Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Cette expérience passe au crible les bibliothèques chimiques à la recherche de composés qui modulent les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel via les trois principales régions non traduites des transcrits. Tout d’abord, identifiez les trois principales régions d’intérêt non traduites dans le gène ciblé. Clonez ce UTR à trois premiers dans le plasmide rapporteur de contrôle d’El luciferase pour créer un transcrit chimérique d’El luciferase à trois premiers UTR.

Puis de manière stable. Intégrer les deux plasmides dans une lignée cellulaire pertinente pour la maladie : ensemencer les cellules portant le transcrit chimérique en 96. Les plaques de puits les traitent avec une bibliothèque de composés pendant 24 heures, puis identifient les molécules qui affectent l’activité de la luciférase.

Choisissez les molécules sélectionnées pour un criblage de validation plus approfondi, puis traitez à la fois les cellules de contrôle et les cellules porteuses du transcrit chimérique UTR de la luciférase à trois premiers temps avec un sous-ensemble de bibliothèque trié sur le volet. Les résultats différencieront si l’effet d’un composé est médié par les trois régions premières non traduites ou par d’autres séquences vectorielles. Contrairement à la plupart des essais de projection basés sur les journalistes.

Des tests axés sur la régulation de la transcription, ces tests basés sur des cellules se concentrent sur l’identification de composés qui modulent les niveaux de transcription de l’ARNm via trois régions premières et traduites. Récoltez les cellules de neuroblastome transfectées de manière stable par trypsine asiatique. Diluez les cellules à une concentration de deux fois 10 à la cinquième cellule par millilitre.

Dans RPMI contenant 10 % de FBS et 1 % de L-glutamine pour 27 plaques. Préparez au moins 250 millilitres de suspension cellulaire, en tenant compte de la manipulation des liquides, des volumes morts en auge et des étapes de pipetage répétées. Versez ensuite la suspension cellulaire dans un réservoir stérile et placez-la sur le bureau du robot.

Chargez neuf plats blancs à code-barres. Des plaques inférieures de 96 puits et une boîte de 200 pointes de pipette stériles de 200 microlitres sur le bureau du robot. Mélangez la suspension cellulaire, puis distribuez 75 microlitres de cellules dans chaque puits de neuf plaques.

Couvrez les plaques et laissez les cellules sédimenter au fond du puits pendant 30 minutes afin de minimiser les effets de bord. Placez ensuite les neuf assiettes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone et incubez pendant 24 heures. De même, procédez avec les assiettes restantes neuf à la fois.

Décongelez les plaques de la bibliothèque composée à température ambiante. Remplissez une auge avec du PBS stérile et une autre avec 0,5 % de DMSO dans une solution PBS et placez-les sur le bureau du robot. Pour chaque assiette de bibliothèque.

Préparez et étiquetez en conséquence. Une plaque de dilution. Remplissez maintenant chaque puits de colonnes, deux à 11 des plaques de dilution avec 398 microlitres de PBS stérile.

Remplissez ensuite les colonnes un et 12 avec 50 microlitres de DMSO à 0,5 % dans du PBS stérile. Ensuite, chargez les deux plaques de dilution. Deux plaques de bibliothèque, deux boîtes de 50 microlitres d’embouts stériles et six plaques de cellules sur le bureau du robot.

Découvrez maintenant les plaques cellulaires, pipetez deux microlitres de la solution mère de 10 millimolaires à partir de l’une des deux plaques de bibliothèque dans la plaque de dilution correspondante et mélangez bien. En utilisant le même ensemble d’embouts. Transférez trois microlitres de dilution de 50 micromolaires dans les trois plaques blanches à 96 puits à code-barres contenant les cellules.

Remplacez l’ensemble complet des pointes et répétez les inductions de cellules pour la deuxième plaque de bibliothèque. Couvrez les cultures et incubez pendant 24 heures. Répétez ensuite le processus de dilution du composé et d’induction cellulaire pour les plaques de bibliothèque restantes.

Équilibrez le réactif de luciférase reconstitué de votre choix à température ambiante. Placez le réservoir de luciférase sur le bureau du robot et versez-y le réactif. Retirez neuf plaques de cultures induites de l’incubateur.

