Name: PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Apprenez trois méthodes de PCR en temps réel basée sur une sonde pour quantifier les microARN dans le plasma et le sérum. Cette technique permet de découvrir de nouveaux biomarqueurs pour le diagnostic des cancers et du diabète.

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Tous les auteurs reconnaissent le soutien du NHMRC CTC, Université de Sydney, la Fondation de recherche sur le diabète juvénile (FRDJ), l&#39;Australie et la Fondation Rebecca Cooper, l&#39;Australie infrastructure. Cette recherche a été financée par des subventions du Conseil australien de la recherche (FT110100254) et la FRDJ, Australie (CRN201314) pour AAH WW, RJF et MVJ effectuée tous laboratoire humide expérimentation, ASJ effectué l&#39;analyse des données. WW a écrit la première ébauche. AAH prévu l&#39;étude et analysé les données. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale du manuscrit, des chiffres et des feuilles de travail soumis pour publication.

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Article coûts de transformation / de publication ont été couverts par Life Technologies, après acceptation de ce manuscrit pour publication.

Les étapes critiques dans les protocoles de qPCR basée sonde à obtenir des résultats précis et reproductibles pour se assurer 1) le même volume et la concentration de RT-produit est chargé dans chaque réaction qPCR, 2) les rapports et les volumes corrects des composants nécessaires pour réaction qPCR sont préparés et bien mélangé, 3) les volumes corrects et cohérents sont ajoutés à chaque réaction qPCR, et 4) la préparation et le chargement de chaque échantillon et mélange réactionnel est terminée dans le plus court laps de temps possible, tout en conscient de les étapes critiques ci-dessus mentionnés plus tôt. Les cartes de réseau microfluidique besoin centrifugeuse appropriée et seaux spécifiques. Chaque godet peut contenir jusqu&#39;à trois cartes (chargé / vide). Toujours se assurer que tous les trois fentes d&#39;un seau sont occupés et le seau est équilibré en plaçant seau similaire (ce seau devrait également contenir trois cartes, soit vides ou pleines) dans la fente en face de la centrifugeuse. En plaçant la carte dans le Buckeporte-t, assurez-vous que les huit réservoirs projettent vers le haut et puits de réaction face à la paroi extérieure de la centrifugeuse. Faites tourner les cartes à 331 g pendant 1 min à température ambiante. Après la première centrifugation, ouvrir la centrifugeuse et se assurer visuellement le mélange de réaction a été distribué à travers les 384 puits. Répétez le spin au mêmes paramètres pour une fois de plus. Retirez la carte de seau et se assurer que le niveau de mélange réactionnel dans chacun des huit réservoirs est uniforme. Les incohérences dans les volumes de liquide dans les réservoirs gauche font la carte inapproprié d&#39;utiliser davantage. Pour avoir la même concentration de la RT-produit, même concentration d&#39;entrée de l&#39;ARN est ajoutée dans chaque réaction RT. La concentration d&#39;ARN total est mesuré en utilisant un micro-volumespectrophotometer. Le ratio observé 260/280 peut être aussi faible que 1,3 pour l&#39;ARN isolé à partir de plasma / sérum; cela ne semble pas avoir un effet sur ​​le processus ou les données liées qPCR-aval généré 30. De même, le rapport de 260/280les échantillons d&#39;ARN testés ici sont entre 1.3 à 1.7 sans effets anormaux dans le qPCR observés. Lors de l&#39;utilisation des échantillons à faible teneur