Name: Análise de Autophagy em Penicillium chrysogenum Por a inanição Pads em combinação com microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprenda a induzir e analisar autofagia em Penicillium chrysogenum usando pads de inanição e microscopia de fluorescência. Este método permite rastrear marcadores fluorescentes em vacúolos e identificar compostos que modulam o processo.

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CQS recebe uma bolsa do LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). O autor gostaria de agradecer a Ida J. van der Klei pelas cepas de P. chrysogenum usadas neste trabalho e a Andreas S. Reichert pelo presente da rapamicina.

1. Preparação de P. chrysogenum para os experimentos de fome <ol><li> Se o P. chrysogenum estirpe de juros é mantida em arroz (&#39;arroz verde &quot;), coloque 2-3 grãos de arroz cobertos com esporulação micélio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Preenchê-lo com 500 ul YGG (10 g / l de KCl, 20 g / l de glucose, 10 g / l de base azotada de levedura, 5 g / l de K 2 HPO 4, 20 g / l de extracto de levedura). <ol><li> Vortex o tubo durante 30 segundos de modo a que os esporos podem separar de forma eficiente o arroz. </li><li> Incubar o tubo durante 1 dia a temperatura ambiente (por exemplo, entre 20 e 25 ° C). </li><li> Preparar uma diluição dessa suspensão de esporos na água da torneira estéril 1/50, misture bem. </li></ol></li><li> Se o P. chrysogenum estirpe de interesse é mantida numa placa de agar (por exemplo, YGG placa de agar), transferir pequenos pedaços de micélio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 400 ul de água de torneira esterilizada e cerca de 100 mg glgrânulos burro usando um palito estéril ou ponteira. <ol><li> Vortex o tubo durante 2 minutos de modo que se torna o micélio fragmentado. Utilizar o conteúdo do tubo imediatamente. </li></ol></li></ol> 2. Passos preparatórios para o cultivo de P. chrysogenum em Pads de fome <ol><li> Ligue a placa de aquecimento e configurá-lo para cerca de 60 ° C. </li><li> Dissolve-se 2 g de agarose em 100 ml de água da torneira por cozimento a solução num forno de microondas. Tome cuidado para que esta solução é completamente claro após o aquecimento. Se não for, cozinhá-lo novamente até que a agarose é dissolvido completamente. Deixar a solução arrefecer de agarose a cerca de 60 ° C antes da utilização. </li><li> Encher tubos de 1,5 ml de microcentrífuga (2-4, dependendo o número de amostras) com 400 ul de água estéril (sem toque em cada um adicionados compostos adicionais) ou 400 ul-x (x adição de uL de solução do composto no passo 2.5) e colocá-los sobre a placa de aquecimento durante pelo menos 1 minuto, de modo que o water dentro fica quente. </li><li> Colocar as lâminas de microscópio que contêm uma cavidade central sobre a placa de aquecimento durante pelo menos 1 min. </li><li> Adicionar 400 ul de 2% de agarose para a solução nos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e vortex brevemente. Após este passo, se desejado, adicionar compostos adicionais (ou