Placez-les sur le bureau du robot, découvrez-les et équilibrez-les à température ambiante. Ajoutez ensuite 50 microlitres de réactif de luciférase par puits entre les plaques. Introduire un retard égal au temps de lecture de la luminescence d’une plaque.

Après une incubation de 30 minutes. Enregistrez d’abord le code-barres de la plaque afin de l’associer au fichier de données correspondant. Ensuite, placez la première plaque dans le luminomètre et mesurez la luminescence.

Après une brève étape d’agitation, répétez les lectures de luminescence pour toutes les plaques d’inductions. Ensuite, récupérez le réactif de race Lucifer restant et stockez-le à moins 20 degrés Celsius. Une fois que les données expérimentales du criblage primaire sont traitées, sélectionnez les résultats pour confirmer la spécificité du composé par une cerise de contre-criblage.

Sélectionnez les résultats sélectionnés et créez une disposition pour la nouvelle plaque de criblage, y compris les positions des commandes. Ensuite, à partir des aliquotes stockées dans des tubes à code-barres 2D uniques, créez de nouvelles plaques HIIT. Le suivi du même protocole est pour le dépistage.

Préparez 3 plaques de 96 puits de chaque lignée cellulaire stable par plaque hi. Le lendemain, traitez les cellules avec des composés de bibliothèque. Utilisez chaque plaque hi pour traiter trois plaques de CHP 1 34 micken, trois plaques primaires UTR et trois plaques avec des cellules de contrôle à une concentration de travail de deux micromolaires en 24 heures.

Mesurer l’activité de la luciférase dans toutes les plaques de la CHP 1 34, les trois ensembles premiers non traduits et les ensembles de contrôle. Comme pour l’analyse des données dans le dépistage primaire, normaliser les données expérimentales des puits traités à la moyenne des témoins traités sur les véhicules. Calculez ensuite la moyenne et l’écart-type sur les répétitions pour chaque composé testé.

La variation du pli de l’activité de la luciférase dans CHP 1 34 McIn prime UTR par rapport à CHP 1 34. Les cellules de contrôle sélectionnent des seuils arbitraires de changement complet supérieurs à 1,5 et des valeurs P de signification inférieures à 0,01. Cette expérience a passé au crible une bibliothèque de composés de 2000 à la recherche de modulateurs potentiels des mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercés à travers les trois premiers UTR du micro et de l’oncogène, les résultats des signaux de luciférase d’une seule des 25 plaques de bibliothèque représentatives affichées en pourcentage du véhicule traité.

Les contrôles montrent que la majorité des composés n’ont provoqué aucun effet apparent sur les trois premiers UTR. Les résultats positifs ont été sélectionnés lorsque la valeur moyenne et l’écart-type ont été calculés sur toutes les valeurs d’essai : les composés réduisant l’activité de la luciférase en dessous de 20 % sont les plus susceptibles d’indiquer une toxicité cellulaire prononcée du composé. Ce graphique montre des résultats représentatifs pour le contre-criblage de quatre composés sélectionnés désignés WX, Y et Z.Les deux composés W et X entraînent une augmentation de l’expression de la luciférase à partir du rapporteur UTR primordial de l’oncogène, comme l’indiquent la différence de changement de pli et le test T. Notez que si les effets des deux composés W et X dépendent véritablement du composé UTR tricolore, le composé W n’a pas d’effet significatif sur la viabilité cellulaire.

Alors que le composé X présente une certaine activité cytotoxique, comme l’indique le signal normalisé de la luciférase dans les cellules témoins de la CHP 1 34, ni le composé Y ni le composé Z à deux concentrations micromolaires ne présentent un effet dépendant de A trois premiers UTR sur les niveaux de luciférase. La diminution de l’activité de la luciférase détectée lors du dépistage primaire lors du traitement avec le composé Y est plutôt une conséquence de la cytotoxicité. Dans le cas du composé Z, l’augmentation de l’activité de la luciférase est due à une activation non spécifique de trois premiers UTR du promoteur viral.

Étant donné qu’une régulation positive équivalente est observée à la fois dans les ensembles témoins et non traduits Dans ce test à haut débit, rappelez-vous que la validation de la chaleur primaire dans les cellules de contrôle est essentielle pour la discrimination des composés qui agissent véritablement à travers les trois principales régions non traduites des composés qui fonctionnent via le promoteur.