d&#39;ARN, tels que ceux de fluides biologiques, il peut être difficile de quantifier l&#39;ARN avant le traitement. Nous recommandons l&#39;utilisation du synthétique pic-in à l&#39;isolement de l&#39;ARN ainsi que les étapes de transcription inverse. Dans notre expérience, les candidats Arabidopsis thaliana (miARN miR-ath-159a et ath-miR-172a) sont préférés Caenorhabditis elegans miARN (tels que cel-miR-39 ou cel-miR-54), qui, dans notre expérience peut avoir plus homologie que ceux de A. thaliana. L&#39;utilisation de tels spécifique du stade pic-in peut tenir compte de la normalisation des données miRNA sur plusieurs échantillons analysés à différents moments. L&#39;utilisation d&#39;un volume d&#39;entrée fixe de l&#39;ARN pour la réaction de synthèse d&#39;ADNc est également recommandé 32,33. Les trois protocoles basés sonde-miARN pour la quantification décrites ici nécessitent des quantités variablesde l&#39;entrée de l&#39;ARN total, différents flux de travail et les coûts. Chacun des flux de travail sont conçus pour répondre à différents débits basés sur le nombre de cibles miARN et le nombre d&#39;échantillons à analyser. Avec l&#39;augmentation de débit (96 RXN 384 RXN 3072 RXN), le coût par réaction diminue avec une augmentation de la quantité de données obtenues au cours d&#39;une unité de temps. Étant donné que toutes ces plates-formes utilisent chimie TaqMan, la qualité des données obtenues peut se attendre à être similaires. TaqMan qPCR est une méthode bien établie pour identifier l&#39;abondance des miARN dans les échantillons de sérum / plasma 9,11,27. Bien que les trois plates-formes discutées ici ont la même composition chimique, une diminution dans le volume de réaction conduit à une diminution de la gamme dynamique de détection de transcription (RJ Farr et al., Données non publiées). Le 96 puits plateforme qPCR est un débit plus faible, mais la plate-forme de haute sensibilité et à notre avis, le «gold standard» pour toutes les plateformes de PCR (ou colorant à base de) basée sonde. Cependant, cela peutne pas être la plate-forme la plus économique ni efficace si plusieurs centaines ou milliers d&#39;échantillons sont analysés et pour plusieurs microARN. Microfluidique (TLDA) et nanofluidique (OA) plates-formes sont des plates-formes à haut débit / contenu conçus pour permettre l&#39;acquisition de données plus grands dans un temps plus court. Bien que les différences de lots ont été observés dans les cartes TLDA, ce peut être minimisée en demandant TLDA cartes du même lot. Nous observons que la plate-forme TLDA (figure 3) montré une variation significative dans 17% des mi - miARN de faible abondance lorsqu&#39;il est testé en utilisant le même échantillon sur différents lots de cartes TLDA. Nous vous recommandons donc d&#39;utiliser les mêmes numéros de lot pour l&#39;analyse en utilisant des cartes TLDA. Cette variation pourrait aussi être due à la variabilité technique, y compris des erreurs de chargement et de pipetage. Cependant, nous conseillons de commander / demandant le même lot de cartes TLDA. Aucune variation significative n&#39;a été observée lot sur la plate-forme de l&#39;arthrose. Malgré cela, TaqMan expéri basetal qPCR approches offrent facilité pour mesurer l&#39;abondance des miARN dans les échantillons de plasma / sérum. Les approches de débit faible, moyenne et haute discutés ici offrent la flexibilité d&#39;analyser une série d&#39;échantillons et miARN l&#39;aide d&#39;un (faible bruit de fond) la chimie hautement efficace, reproductible et propre.