seja, 1 uM de rapamicina). Se isso for feito, vortex brevemente depois de cada substância adicional é pipetado para o tubo. Colocar os tubos de volta para a mesa de aquecimento para evitar a solidificação prematura. NOTA: O volume total no tubo de microcentrífuga deverá ser de 800 uL. </li></ol> 3. Preparação de microscópicas Contendo Inanição Pads <ol><li> Pipetar 140 uL da solução de agarose para dentro da cavidade da lâmina de microscópio (ainda que está localizado na placa de aquecimento). Tente evitar fazer bolhas, se possível. </li><li> Imediatamente coloque uma lamela para a solução de agarose. NOTA: Este vai resultar em uma superfície plana. </li><li> Coloque o microâmbito deslizante na bancada do laboratório para aproximadamente 4 min para permitir a almofada de agarose para solidificar. </li><li> Remova cuidadosamente a lamela do pad agarose, deslizando-a com a ajuda de um polegar ou o dedo indicador (usar luvas para evitar a contaminação!). </li><li> Coloque a lâmina de microscópio com a almofada em uma câmara úmida para evitar a dessecação. Recomendação: Use uma caixa de ponta vazia que ainda tem o insert para manter as pontas de pipeta. Adicionar água estéril para a caixa de modo que o fundo é coberta. Coloque as lâminas de microscópio para a inserção e fechar a caixa. </li></ol> 4. inoculação da inanição Pads com P. chrysogenum e incubação <ol><li> Pipetar 5 ul de uma diluição 1/50 de esporos (se as culturas foram cultivadas em arroz) ou 5 ul da solução não diluída contendo fragmentos de micélio (se as culturas foram cultivadas numa placa de agar) para o centro da almofada de inanição. </li><li> Feche a câmara úmida e envolvê-la em um saco plástico (isso serve comoproteção adicional contra a dessecação das almofadas de fome). Tenha cuidado para não mover a caixa muito, porque de outra forma as gotas de inoculação será perturbado. </li><li> Armazenar a caixa embrulhada à temperatura ambiente durante pelo menos 20 h, antes de analisar as amostras. </li></ol> 5. microscópica análise das amostras <ol><li> Após 20 horas de incubação, as amostras estão prontas para análise microscópica; colocar a lâmina de microscópio em papel tecido seco (o fundo tende a ficar molhado). </li><li> Pipetar um pequeno volume de água (cerca de 50 mL) para a almofada de inanição. Coloque uma lamela sobre o bloco e esprema a água excedente. Retire o excesso de água com um lenço de papel. </li><li> Colocar a lâmina do microscópio sobre a mesa de observação de um microscópio de fluorescência. Para obter uma visão geral de crescimento micelial, use um objetivo 20X. Uso objectivos 63x ou 100x para estudar a localização de GFP nas hifas. A fim de evitar a dessecação progressiva da amostra não analisar as amostras durantemais de 15 min antes de colocá-los de volta para a câmara úmida. </li><li> Repita 5,3 em intervalos regulares (por exemplo, depois de 40 horas e 60 horas de crescimento). NOTA: A amostra pode ser colocado de volta na câmara úmida. Não é necessário retirar as lamelas uma vez que não afecta o crescimento do micélio. </li></ol>

