Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l'isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des réactifs spécifiques à la morphologie contre la protéine de liaison à l’ADN du goudron. 43 variantes présentes dans un LS en utilisant une technologie de panoramique radio biphasée basée sur la FM A. Pour ce faire, on soumet d’abord une banque de phages diversifiée à plusieurs séries de panoramiques négatifs contre des antigènes hors cible à l’aide de tubes immunitaires.

Le panoramique négatif est effectué séquentiellement contre l’albumine sérique bovine, l’alpha-synucléine agrégée et le tissu cérébral humain sain. La deuxième étape consiste à effectuer une vérification FM après chaque série de panoramiques négatifs pour garantir l’élimination réussie de tous les phages indésirables. Dans cet exemple de panoramique négatif, en utilisant des phages alpha-synucléine agrégés sont visibles après un tour, mais sont absents après le 10e tour.

Ensuite, les tours de panoramique négatifs restants sont effectués sur MICA en raison de la disponibilité limitée des échantillons. Les phages réactifs à la TDP 43 immunoprécipitée de la démence saine et de la démence frontotemporale ou du tissu FTD sont éliminés séquentiellement. La dernière étape consiste à isoler les phages qui se lient à un immunoprécipité de LS.

La TDP 43 utilisant des phages liés au mica est évoquée à l’aide de trypsine, de triéthyle, d’amine et de cellules TG 1. En fin de compte, la spécificité de ces clones potentiels de LS est vérifiée à l’aide de fa eliza indirects et de dot blots, A-L-S-F-T-D homogénéisés, et des tissus cérébraux humains sains sont immobilisés dans les deux essais. Une plus grande réactivité à un tissu LS est généralement détectée par rapport aux autres groupes testés.

Le principal avantage de cette technique par rapport au bio-panoramique conventionnel des phages est l’utilisation de protocoles exhaustifs de panoramique négatif, vérifiés par un FM, pour assurer l’isolement de réactifs qui reconnaissent sélectivement les variantes protéiques spécifiques à la maladie directement à partir d’échantillons biologiques complexes, même lorsqu’ils sont présents à de faibles concentrations. Bien qu’un FM puisse fournir des informations sur l’étude des caractéristiques biomoléculaires et des interactions, il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que le suivi de la progression du bio-enclos et la confirmation de la spécificité des CLO uniques. Commencez cette procédure par la production de phages comme détaillé dans le protocole textuel pour effectuer d’abord un panoramique négatif contre BSA, ajoutez quatre millilitres d’un milligramme par millilitre.

Solution BSA dans une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS dans 12 tubes immunitaires et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, combinez les particules de phages de chacune des trois banques, en mettant de côté une petite quantité de ce mélange de phages pour une vérification future du processus de panoramique négatif. Ensuite, jetez la solution de BSA du premier tube et lavez le tube deux à trois fois avec du PBS pour éliminer tout BSA non lié, ajoutez les banques de phages combinées dans ce premier tube, incubez pendant 30 minutes à température ambiante sur le rotateur avant de recueillir les phages non liés.

Gardez à l’esprit qu’il est important d’économiser une petite quantité de phage après avoir terminé les nombreux cycles de panoramique négatif contre chaque cible pour vérifier le succès du processus de panoramique et, en cas de contamination, répétez le processus de panoramique négatif avec les tubes restants de solution BSA à chaque fois. Utilisez le phage non lié recueilli après l’incubation du tube précédent. Vérifiez ensuite l’élimination de tous les liants de phages BSA à l’aide de la procédure A FM détaillée dans la section suivante de la vidéo.

Pour visualiser la liaison du phage à l’aide d’un FM, ajoutez 10 à 20 microlitres de l’antigène cible au mica clivé et incubez pendant cinq à 10 minutes. Lavez le MICA cinq fois avec de l’eau, puis ajoutez 10 à 20 microlitres de phages au MICA et incubez pendant cinq à 10 minutes. Lavez le mica encore cinq fois avec de l’eau et laissez-le sécher à l’air.

Exécutez un processus d’imagerie FM à l’aide d’un mode de tapotement FM avec un nanoscope trois, un contrôleur dans l’air à température ambiante. Les sondes FM au silicium ont une fréquence de résonance de 300 kilohertz et une constante de ressort de 40 newtons par mètre. Insérez l’embout FM dans le chargeur d’embouts.

Fixez le chargeur d’embouts au microscope A FM. Placez l’échantillon sous le microscope A FM. Utilisez les boutons pour aligner le laser sur l’embout A FM.

Réglez la fréquence de balayage sur 3,05 hertz et la résolution de balayage sur 512 échantillons par ligne. Auto-réglez la machine pour optimiser les vibrations de la silice. Fréquence de la pointe, lancer le balayage de l’échantillon.

L’embout balayera la surface du MICA en mesurant la hauteur du phage lié. Les phages sont les longues lignes blanches qui suivent l’acquisition des images par aplatissement de base de l’arrière-plan pour s’assurer que toutes les tailles de particules sont comparables dans chaque image. La largeur du phage peut varier d’une image à l’autre en raison d’autres tailles de particules et de la zone de balayage, mais elle ne compromettra jamais la précision de la liaison ou non du phage à l’antigène.

L’image est aplatie en une image 2D et les régions mal imagées causées par la contamination par le PEG sont mises en évidence pour être supprimées de l’analyse future des données. L’immunoprécipitation de la protéine TDP 43 saine provient de tissus cérébraux humains sains, comme décrit dans le protocole textuel, en raison de la quantité plus faible de protéine immunoprécipitée. Effectuez ces séries de panoramiques négatifs à l’aide de MICA : Couvrez d’abord huit surfaces MICA jusqu’à la première MICA à environ 100 microlitres de protéine immunoprécipitée et incubez pendant cinq à 10 minutes à température ambiante après l’incubation.