Les microARN (miARN) sont ~ 22 nucléotides non codante (NC) ARN, fonctionnant comme régulateurs de l&#39;expression du gène 1-3. La plupart des miARN chez les animaux fonctionnent par appariement de bases spécifique de séquence avec un ARNm, ciblant l&#39;extrémité 3 &#39;UTR, ce qui conduit à une régulation négative de l&#39;expression de gène 2-4. Cela se produit généralement par l&#39;intermédiaire de l&#39;inhibition de la traduction de l&#39;ARNm ou en ribosomique de débarquement. miARN en circulation se sont révélés être de nouveaux biomarqueurs dans la recherche et les domaines cliniques pour une variété de maladies telles que le diabète, 7.5, 8 ovaire, de la prostate et cancer du sein 9 10,11, 12 l&#39;hépatite B et d&#39;autres 13 maladies auto-immunes. Des recherches ont été menées pour identifier les miRNAs abondantes dans différentes cellules ou des tissus, ainsi que dans la circulation du plasma humain et des échantillons de sérum, ce qui est plus accessible et moins invasive 9,11-15. Différentes méthodes de quantification miARN ont été eréé en utilisant de multiples plates-formes, telles que la plate-forme de plaque standard 96 puits 4,12,16-18, la plate-forme de carte microfluidique 12,18-23 et la plate-forme de tableau 17,24 nanofluidique. Quantitative PCR en temps réel (qPCR) offre la possibilité de mesurer les nombres relatifs ou absolus de transcriptions utilisant multiple (teinturerie ou à base de sonde-chimiques). La chimie PCR en temps réel basée sur une sonde offre l&#39;avantage d&#39;une faible fluorescence de fond et une haute sensibilité pour détecter un seul exemplaire de la transcription. Il est relativement rentable, simple à utiliser et hautement reproductible, ce qui en fait une méthode privilégiée pour quantifier et déterminer miRNA expression 25. Méthode qPCR base-Probe implique généralement deux étapes: la transcription (RT) et qPCR 4,26,27 inverser. RT est l&#39;endroit où l&#39;amorce tige-boucle RT est hybridée à une molécule miARN mature ou primaire et convertie en (c) un ADN complémentaire. La quantification du produit de l&#39;ADNc est ensuite effectuée en utilisant des amorces de PCR spécifiques miARN26-28. Le principe de la PCR quantitative à base de sonde est basée sur la détection de l&#39;extension du brin complémentaire en temps réel, ce qui implique l&#39;hydrolyse de la sonde marqués par fluorescence. Ces sondes sont conçues pour contenir un rapporteur fluorescent et un extincteur qui sont tout autre pour permettre FRET (de Fluorescence Resonance Energy Transfer). La détection de l&#39;émission de la fluorescence rapporteur (émetteur) est masquée par la proximité de la molécule d&#39;agent d&#39;extinction. Lorsque la Taq polymerase (pol) se étend à partir de l&#39;amorce amont et atteint une fourche (de l&#39;extrémité 5 &#39;de la sonde), l&#39;activité pol d&#39;exonucléase de la Taq hydrolyse de la sonde, ce qui conduit à une dissociation / séparation physique de l&#39;émetteur fluorescent à partir de l&#39;extincteur. Cette version d&#39;une seule molécule de la fluorescence émetteur est enregistré par le détecteur et présenté comme une augmentation progressive du signal de fluorescence de ce puits / réaction. L&#39;augmentation de la fluorescence est proportionnelle à la quantité de produit de PCR généré, ce qui permet une précision qu26,28 antification de la cible amplifiée. Avec l&#39;augmentation de la demande dans miRNA quantification, à moyen et à des technologies à haut débit ont été développés pour permettre à un plus grand nombre d&#39;échantillons à traiter dans un court laps de temps. TaqMan Low Density Array (TLDA) est un débit moyen de conception innovante basée sur microfluidique à base de sonde-qPCR chimie offrant une augmentation du nombre de miARN analysés sur une plaque. TLDA impliquent l&#39;utilisation d&#39;un pool prédéfini de RT-amorces qui sont utilisées pour synthétiser l&#39;ADNc. Ces ADNc sont ensuite filées en une carte personnalisée 384 et micro-fluidique pour déterminer l&#39;expression de plusieurs miARN utilisant qPCR 22,26,29. Chaque puits de la carte contient séché amorces et des sondes pour amplifier miARN (s) spécifique, donc à 384 réactions peuvent être transformés dans la carte unique TLDA 26. La matrice de nanofluidique est une plate-forme à haut débit qui est utilisé pour la détection de produits de transcription de gènes <sup&gt; 24 en utilisant la même chimie du sonde. Il utilise une matrice exclusive offrant interactions hydrophobes hydrophile pour faciliter le chargement facile du mélange de réaction 33 en nanolitres en un tableau de 3072 trous traversants sur une lame en acier inoxydable 24. Cet article se concentre sur la démonstration de la façon dont ces méthodes pour quantifier miARN dans le sérum / plasma sont effectuées et les facteurs critiques qui doivent être considérés lors de l&#39;exécution et l&#39;interprétation de ces données. Prises pour compte, leurs avantages et leurs limites individuelles seront discutés dans cet article.

