Name: Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour lisolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Découvrez une méthode de biopanning basée sur la microscopie à force atomique pour isoler des anticorps spécifiques contre les variants TDP-43 dans la sclérose latérale amyotrophique. Cette technique améliore la détection des protéines à faible concentration.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cette recherche a été financée par une subvention du NIH: R21AG042066. Nous tenons à remercier Philip Schulz pour ses contributions dans la création des vidéos de capture d&#39;écran.

<ol><li>Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+recombinant+antibodies+against+specific+protein+morphologies+using+atomic+force+microscopy+and+phage+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies.</a> Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).</li>
<li>Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+Human+Single+Chain+Antibody+Fragment+Against+Oligomeric+%CE%B1-Synuclein+that+Inhibits+Aggregation+and+Prevents+%CE%B1-Synuclein-induced+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity.</a> Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).</li>
<li>Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Morphologically+Distinct+Oligomeric+Forms+of+%CE%B1-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+specific+for+oligomeric+beta-amyloid+stabilizes+nontoxic+form%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form.</a> Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+antibody+fragments+selective+for+specific+protein+morphologies+from+nanogram+antigen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples.</a> Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).</li>
<li>Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-oligomeric+A%CE%B2+Single-chain+Variable+Domain+Antibody+Blocks+A%CE%B2-induced+Toxicity+Against+Human+Neuroblastoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells.</a> Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+%CE%B2-Secretase+Activity+in+Alzheimer%27s+Disease+Cell+Models+with+Single-Chain+Antibodies+Specifically+Targeting+APP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP.</a> Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+Tandem+Single+Chain+Antibody+Simultaneously+Inhibits+%CE%B2-Secretase+and+Promotes+%CE%B1-Secretase+Processing+of+A%CE%B2PP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).</li>
<li>Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Single-Chain+Fv+Intrabody+Blocks+Aberrant+Cellular+Effects+of+Overexpressed+%5Balpha%5D-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein.</a> Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43-mediated+neurodegeneration%3A+towards+a+loss-of-function+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).</li>
<li>Akamatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+mouse+model+for+investigating+the+properties+of+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+protein+TDP-43%2C+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation.</a> Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).</li>
<li>Keage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+in+the+Population%3A+Prevalence+and+Associations+with+Dementia+and+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).</li>
<li>Honda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ALS%2FFTLD-related+RNA-binding+proteins+TDP-43+and+FUS+have+common+downstream+RNA+targets+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons.</a> FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).</li>
<li>Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43%3A+the+relationship+between+protein+aggregation+and+neurodegeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration.</a> FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).</li>
<li>Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).</li>
<li>Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+subcellular+localization+of+TDP-43+immunoreactivity+in+the+anterior+horns+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).</li>
<li>Robertson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+TDP-43+abnormalities+in+mutant+SOD1+transgenic+mice+shows+disparity+with+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS.</a> Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).</li>
<li>Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mislocalization+of+TDP-43+in+the+G93A+mutant+SOD1+transgenic+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS.</a> Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abnormal+processing+of+TDP-43+is+not+an+upstream+event+of+reduced+ADAR2+activity+in+ALS+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons.</a> Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+abolishes+mutant+TDP-43+induced+excitability+in+a+motoneuron-like+cellular+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS.</a> Neuroscience. 272, 141-153 (2014).</li>
<li>Sheets, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+a+large+nonimmune+phage+antibody+library%3A+The+production+of+high-affinity+human+single-chain+antibodies+to+protein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).</li>
<li>Hairul Bahara, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+antibodies+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Phage display antibodies for diagnostic applications.</a> Biologicals. 41, 209-216 (2013).</li>
<li>Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+technology%3A+clinical+applications+and+recent+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+single-chain+antibodies+from+a+human+synthetic+phage+display+library+for+detection+of+Bacillus+thuringiensis+%28Bt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cry1B+toxin.+Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt).</a> Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+single-chain+recombinant+antibodies+against+spring+viraemia+of+carp+virus+from+mouse+phage+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library.</a> Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).</li>
<li>Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+salivary-pellicle-binding+peptide+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display.</a> Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).</li>
<li>Adamson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+antibodies+to+the+prion+protein+identified+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display.</a> Virology. 358, 166-177 (2007).</li>
<li>Hebron, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+Ubiquitinates+Tar-DNA+Binding+Protein-43+%28TDP-43%29+and+Promotes+Its+Cytosolic+Accumulation+via+Interaction+with+Histone+Deacetylase+6+%28HDAC6%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6).</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).</li>
<li>Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Antibody+Specificity+to+Different+Protein+Morphologies+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM.</a> Langmuir. 25, 912-918 (2008).</li>
<li>Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+brain-reactive+autoantibodies+and+behavioral+deficits+in+the+MRL+model+of+CNS+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus.</a> Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).</li>
<li>Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+external+factors+on+bacteriophages%E2%80%94review%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The influence of external factors on bacteriophages—review.</a> Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).</li>
<li>Hammers, C. M., Stanley, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Phage+Display%3A+Technique+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Antibody Phage Display: Technique and Applications.</a> J Invest Dermatol. 134, e17(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il a été démontré que les variantes protéiques sont impliquées dans la progression de nombreuses maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la SLA et la DFT1,2,3,4,5,6,7,8,9,9,10,11. L’isolement d’anticorps capables de reconnaître sélectivement ces différentes cibles de variantes protéiques peut être un réactif efficace pour étudier, diagnostiquer et potentiellement traiter de telles affections. Pour générer de tels anticorps spécifiques à la variante, nous avons ...

