacez complètement les pointes et répétez les inductions cellulaires pour la deuxième plaque de bibliothèque. Recouvrez les cultures et incubez pendant 24 heures. Ensuite, répétez le processus de dilution du composé et d'induction cellulaire pour les plaques de bibliothèque restantes.Équilibrez le réactif de luciférase reconstitué choisi à température ambiante. Placez le réservoir de luciférase sur le plateau du robot et versez le réactif à l'intérieur. Retirez neuf plaques de cultures induites de l'incubateur.Les placer sur le plateau du robot, les découvrir et les équilibrer à température ambiante. Ensuite, ajouter 50 microlitres du réactif luciférase par puits entre les plaques. Introduire un délai équivalent au temps de lecture de la luminescence d'une plaque.Après une incubation de 30 minutes. Commencez par enregistrer le code-barres de la plaque afin de l'associer au fichier de données correspondant. Ensuite, placez la première plaque dans le luminomètre et mesurez la luminescence.Après une brève étape d'agitation, répétez les mesures de luminiscence pour toutes les plaques d'induction. Ensuite, récupérez le réactif Lucifer race restant et conservez-le à moins 20 degrés Celsius. Une fois les données expérimentales du criblage primaire traitées, sélectionnez les hits afin de confirmer la spécificité du composé par un criblage complémentaire en sélection ciblée.Sélectionnez les hits retenus et créez une configuration pour la nouvelle plaque de criblage, incluant les positions des témoins. Ensuite, à partir des aliquots stockés dans des tubes uniques codés à barres 2D, préparez de nouvelles plaques HIIT. Suivez le même protocole que pour le criblage.Préparez 3 plaques de 96 puits de chaque lignée cellulaire stable par plaque hi. Le jour suivant, traitez les cellules avec les composés de la bibliothèque. Utilisez chaque plaque hi pour traiter trois plaques de CHP 1 34 micken, trois UTR en amont et trois plaques avec des cellules témoins à une concentration working de deux micromolaire pendant 24 heures.Mesurez l'activité de la luciférase dans toutes les plaques CHP 1 34, ainsi que dans les séries de contrôle et de région non traduite en 3'. Comme pour l'analyse des données dans le criblage primaire, normalisez les données expérimentales des puits traités par rapport à la moyenne des témoins traités au véhicule présents sur la même plaque. Calculez ensuite la moyenne et l'écart type sur les réplicats pour chaque composé testé.Le changement d'expression de l'activité de la luciférase dans CHP 1 34 McIn trois prime UTR par rapport à CHP 1 34. Les cellules témoins sélectionnent des seuils arbitraires de changement d'expression supérieurs à 1,5 et des valeurs de significativité P inférieures à 0,01. Cet essai a criblé une bibliothèque de 2000 composés afin d'identifier d'éventuels modulateurs des mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercés par le trois prime UTR de l' oncogène mic. Les résultats des signaux de luciférase d'une seule plaque représentative parmi 25 sont affichés en pourcentage par rapport au traitement au véhicule.Les témoins montrent que la majorité des composés n'ont aucun effet apparent sur la région UTR trois prime. Les composés actifs ont été sélectionnés selon les valeurs moyennes et les écarts-types calculés à partir de toutes les valeurs d'essai ; les composés réduisant l'activité de la luciférase en dessous de 20 % sont très probablement indicatifs d'une toxicité cellulaire marquée du composé. Ce graphique présente des résultats représentatifs pour le criblage secondaire de quatre composés sélectionnés désignés WX, Y et Z. Les deux composés W et X entraînent une augmentation de l'expression de la luciférase à partir du rapporteur UTR trois prime de l'oncogène, comme indiqué par la différence en facteur de variation et le test T. Notez que, bien que les effets des deux composés W et X dépendent réellement de l'UTR trois prime, le composé W n'a aucun effet significatif sur la viabilité cellulaire.Bien que le composé X présente une certaine activité cytotoxique, indiquée par le signal de luciférase normalisé dans les cellules contrôles CHP 134, ni le composé Y ni le composé Z à une concentration de deux micromoles ne présentent d'effet dépendant de la région trois brin UTR sur les niveaux de luciférase. La diminution de l'activité de la luciférase détectée lors du criblage primaire après traitement avec le composé Y est plutôt une conséquence de la cytotoxicité. Dans le cas du composé Z, l'augmentation de l'activité de la luciférase est due à une activation non spécifique, en termes de région trois brin UTR, du promoteur viral.Étant donné qu'une surexpression équivalente est observée dans les deux jeux, contrôle et non traduit, dans ce test à haut débit, gardez à l'esprit que la validation du signal principal dans les cellules de contrôle est essentielle pour distinguer les composés agissant réellement via la région non traduite en trois lignes premières de ceux qui agissent par l'intermédiaire du promoteur.

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