<table><tbody><tr><td>96 well-platform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pour la transcription</td><td></td><td></td><td></td>inverse</tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&nbsp ;</td><td>Biosystèmes appliqués &nbsp ;</td><td>4427975</td><td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 Les dosages se présentent sous la forme d’un pack d’amorces RT et d’amorces PCR.</td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse de microARN TaqMan</td><td>Applied Biosystems &nbsp ;</td><td>4366597 ou 4366596</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 ou http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 Le kit de transcription inverse de microARN TaqMan est le même que celui utilisé pour la transcription inverse dans les trois plates-formes TaqMan - plate-forme à 96 puits, TLDA et OpenArray.</td></tr><tr><td>Pour qPCR exécuté sur une plate-forme</td><td></td><td></td><td></td>de 96 puits</tr><tr><td>, 2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, pas d’AmpErase UNG&nbsp ;</td><td>Biosystèmes appliqués &nbsp ;</td><td>4367846</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 Le Master Mix PCR universel TaqMan Fast 2X est utilisé pour la qPCR sur&nbsp ; les deux plates-formes TaqMan-plate-forme à 96 puits et TLDA.</td></tr><tr><td>Film adhésif optique MicroAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Plaque de réaction optique rapide à 96 puits, 0,1 ml&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Plateforme microfluidique (TLDA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pour la transcription</td><td></td><td></td><td></td>inverse</tr><tr><td>Reportez-vous au kit de transcription inverse de microARN TaqMan à 96 puits (4366597 ou 4366596) (comme indiqué ci-dessus).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp ;</td><td>4399966</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 Le Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 est utilisé pour la RT on&nbsp ; les deux plates-formes TaqMan - TLDA et OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp ;</td><td>4444281</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 Le Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 est utilisé pour la RT sur&nbsp ; les deux plates-formes TaqMan - TLDA et OpenArray.</td></tr><tr><td>OU OU</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp ;</td><td>4444750</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 Le Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 est utilisé pour la RT sur&nbsp ; les deux plates-formes TaqMan - TLDA et OpenArray.</td></tr><tr><td>Pour la préamplification</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp ;</td><td>4391128 ou 4488593</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 ou http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 Le TaqMan PreAmp Master Mix est utilisé pour la préamplification de la qPCR sur&nbsp ; les deux plates-formes TaqMan - TLDA et OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&nbsp ;</td><td>Biosystèmes appliqués &nbsp ;</td><td>4444303</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 Le Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 est utilisé pour la préamplification de la qPCR sur&nbsp ; les deux plates-formes TaqMan - TLDA et OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp ;</td><td>4399233</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 Le Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 est utilisé pour la préamplification de la qPCR sur&nbsp ; les deux plates-formes TaqMan - TLDA et OpenArray.</td></tr><tr><td>1x tampon TE (100 ml)</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product Le tampon TE 1x est utilisé pour la préamplification de la qPCR sur&nbsp ; les deux plates-formes TaqMan - TLDA et OpenArray.</td></tr><tr><td>Pour charger et exécuter la carte</td><td></td><td></td><td></td>de microfluidique à 384 puits (TLDA)</tr><tr><td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td></tr><tr><td>Plateforme de nanofluidique (OpenArray)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pour la transcription</td><td></td><td></td><td></td>inverse</tr><tr><td>Reportez-vous au kit de transcription inverse de microARN TaqMan à 96 puits (4366597 ou 4366596) (comme indiqué ci-dessus).