Lavez le MICA cinq fois avec une solution saline tamponnée à 0,1 % de phosphate avec du PBST abrégé tween 20. Ajoutez ensuite environ 100 microlitres de phage après le panoramique négatif contre du tissu cérébral humain sain et incubez pendant cinq à 10 minutes à température ambiante. À mi-chemin de l’incubation, ajoutez la protéine immunoprécipitée au deuxième mica.

Prélever le phage du premier MICA avant de le laver cinq fois avec 0,1 % de PBST. Après avoir lavé le deuxième mica, ajoutez le phage précédemment collecté. Répétez tout le processus jusqu’à ce que le phage soit critiqué négativement contre les huit mica avec la protéine immunoprécipitée.

Vérifiez le succès du processus de panoramique à l’aide du phage après le premier et huit cycles de panoramique négatif avec un FM pour commencer l’immunoprécipitation de la protéine TDP 43 à partir du cerveau des individus avec un LS comme décrit dans le protocole de texte, clivent trois surfaces MICA. Ajoutez ensuite 50 microlitres d’A LS TDP 43 au premier MICA après une incubation de cinq minutes à température ambiante. Lavez le MICA cinq fois avec 0,1 % de PBST.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres du phage collecté après un panoramique négatif contre TDP 43 sain dans le MICA et incubez pendant cinq minutes. Récupérez les phages non liés. Il est important de garder tous les phages collectés dans ces étapes de panoramique séparés.

Ensuite, collectez les phages liés à l’aide de trois méthodes eluciennes. Tout d’abord, ajoutez 50 microlitres de trypsine à chaque MICA et incubez pendant 10 minutes maximum. Récupérez la solution et économisez.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de triéthylamine de 100 millimolaires à chaque MICA et incubez pendant 10 minutes maximum. Prélevez la solution à un volume égal d’une molaire tris HCL tampon pH 7,4 et économisez le troisième, ajoutez 50 microlitres de TG une cellule directement dans le MICA et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. De plus, ajoutez les phages collectés lors des deux premières méthodes eluciennes à 100 microlitres de cellules TG one à la même concentration et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, répétez ce processus avec un deuxième mica. Prenez le phage non lié collecté à l’aide du premier MICA avec A LST DP 43 et ajoutez-le au deuxième MICA avec A-A-L-S-T-D-P 43 et incubez pendant cinq minutes. Combinez les cellules TG one infectées par les phages, auxquelles s’ajoute la trypsine de chaque A LST DP 43 MICA et la plaque sur toutes les plaques de tarière de Luria Burani avec de l’ampicilline ou une plaque LBA.

Répétez le même processus pour la triéthylamine et les phages auxquels il est fait allusion dans le cadre de la triéthyle one des deux ensembles de A LS TDP 43 MICA, pour un total de trois plaques. Répétez toutes les étapes avec un troisième mica A LS, cependant, dans ce cas, utilisez un phage collecté après deux cycles de panoramique négatif contre la démence frontotemporale. T DP 43 plaque les cellules TG infectées sur trois plaques LBA et incube pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain. Comptez le nombre de colonies sur les six plaques LBA avec un potentiel de clones de LS. Il devrait y avoir moins de colonies sur les trois plaques LBA de la troisième A LS MICA par rapport aux trois plaques LBA après les deux cycles de panoramique positif en utilisant le phage après un panoramique négatif contre un TDP 43 sain, produire des fragments d’anticorps à domaine variable de phage et de chaîne unique soluble, ou s cvs, à partir de ces clones et analyser à l’aide de différents immunoessais pour vérifier la spécificité d’un tissu LS.

Une imagerie FM est utilisée pour surveiller les étapes de panoramique négatif contre les différentes cibles afin de s’assurer que tous les phages réactifs sont éliminés. Les résultats d’une FM ont montré une liaison du phage après un tour de panoramique négatif contre l’alpha-synucléine agrégée et aucune liaison après huit tours. Un panoramique négatif sur des tissus cérébraux humains sains a été effectué pour éliminer les phages liant les nombreux antigènes présents dans l’homogénat du cerveau humain sain.

On voit ici la liaison du phage aux tissus sains après un cycle de panoramique négatif et l’absence de liaison du phage après 10 cycles de panoramique négatif. Après avoir préparé à la fois un phage et une ECS soluble à partir de clones potentiels, ils ont été testés dans une Eliza indirecte pour déterminer leur spécificité à un tissu LS. Presque tous les phages ont montré une préférence pour un tissu LS plutôt que pour un tissu sain.

Des résultats similaires sont obtenus en comparant la liaison des phages à un LS à la démence frontotemporale ou au tissu FTD. La comparaison de la liaison du SCFV à un tissu LS dans le tissu sain et le tissu FTD a de nouveau montré une liaison sélective à un tissu LS chez presque tous les clones. L’immunodosage par transfert de points a été utilisé pour vérifier davantage la liaison à un tissu LS et également pour déterminer quels clones sont réactifs dans d’autres applications immunologiques.

Ici, le clone deux, une liaison à un tissu LS est montrée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer un biop panoramique basé sur FM pour isoler les réactifs contre la maladie, la cible spécifique des intérêts, les réactifs, qui peuvent servir d’outils diagnostiques et/ou thérapeutiques potentiels.