Analyse de l'autophagie dans

L'objectif de cette procédure est d'induire et d'observer l'autophagie chez un champignon filamenteux. Cette étape est réalisée en inoculant d'abord de petits volumes de milieu contenant des nutriments avec des spores ou de petits fragments de mycélium. Dans une deuxième étape, des tampons de privation sont préparés dans les cavités de lamelles de microscope en verre, puis l'inoculum est transféré sur ces tampons.

Dans la dernière étape, les boîtes de privation sont incubées dans une chambre humide afin d'induire l'autophagie. En fin de compte, l'autophagie peut être suivie en surveillant la translocation de protéines marqueurs fluorescentes d'intérêt vers les vacuoles à l'aide d'une microscopie en fluorescence. Cette méthode peut aider à étudier des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles que l'identification de nouveaux composés modulant le processus d'autophagie.

Pour préparer une expérience de privation, si la souche d'intérêt de P cresa genum est conservée sur du riz vert, placez d'abord deux à trois grains de riz recouverts de mycélium en satiété dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 µL, puis remplissez le tube avec 500 microlitres de milieu de croissance à l'extrait de levure et au glucose, ou milieu GG large. Vortexez ensuite le tube pendant 30 secondes afin que les spores se détachent du riz, puis incubez le tube pendant un jour à température ambiante. Le jour suivant, diluez la suspension de spores à une concentration de un à 50 dans de l'eau du robinet stérile et mélangez soigneusement si le p cryogène est conservé sur gélose.

Utilisez une pipette pour transférer de petits morceaux de mycélium dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 400 microlitres d'eau du robinet stérile et environ 100 milligrammes de billes de verre. Ensuite, vortexez le tube pendant deux minutes afin que les mycéliums soient fragmentés. Pour cultiver le génome PCE sur un tampon de privation, chauffez d'abord la plaque chauffante à environ 60 degrés Celsius.

Ensuite, faites chauffer deux grammes d'aros dans 100 millilitres d'eau du robinet au micro-ondes jusqu'à ce que la solution obtenue soit parfaitement claire, tout en laissant l'aros refroidir à environ 60 degrés Celsius. Étiquetez un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre par échantillon contenant 400 microlitres d'eau du robinet stérile ou d'une solution composée. Puis, réchauffez les tubes et les lames de microscope sur la plaque chauffante pendant au moins 60 secondes.

Transférez 400 microlitres d’aros à 60 degrés Celsius dans tous les tubes, portant le volume total dans chaque tube à 800 microlitres, puis vortexez brièvement les tubes. Replacez ensuite les tubes sur la plaque chauffante afin d’éviter la solidification prématurée. Pipetez maintenant 140 microlitres de la solution d’aros appropriée dans la cavité de chaque lame de microscope. En prenant soin de ne pas former de bulles, aplatissez immédiatement l’aros à l’aide de lamelles, puis laissez reposer les lames environ quatre minutes.

À température ambiante, une fois que les pastilles d'aros ont solidifié, utilisez le pouce ou l'index pour retirer délicatement les lamelles et placez les porte-objets avec les pastilles dans une chambre humide. Ensuite, pipetez cinq microlitres du P. entomophila précédemment préparé au centre de la pastille de privation, puis enveloppez la chambre humide dans un sac en plastique pour une protection supplémentaire contre le dessèchement, en prenant soin de ne pas trop déplacer la boîte ni perturber les cultures. Conservez ensuite les inoculats à température ambiante pendant au moins 20 heures avant d'analyser les échantillons.

Le lendemain, transférez les lames sur du papier absorbant, puis déposez 50 microlitres d'eau sur chaque tampon de privation. Utilisez un couvre-objet pour expulser l'excès d'eau et retirez-le avec du papier absorbant propre. Ensuite, pour chaque lame, utilisez un objectif 20 x pour acquérir une vue d'ensemble de la croissance du mycélium.

Pour évaluer la localisation de la GFP dans le Hy-Fi, ouvrez les images avec l'objectif 63 x ou 100 x. Enfin, replacez les lames dans la chambre humide après chaque observation jusqu'au prochain point temporel expérimental.

Dans ces images, la souche G-F-P-S-K-L-P Creo Genum a été utilisée pour évaluer la dégradation des peroxysomes après 20 heures d'incubation. La GFP n'a pas été observée dans les vacuoles, et ces organites n'étaient pas non plus agrandis. Toutefois, après 40 heures de croissance, des vacuoles marquées par la GFP pouvaient être visualisées dans certains hyphes, indiquant l'activation de l'autophagie, avec une observation plus marquée de la fluorescence GFP et des vacuoles agrandies après 60 heures.

Dans cette expérience, un mutant delta 80 G un de p caressa Genum a été utilisé comme témoin négatif. Remarquez l'absence d'agrandissement des vacuoles et de GFP, même après 60 heures de croissance. Comme témoin positif, le médicament stimulateur d'autophagie, la rapamycine, a été utilisé, comme observé avec la souche G-F-P-S-K-L non traitée. Les vacuoles marquées par la GFP sont devenues visibles après 40 heures de croissance, la Hy-Fi étant complètement remplie de grandes vacuoles contenant de la GFP au bout de 60 heures.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser l'autophagie chez les champignons mentis.