La présence de variants de protéine a été impliqué comme un facteur dans la progression de nombreuses maladies, dont les maladies neurodégénératives telles que la maladie d&#39;Alzheimer, la maladie de Parkinson, la SLA et la démence frontotemporale (DFT) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Formes oligomères de la protéines bêta-amyloïde et l&#39;alpha-synucléine sont pensés pour être les espèces toxiques responsables de la maladie d&#39;Alzheimer et de Parkinson, respectivement 2,3,4,5. Agrégats de la TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) ont été associés à la SLA et la DFT 12,13,14. Par conséquent réactifs tels que des anticorps qui peuvent cibler sélectivement les différentes variantes de protéines peuvent être des outils puissants pour servir de marqueurs diagnostiques et thérapeutiques potentiels. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur le développement de réactifs qui se lient sélectivement variants de la protéine TDP-43 impliqué dans la SLA, mais la technique décrite dans ce document devrait être applicable à l&#39;isolement des réactifs contre un large éventail de protVariantes ein. Agrégation cytoplasmique de TDP-43 a été identifiée comme une caractéristique pathologique de la SLA 15,16,17,18,19. Typiquement TDP-43 se trouve dans le noyau de toutes les cellules d&#39;un individu normal, même si elle a tendance à se déplacer entre le cytosol et le noyau 15,17. Toutefois les formes, dans la SLA agrégées de TDP-43 sont détectés dans le cytoplasme des neurones et cellules gliales de sélection avec de plus faibles concentrations trouvées dans le noyau suggérant le mouvement de TDP-43 du noyau vers le cytoplasme au cours de la progression de la maladie 16,20. Bien que l&#39;agrégation de TDP-43 se trouve dans la majorité des cas de SLA, elle ne tient pas compte de tous les cas étant donné que 1% à 2% des cas de SLA ou total (15% -20% des cas de SLA familiale) sont liées à des mutations dans le superoxyde dismutase 1 (SOD1) de 15,17 génique. En raison de l&#39;importance du rôle du TDP-43 dans la grande majorité des cas de SLA, ici nous nous concentrons sur le développement de réactifs à base d&#39;anticorps qui peuvent se lier sélectivement à TDP-43 variantes qui sontprésent dans le tissu cérébral humain SLA utilisant nos techniques de base biopanning roman AFM. Au départ, nous devons un répertoire varié de domaines de liaison d&#39;anticorps. Nous avons combiné trois phage display chaîne unique domaine variable fragments d&#39;anticorps différents (scFv), les bibliothèques (Tomlinson I et J et draps bibliothèques 21). Le processus de panoramique est divisé en phases positives et négatives panoramiques. Les phages provenant des bibliothèques sont d&#39;abord soumis à la procédure de panning négatif au cours de laquelle phages réactif de multiples antigènes hors cibles sont exclus. Après la fin de chaque cycle de lavage négative contre chaque antigène hors cible, le processus est surveillé par imagerie AFM se assurer que tous les antigènes hors cibles contraignantes phage ont été supprimés. Seulement après vérification par l&#39;AFM imagerie que tous les phages réactifs sont retirés ne nous procédons à la prochaine cible. Pour isoler réactifs contre TDP-43 variantes impliqués dans la SLA, nous avons utilisé les antigènes panoramique négatifs suivants:<html> 1) BSA pour éliminer les phages qui se lient faiblement ou de manière non spécifique à des protéines; 2) agrégé alpha-synucléine pour supprimer phage qui se lient à des éléments structurels génériques de protéines agrégées; 3) des homogénats de tissu cérébral humain pour éliminer les phages qui se lient à des protéines ou d&#39;autres composants présents dans les échantillons post-mortem de tissu cérébral humain sain; 4) immunoprécipité TDP-43 à partir de cerveau humain sain pour enlever phage qui se lient à tous TDP-43 formes associées avec le cerveau humain sain; et 5) immunoprécipité TDP-43 isolé de FTD homogénats de cerveau pour enlever phage qui se lient TDP-43 variantes associés à la non-ALS pathologie. Après élimination de tous phage réactif à tous les antigènes hors cible, nous avons ensuite procédé à la phase de balayage panoramique positif au cours de laquelle des fragments d&#39;anticorps qui se lient à l&#39;antigène d&#39;intérêt sont isolés, dans ce cas, TDP-43 immunoprécipitée à partir de tissu cérébral ALS humain. Ces anticorps isolés peuvent être réactif à des formes agrégées ou modifiées de TDP-43. &quot;&gt; Conventionnelle phage biopanning se concentre principalement sur ​​la phase de balayage panoramique positif 22,23. Habituellement, la cible d&#39;intérêt est immobilisé, la banque de phages ajoutés et phages liés éluée. Les phages sont ensuite amplifiés et ajoutés à la cible à nouveau. Ce processus d&#39;amplification et incubation est généralement répété plusieurs fois pour augmenter le pourcentage de liaison de phage positif. Bien que des variations de ce procédé ont été largement utilisées pour isoler des anticorps réactifs contre une large gamme d&#39;antigènes cibles, ils nécessitent généralement de grandes quantités d&#39;antigène cible purifiée 24,25,26, 27, alors que notre procédé ne nécessite que des traces de l&#39;antigène cible. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour isoler des réactifs qui antigènes cibles se lient sélectivement qui sont présents à de très faibles concentrations, sans la nécessité d&#39;une purification et le panoramique peut être effectuée directement contre antigène présent dans des échantillons de tissus complexes. L&#39;utilisation de protocoles de panoramique négatifs exhaustives tel que vérifiépar l&#39;AFM assure que clones isolés contre l&#39;antigène positif devraient lier sélectivement la cible, même lorsqu&#39;il ne est pas purifié ou enrichi. Kasturirangan et ses collègues (2003) ont effectué un processus de biopanning négative et positive similaire visant à isoler des anticorps réagissant à la bêta-amyloïde oligomères en utilisant une concentration de l&#39;ordre du nanogramme de la cible 5. Ici, nous développons sur ce processus pour permettre la génération de réactifs qui se lient sélectivement la protéine spécifique de la maladie variantes directement à partir des échantillons de tissus humains. Dans les études futures nous avons l&#39;intention d&#39;approfondir non seulement la valeur diagnostique des réactifs isolés ici, mais aussi évaluer leur pertinence thérapeutique pour le traitement de la SLA. Dans l&#39;ensemble, notre nouvelle technologie à base de bioadhérence AFM devrait être applicable à l&#39;isolement de ne importe quel variant de protéine spécifique de la maladie dans tout matériel biologique sans la nécessité d&#39;une purification ou la modification de protéines, même lorsque l&#39;antigène cible Concentrations sont extrêmement faibles.