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pour la préamplification</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>reportez-vous aux réactifs de préamplification TLDA (comme indiqué ci-dessus)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pour charger et exécuter les lames</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panneau)</td><td>Applied Biosystems &nbsp ;</td><td>4470187</td><td></td></tr><tr><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 kit d’accessoires QuantStudio 12K Flex OpenArray&nbsp ;</td><td>Biosystèmes appliqués &nbsp ;</td><td>4469576</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td></tr><tr><td>Plaques d’échantillon OpenArray 384 puits&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Biosystèmes appliqués &nbsp ;</td><td>4406947</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp ;</td><td>4462159</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td></tr><tr><td>conseils sur le système OpenArray AccuFill&nbsp ;</td><td>Biosystèmes appliqués &nbsp ;</td><td>4457246</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td></tr><tr><td>Autres</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Qiagen</td><td>129117</td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td></tr></tbody></table>

pcr en temps réel basée sur une sonde approches de mesure quantitative des microarn

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

PCR quantitative basée-Probe (qPCR) est une méthode privilégiée pour mesurer l&#39;abondance des transcrits, puisque ce est l&#39;une des méthodes de détection les plus sensibles qui fournit une analyse précise et reproductible. La chimie à base de sonde offre le moins de fluorescence d&#39;arrière-plan par rapport aux autres chimies (à base de colorants). Actuellement, il existe plusieurs plates-formes disponibles que la chimie basée sur une sonde d&#39;utilisation pour quantifier l&#39;abondance des transcrits. qPCR dans une plaque de 96 puits est la méthode la plus couramment utilisée, mais seulement un maximum de 96 échantillons ou miARN peut être testée en un seul passage. Ce est fastidieux et pénible si un grand nombre d&#39;échantillons / miRNAs sont à analyser. Plateformes sonde haut-débit tels que la microfluidique (par exemple TaqMan tableau Card) et des tableaux de nanofluidique (par exemple OpenArray) offre de facilité de détecter de façon reproductible et efficacement l&#39;abondance de plusieurs microARN dans un grand nombre d&#39;échantillons en peu de temps. Ici, nous démontrons le dispositif expérimental d&#39;unee protocole pour la quantification de miARN échantillons de sérum ou plasma EDTA, en utilisant la chimie à base de sonde et de trois plates-formes différentes (plaque de 96 puits, la microfluidique et les tableaux de nanofluidique) offrant des niveaux croissants de débit.

Le volume recommandé pour une réaction qPCR de dosage à base de sonde miARN est de 20 pi. REMARQUE: Nous avons confirmé que un volume réactionnel de 5 ul est capable de produire des résultats similaires à ceux obtenus en utilisant 20 ul de volume 4,7,30. L&#39;abaissement du volume de réaction de 5 ul permet une diminution de 75% dans les coûts de réactifs sans perte appréciable de la sensibilité. Comme présenté sur la figure 2, les volumes de réaction de 20 ul et 5 ul montrent une corrélation forte jusqu&#39;à 39 cycles (avec R 2 de 0,92, p = 0,0002). réseau de microfluidique fournit un outil pour obtenir des données sur 754 miARN exprimés dans un échantillon d&#39;environ 5 heures (pour carte A et B carte), qui est un moyen plus efficace d&#39;analyser de multiples échantillons par rapport aux classiques 96 PCR de la plaque ainsi. Nous avons comparé miRNA cartes du tableau de la microfluidique pour le même échantillon (échantillon A et de l&#39;échantillon A répétition) Figure 3A -. B montre un graphique de Bland-Altman (&lt;strong&gt; 3A) et l&#39;intrigue de corrélation (3B) pour tous les 754 miARN testés pour ces échantillons. Il ya trois miARN de contrôle différents (U6, RNU44 et RNU48) placés au hasard sur les deux cartes (carte A et B) dans de multiples endroits. Lorsque le seuil de cycle de U6 (CT) valeurs sont comparées entre les deux courses, nous ne avons pas observé de différences significatives entre les valeurs (tableau 4). Il est également important de noter ici que U6 est exprimé à plus grande abondance (valeur inférieure Ct) dans l&#39;échantillon évalué. Nous avons ensuite comparé les miARN qui ont des valeurs Ct entre 0 à 19,99 dans les deux pistes (n = 150), qui avait expression similaire des miARN globale avec un coefficient de détermination de 98% (figure 3C-D). De tous les 277 miARN qui ont