<ol><li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control%3A+an+integrated+network+of+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li>
<li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina%3A+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li>
<li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li>
<li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li>
<li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li>
<li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li>
<li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding%2C+improving+and+using+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li>
<li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+regulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li>
<li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).</li>
</ol>

O autor não tem nada a divulgar.

O método aqui apresentado permite o estudo conveniente e reprodutível de autofagia em P. chrysogenum. Por exemplo, ele pode ser usado para o rastreio de a eficácia de vários compostos se eles são capazes de modular a resposta autofagia deste fungo ou não. Os resultados obtidos com rapamicina demonstram que a inibição da sinalização de TOR conduz a uma indução de autofagia pronunciada em P. chrysogenum que foi também demonstrada para outros organismos 11. É possív...

Os fungos filamentosos são excelentes sistemas de modelo para o estudo dos processos de desenvolvimento. Eles oferecem vários benefícios experimentais como cultivo barato, um elevado número de descendentes e acessibilidade genética. O último ponto é de particular relevância para a construção de transformantes que permite que se investigue a importância de genes tão longe descaracterizados para vários mecanismos celulares. Os fungos filamentosos têm sido fundamentais para a elucidação de vários elementos e mecanismos de controlo de qualidade das vias celulares, como a actividade de protease para a degradação de proteínas anormais, dinâmica mitocondrial para manter a integridade mitocondrial e autofagia para a remoção de excesso e / ou componentes celulares e para a manutenção disfuncionais viabilidade celular em tempos de fome 1,2,3. Existem várias técnicas experimentais disponíveis para o estudo da autofagia em fungos filamentosos 2: (i) a investigação das vacúolos if eles contêm corpos autophagic densos quando as proteases são inibidas por microscopia electrónica de transmissão 4, (ii) a visualização de autofagossomas por monitorização focos GFP-Atg8 através de microscopia de fluorescência de 5,6 e (iii) detecção de estruturas autophagosomal acidificadas utilizando o corante fluorescente monodansyl cadaverina 7. Aqui, um novo método para o crescimento de Penicillium chrysogenum para estudos autofagia é apresentado. O elemento principal é o &#39;pad fome &quot;, que consiste simplesmente de agarose a 1% dissolvido em água de torneira esterilizada. Compostos adicionais (por exemplo, factores de stress, sequestrantes, moduladores autofagia) pode ser adicionado à almofada, enquanto eles não exibem auto-fluorescência. A almofada está localizada em lâminas de microscópio que contêm uma cavidade central raso. Esta almofada em inoculados com uma suspensão de esporos ou com fragmentos de micélio pequenos. O último é aconselhável se a estirpe de interesse não sporulate eficiente (por exemplo, estirpes atg1 Δ 8). As lâminas estão posicionadas em câmaras húmidas (estes podem ser facilmente construídas usando caixas de ponta de pipeta vazios) para evitar a secagem da amostra e incubou-se à temperatura ambiente. P. chrysogenum é capaz de crescer durante alguns dias sob estas condições. Autophagy pode ser observada microscopicamente por alargamento vacuolar que é um marcador positivo para autofagia fúngica. Nesta contribuição, a P. chrysogenum estirpe (Wisconsin 54-1255) é usado, que forma a proteína verde fluorescente que é direcionado para peroxisomes pela sua sequência C-terminal &#39;SKL «9. Por conseguinte, é possível monitorizar a degradação dos peroxissomas. É possível rotular também outros compartimentos da célula (por exemplo, mitocôndrias) usando os sinais de localização adequados e analisar a sua degradação. Embora os dados de P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) é apresentado aqui, é certamente possívelpara usar o método de &#39;almofada de fome &quot;, também para outros fungos filamentosos (por exemplo, Neurospora crassa, Sordaria macrospora, espécies de Aspergillus, etc.).

<table><tbody><tr><td>Lâminas de microscópio com cavidade central</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha</td><td>H884.1</td><td>Podem ser usadas várias vezes após a limpeza.</td></tr><tr><td>Contas de vidro</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha</td><td>A553.1</td><td>Diâmetro: 0,25 - 0,50 mm</td></tr></tbody></table>

análise de autophagy em<em&gt; penicillium chrysogenum</em&gt; por a inanição pads em combinação com microscopia de fluorescência

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

O estudo dos sistemas de controle de qualidade celular emergiu como um campo altamente dinâmico e relevante da pesquisa contemporânea. Ficou claro que as células possuem várias linhas de defesa contra danos a moléculas biologicamente relevantes, como ácidos nucléicos, lipídios e proteínas. Além da dinâmica das organelas (fusão/fissão/motilidade/herança) e da atividade da protease rigidamente controlada, a degradação de organelas excedentes, danificadas ou comprometidas pela autofagia ('auto-alimentação' celular) tem recebido muita atenção da comunidade científica. A regulação da autofagia é bastante complexa e depende de fatores genéticos e ambientais, muitos dos quais até agora não foram elucidados. Aqui é apresentado um novo método que permite o estudo conveniente da autofagia no fungo filamentoso Penicillium chrysogenum. Baseia-se no crescimento do fungo nas chamadas 'almofadas de fome' para estimulação da autofagia de maneira reprodutível. As amostras são testadas diretamente por microscopia e avaliadas quanto à indução/progresso da autofagia. O protocolo aqui apresentado não se limita ao uso com P. chrysogenum e pode ser facilmente adaptado para uso em outros fungos filamentosos.

Para demonstrar a utilidade do protocolo detalhado acima degradação de peroxissoma no P. chrysogenum estirpe Ws54-1255 (GFP-SKL) foi analisada. Nesta estirpe GFP-SKL é geralmente importada para peroxisomes 9. Isto resulta no aparecimento de múltiplas formas esféricas quando a amostra é analisada através de microscopia de fluorescência. Se ocorrer a autofagia, vacúolos ampliar. GFP-SKL é incorporado vacúolos por autofagia (pexophagy). Devido ao facto de que a GFP é resistente à degradação por protease...

Um método conveniente e poderoso para estudar a autofagia em Penicillium chrysogenum usando almofadas de fome (misturas de agarose e água da torneira em uma lâmina de microscópio contendo uma cavidade central) é apresentado aqui.