<table><tbody><tr><td>Tomlinson I and J Libraries</td><td>MRC (Cambridge, Angleterre)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sheets Library</td><td>MRC (Cambridge, Angleterre)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>BD Sciences</td><td>244020</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Amresco</td><td>0188-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>KM13 Helper Phage</td><td>MRC (Cambridge, Angleterre)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>OmniPur</td><td>5880</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Polyéthylène Glycol 8000</td><td>OmniPur</td><td>6510</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Macron</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Amresco</td><td>0404-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Irritant Chlorure de potassium</td><td>EMD</td><td>PX1405-1</td><td></td></tr><tr><td>Irritant Potassium Phosphate monobasique</td><td>Amresco</td><td>0781-500G</td><td>Cellules TG1</td></tr><tr><td>irritantes</td><td>MRC (Cambridge, Angleterre)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani Agar</td><td>EMD</td><td>1.10283.0500</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tampon STEN</td><td>Crystalgen Inc.</td><td></td><td></td>33429775</tr><tr><td>Immunotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>470319</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Épicéa Pin Mica</td><td>24365</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>EMD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>T-0303</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Triéthylamine</td><td>Sigma</td><td>T-0886</td><td>Glycérol inflammable</td></tr><tr><td></td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Kit de préparation de plasmides d’ADN</td><td>qiagen</td><td>27106</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>Carnation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque ELISA à haute liaison 96 puits</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>Anti-M13 HRP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-9421-01</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal anti-TDP 43</td><td>ProteinTech</td><td>10782-2-AP</td><td></td></tr><tr><td>A/G Perles d’agarose</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>HB 2151 Cellules</td><td>MRC (Cambridge, Angleterre)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropylthiogalactoside</td><td>Teknova</td><td>13325</td><td></td></tr><tr><td>9e10 HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de nitrocellulose</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>Centrifugeuse inflammable</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall RC 6+</td><td></td></tr><tr><td>Nanoscope IIIa Microscope à force atomique</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM Sondes</td><td>VistaProbes</td><td>T300R-10</td><td></td></tr></tbody></table>

roman microscopie à force atomique based biopanning pour l&#39;isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre tdp-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Parce que les variantes de protéines jouent un rôle essentiel dans de nombreuses maladies, y compris TDP-43 dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA), l&#39;alpha-synucléine dans la maladie de et bêta-amyloïde et tau dans la maladie d&#39;Alzheimer, il est extrêmement important de développer des réactifs spécifiques de morphologie qui peuvent cibler sélectivement Parkinson ces protéine spécifique de la maladie variantes d&#39;étudier le rôle de ces variants dans la pathologie de la maladie et pour des applications diagnostiques et thérapeutiques potentielles. Nous avons mis au point de nouveaux microscopie à force atomique (AFM) sur la base des techniques de biopanning qui permettent l&#39;isolement des réactifs qui reconnaissent sélectivement variants protéiques spécifiques à une maladie. Il ya deux phases clés impliqués dans le processus, les phases positives et négatives panoramiques. Pendant la phase de balayage panoramique négatif, les phages qui sont réactifs aux antigènes hors-cible sont éliminés par de multiples cycles de criblage soustractive utilisant une série d&#39;antigènes soigneusement sélectionnés hors-cible. Un élément clé dans la négativephase de panoramique est en utilisant l&#39;imagerie par AFM pour surveiller le processus et de confirmer que toutes les particules de phages indésirables sont enlevés. Pour la phase de balayage panoramique positif, l&#39;antigène cible d&#39;intérêt est fixé sur une surface de mica et les phages liés sont élues et criblée pour identifier les phages qui se lient sélectivement l&#39;antigène cible. La variante de la protéine cible n&#39;a pas besoin d&#39;être purifié fournir les commandes de panoramique négatifs appropriés ont été utilisés. Même cibler des variants de protéines qui sont seulement présentes à de très faibles concentrations en matière biologique complexe peut être utilisé dans l&#39;étape de panning positive. Grâce à l&#39;application de cette technologie, nous avons acquis des anticorps à des variantes de protéines de TDP-43 que l&#39;on retrouve de manière sélective dans le tissu cérébral SLA humaine. Nous nous attendons à ce que ce protocole doit pouvoir se appliquer à des réactifs qui se lient de manière sélective générant variants protéiques présents dans une grande variété de différents procédés biologiques et de maladies.

Dans la figure 1, le schéma montre le processus de panoramique négative par laquelle nous avons retiré antigènes hors objectif contraignant de notre bibliothèque à l&#39;aide immunotubes phage. Nous avons commencé avec de la BSA puisque ce est un agent de blocage commun et toute phage qui réagit de manière non spécifique avec cet objectif serait problématique dans les immunoessais futures. Ensuite, nous avons supprimé les liants à agrégée alpha-synucléine pour éliminer phage qui sont réactifs avec des s...

En utilisant la microscopie à force atomique en combinaison avec la technologie de biopanning, nous avons créé un système de biopanning négatif et positif pour acquérir des anticorps contre les variantes de protéines spécifiques à la maladie présentes dans n’importe quel matériel biologique, même à de faibles concentrations. Nous avons réussi à obtenir des anticorps dirigés contre des variantes de la protéine TDP-43 impliquées dans la sclérose latérale amyotrophique.

Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l&#39;isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des réactifs spécifiques à la morphologie ciblant la protéine de liaison à l'ADN du goudron. 43 variants présents dans un LS à l'aide d'une technologie de tri radiométrique biphasique basée sur la RM. Ceci est réalisé en soumettant d'abord une bibliothèque phagique diversifiée à plusieurs cycles de tri négatif contre des antigènes hors cible en utilisant des tubes immunologiques.Le tri négatif est effectué de manière séquentielle contre l'albumine de sérum bovin, l'alpha-synucléine agrégée et le tissu cérébral humain sain. La deuxième étape consiste à réaliser une vérification en microscopie à fluorescence (FM) après chaque série de tri négatif afin de s'assurer de l'élimination réussie de tous les phages indésirables. Dans cet exemple de tri négatif, des phages utilisant l'alpha-synucléine agrégée sont visibles après un tour, mais absents après le dixième tour.Ensuite, les tours restants de panning négatif sont réalisés sur MICA en raison de la disponibilité limitée de l'échantillon. Les phages réactifs aux TDP-43 immunoprécipités à partir de tissus sains et de tissus atteints de démence frontotemporale (FTD) sont éliminés de mani

novel-atomic-force-microscopy-based-biopanning-for-isolation

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

Le dépôt amyloïde est une caractéristique des différentes maladies et afflige beaucoup de différents organes. Cet article décrit l’application de la fluorescence luminescents oligothiophènes conjugués coloration en combinaison avec les techniques de microscopie de fluorescence. Cette méthode de coloration représente un outil puissant pour la détection et à l’exploration des agrégats de protéine dans les configurations cliniques et scientifiques.

Imagerie des tissus amyloïdes colorées avec Luminescent thiol conjugués par Hyperspectral confocale microscopie et imagerie de Fluorescence Lifetime

Imagerie moléculaire avec laser assistée par matrice désorption/ionisation-basée d’imagerie spectrométrie de masse (MALDI-IMS) permet la cartographie simultanée de plusieurs analytes dans des échantillons biologiques. Nous présentons ici un protocole pour la détection et la visualisation de la protéine β-amyloïde sur les tissus cérébraux de la maladie d’Alzheimer et d’angiopathie amyloïde échantillons à l’aide de MALDI-IMS.

Visualisation des dépôts β-amyloïde dans le cerveau humain avec Laser assistée par matrice désorption-ionisation d’imagerie de la spectrométrie de masse

Nous décrivons l'application de la nanospectroscopie infrarouge et de la microscopie à haute résolution pour visualiser le processus d'auto-assemblage des protéines dans les agrégats oligomériques et les fibrilles amyloïdes, qui est étroitement associée à l'entrée et au développement d'un large éventail de troubles neurodégénératifs humains.

Caractérisation des agrégats de protéines individuels par nanospectroscopie infrarouge et microscopie de force atomique

Les biomarqueurs à base de sang pour les maladies neurodégénératives sont essentiels à la mise en œuvre d’études cliniques à grande échelle. Un test sanguin fiable et validé devrait nécessiter un petit volume d’échantillon ainsi qu’une méthode d’échantillonnage moins invasive, abordable et reproductible. Cet article démontre que l’immuno-analyse d’électrophoresis capillaire à haut débit satisfait aux critères de développement potentiel de biomarqueurs.

Utilisation de l’immuno-astrophoresis capillaire immunossay à la recherche de biomarqueurs potentiels de la sclérose latérale amyotrophique dans les plaquettes humaines

Deux méthodes connexes sont décrites pour visualiser les événements subcellulaires nécessaires à la transmission synaptique. Ces protocoles permettent de surveiller en temps réel la dynamique de l’afflux de calcium présynaptique et de la fusion de la membrane des vésicules synaptiques à l’aide de l’imagerie cellulaire vivante de neurones cultivés in vitro .

Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique

Nous décrivons un protocole pour induire la transition de phase de la protéine 43 de liaison à l’ADN TAR (TDP-43) par la lumière dans les motoneurones de la colonne vertébrale en utilisant le poisson-zèbre comme modèle.

Transition de phase optogénétique du TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre

À l’aide de souris fluorescentes transgéniques, des protocoles détaillés sont décrits pour évaluer le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries dans les axones moteurs et sensoriels du nerf sciatique intact chez les animaux vivants.

Élargir la boîte à outils pour l’imagerie in vivo du transport axonal

Nous présentons ici un protocole sur la façon de préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir de cortex de rat pour l’imagerie vidéo time-lapse de Ca2+ intracellulaire pour la recherche sur la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique dans le modèle de rat hSOD1G93A .

Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique

En direct des bactéries Gram-négatives et gram-positif peut être immobilisé sur la gélatine-mica et imagée dans un liquide en utilisant la microscopie à force atomique (AFM).

Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

Découvrez une méthode de biopanning basée sur la microscopie à force atomique pour isoler des anticorps spécifiques contre les variants TDP-43 dans la sclérose latérale amyotrophique. Cette technique améliore la détection des protéines à faible concentration.

Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour lisolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique (Vidéo) | JoVE Journal

Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l'isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Explorer plus de vidéos