Análise de Autophagy em<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por a inanição Pads em combinação com microscopia de fluorescência

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

O objetivo deste procedimento é induzir e observar a autofagia em um fungo filamentoso. Isso é realizado primeiramente inoculando pequenos volumes de meio contendo nutrientes com esporos ou pequenos fragmentos de micélio. Na segunda etapa, são preparados suportes de privação nas cavidades de lâminas de microscópio de vidro, e então o inóculo é transferido para os suportes.No passo final, as placas de privação são incubadas em uma câmara úmida para induzir a autofagia. Em última análise, a autofagia pode ser acompanhada por meio do monitoramento da translocação de proteínas marcadoras fluorescentes de interesse para as vacúolos utilizando microscopia fluorescente. Este método pode auxiliar no estudo de questões fundamentais no campo da biologia celular, como a identificação de novos compostos que modulam o processo de autofagia.Para se preparar para um experimento de privação alimentar, se a estirpe de P cresa genum de interesse for mantida em arroz verde, coloque inicialmente dois a três grãos de arroz cobertos com micélio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 micro, e complete o tubo com 500 microlitros de meio de crescimento com extrato de levedura e glicose ou meio GG amplo. Em s

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

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Biologia

Uma abordagem robusta para monitorar a entrega de organelas para a luz ácida do vacúolo levedura para a degradação e reciclagem é descrito. O método baseia-se na rotulagem específica de organelas-alvo com uma geneticamente codificado fluorescência dupla emissão de pH biosensor, e visualização de células individuais usando a microscopia de fluorescência.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy é um processo ubíquo que permite que as células para se degradarem e reciclar proteínas e organelas. Aplicamos microscopia de fluorescência para visualizar avançada e quantificar o pequeno, mas, alterações físicas essenciais associados com a indução de autofagia, incluindo a formação e distribuição de autofagossomas e lisossomas, e sua fusão em autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Microscopia de lapso de tempo de marcadores autofagia fluorescente etiquetado permite o monitoramento da resposta autofagia dinâmico com alta resolução temporal. Usando autofagia organela específica e marcadores numa combinação de três cores diferentes, pode-se seguir a contribuição de uma proteína para a formação autophagosome num contexto espacial e temporal robusta.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP). Protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia induzida por CLP são aqui apresentados: Um protocolo para medir autofagia utilizando ratinhos (GFP)-LC3, e um protocolo para medir a formação de autophagosome por microscopia electrónica.

Cecal ligadura e punção induzida Sepsis como um modelo para estudar a autofagia em Ratos

Para combater a disseminação da bactéria, as células hospedeiras reorganizar seu citoesqueleto de compartimentar as bactérias e induzir a autofagia. Usando Shigella infecção de células de cultura de tecidos, hospedeiro e determinantes de agentes patogénicos subjacentes a este processo são identificados e caracterizados. Utilizando modelos de peixe-zebra de infecção Shigella, o papel de moléculas e de mecanismos descobertos são investigados in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Nós desenvolvemos um fluxo de trabalho simples e adaptável para extrair dados quantitativos de estudos biológicos fluorescência-imagem latente-à base de célula de agregação de proteínas e autophagic fluxo no sistema nervoso central de Drosophila modelos de Neurodegeneração.

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

Este papel detalha um protocolo para preparar uma cocultura de pilhas e de amebas criptocócica que é estudado usando imagens imóveis, fluorescentes e imagens de alta resolução do microscópio de elétron da transmissão. Ilustrados aqui é como os dados quantitativos podem complementar tais informações qualitativas.

Uso complementar de técnicas microscópicas e leitura de fluorescência no estudo de Cryptococcus-Amoeba interações

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Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3

Aqui, apresentamos um protocolo para microscopia óptica-eletrônica correlativa otimizada em secção baseada em marcação endógena fluorescente como uma ferramenta para investigar a localização de proteínas raras em relação à ultraestrutura celular. O poder desta abordagem é demonstrado pela localização ultraestrutural da CL3 endógena em células famintas sem tratamento com Bafilomicina.

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

Aprenda a induzir e analisar autofagia em Penicillium chrysogenum usando pads de inanição e microscopia de fluorescência. Este método permite rastrear marcadores fluorescentes em vacúolos e identificar compostos que modulam o processo.

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