des valeurs Ct entre 20 et 29,99 dans les deux pistes, 16 Mirs différaient significativement entre les pistes originales et les reprises (Figure 3E - F) Le nombre de miARN avec différence significative betwee.n les pistes ont augmenté (89 sur 327) lorsque les valeurs de Ct ont été sélectionnés entre 30-40 pour les deux courses (Figure 3G - H). La plate-forme nanofluidique tableau fournit des données pour 754 miARN de chaque échantillon sérum / plasma testées, comme représenté sur la figure 4A Il est important d&#39;examiner ces courbes d&#39;amplification -. Comme il est avec tous qPCR - pour se assurer que le résultat est révélateur d&#39;une véritable amplification. Chacun des 48 sous-réseaux (Figure 1) contient également un test pour les trois &quot;ménage&quot; ncRNAs plus populaires:. U6, RNU44 et RNU48 figure 4B illustre un regroupement typique de U6 reproduit à partir d&#39;un seul échantillon. Ces répétitions affichent faible déviation standard (SD &lt;0,5) et sont donc un indicateur de la fiabilité. Alternativement, la figure 4C montre la variabilité accrue des répétitions de U6 (SD&gt; 0,5) dans un second échantillon. Ce ne nie pas la validité of les essais restants, bien qu&#39;il ne nécessite une critique plus approfondie. U6, comme avec la plupart miARN &quot;d&#39;entretien&quot; dans les liquides biologiques, peut avoir une expression variable. Il convient de noter que l&#39;un des échantillons, décrites dans la figure 4C, affiche quatre fois moins de contenu U6 que celle présentée dans la figure 4B. Puisque le niveau de U6 dans l&#39;échantillon présenté dans 4C est 75% de moins pour commencer que celui présenté dans le panneau 4B, une plus grande variabilité technique est prévu en raison de la distribution de Poisson des transcriptions, qui est exacerbé par le faible volume de réaction 17. Un autre outil utile est les images de contrôle de la qualité (CQ), disponibles à l&#39;exportation une fois la course terminée. Une sélection de ceux-ci utilise la fluorescence du ROX, le colorant passif trouvé dans le mélange de réactifs qPCR, pour confirmer que chaque trou de passage a été chargé correctement (figure 5). Un trou de passage, voire une salle<html> pneu sous-réseau, ne peut pas charger en raison du volume d&#39;échantillon insuffisant, l&#39;évaporation, des bulles présentes dans les puits de la plaque de l&#39;échantillon de 384 puits, le défaut de supprimer complètement le joint de la plaque de l&#39;échantillon, ou des défauts dans le système Accufill ou de ses conseils. Toute déchargés trous traversants doivent être identifiés afin d&#39;éviter miARN d&#39;étiquetage «indétectable», alors qu&#39;en réalité, le test n&#39;a jamais été chargé. Si ce problème est rencontré, confirmer que au moins 5 pi de l&#39;échantillon / mastermix est chargé dans chaque puits de la plaque de l&#39;échantillon de 384 puits, la plaque d&#39;échantillon est correctement centrifugé avant le chargement, le papier d&#39;aluminium est complètement enlevée, et l&#39;OpenArray chargé diapositive est scellé et exécuté dans le délai imparti pour tous les essais successifs. Si des problèmes de chargement persistent, ils peuvent être plus susceptibles relatives à lot spécifique ou un lot des tableaux ou des consommables connexes et obtenir de l&#39;aide devrait être recherchée par le fabricant. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1: Disposition des échantillons pour le tableau flux Nanofluidique: (A) Chaque plaque d&#39;échantillon 384 puits peut contenir des échantillons jusqu&#39;à huit tableaux de nanofluidique. (B) Dilué, ADNc pré-amplifiée est placé dans huit puits (2 colonnes par quatre lignes), avec piscine A et le groupe B en groupes de 8 puits adjacents. Chaque cercle représente un puits. (C) Chaque puits de la plaque de l&#39;échantillon sera chargé dans un sous-réseau de la matrice de nanofluidique. Chaque petit carré représente une sous-tableau. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Figure 2: L&#39;analyse des co-relation pour les plateformes classiques 96 puits PCR: Co-relation entre 20 pi et 5 volumes de réaction de pi sur TaqMan en temps réel qPCR utilisant une plate-forme de plaque standard 96 puits dans les valeurs CT (39 cycles). Nous avons comparé quatre différents microARN (miR-375, miR-30c, miR-30d et miR-7) dans quatre échantillons différents de sérum et de plasma humains. Seuls les 11 points de données sont tracés puisque les autres étaient indétectables. R 2 = 0,92, p = 0,0002. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Figure 3: circulation miRNA profilage à l&#39;aide de cartes microfluidique tableau en utilisant deux cartes microfluidiques (carte-A et de la carte-B), un profil de 754 miARN est généré (A - B). Comme le montre ici, nous avons utilisé même échantillon pour deux tableau microfluidique exécute pour vérifier la reproductibilité des résultats de cartes de la microfluidique. Nous avons observé une expression similaire des miARN dans l&#39;ensemble, avec des valeurs Ct entre 0 à 19,99 (C - D). Il ya peu de miARN (16 de 277) avec les valeurs de Ct entre 20 à 29,99 et significatives différences entre répétition pistes (E - F). Quatre-vingt neuf des 327microARN avec les valeurs de Ct plus élevés (30 à 40) présentaient des différences significatives entre les deux manches (G - H). &#160; Les données sont analysées en utilisant le test t apparié. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Figure 4: Profil des courbes représentant l&#39;amplification par PCR produit: est une figure représentative des courbes (A) d&#39;amplification combinés de toutes les cibles miARN pour un échantillon de plasma humain. Un dosage de U6 (un contrôle commun ARNnc) est placé dans chaque sous-réseau. L&#39;échantillon en (B) présente une faible variabilité (SD &lt;0,5), tandis que (C) montre écart-type élevé (SD&gt; 0,5) dans U6 réplique. Les deux échantillons sont total ARN isolé à partir de plasma humain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Figure 5: Analyse des Nanofluidique QC tableaux: contrôle de la qualité (CQ) des images d&#39;un tableau nanofluidique chargé correctement (à gauche) et un tableau nanofluidique mal chargé (à droite). Le colorant passif, ROX (présent dans le mélange de réactifs qPCR), émet une fluorescence à indiquer un trou traversant correctement chargé. Le tableau sur la droite dispose de plusieurs sous-réseaux / trous traversants qui ne sont pas chargées avec le mélange de réactifs qPCR et ceux-ci doivent être identifiés comme des réactions PCR faussement négatifs. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume réactionnel par 5 ul (ul) </td></tr&gt; <tr><td> Tampon RT (10x) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> dNTP (100 mM) </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Inhibiteur RNase </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> L&#39;eau sans nucléase </td><td> 1,39 </td></tr><tr><td> Transcriptase inverse </td><td> 0,33 </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 2,33 </td></tr></tbody></table> Tableau 1A: RT composants de mélange réactif dans un 5 pi RT préparation de réaction pour TaqMan en temps réel qPCR utilisant une plate-forme de plaque de 96 puits standard. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume réactionnel par 5 ul (ul) </td><td> Volume par réaction 20 ul (ul) </td></tr><tr><td> Mastermix PCR rapide (2x) </td><td> 2,5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Dosage TaqMan PCR quantitative (20x) * </td><td> 0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Sans nucléaseeau </td><td> 1,45 </td><td> 5,8 </td></tr><tr><td> Volume total: </td><td> 4.2 </td><td> 16,8 </td></tr></tbody></table> * Composant de dosage basé sur le miRNA choisi testé. Tableau 1B: qPCR composants de mélange réactif dans un 5 ou 20 ul qPCR préparation de réaction pour TaqMan en temps réel qPCR utilisant une plate-forme de plaque de 96 puits standard. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume par réaction (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primaires (10x) </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> dNTP avec dTTP (100 mM) </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> MultiScribe la transcriptase inverse (50 U / ul) </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0,9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor &amp; #<html> 160; (20 U / ul) </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tableau 2A: RT composants de mélange réactif dans un 5 pi RT préparation de réaction pour le panneau TLDA miARN. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume par réaction (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primaires (10x) </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> L&#39;eau sans nucléase </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tableau 2B: PreAmp composants de mélange réactif dans une préparation de réaction 25 pi pré-amplification pour le panneau TLDA miARN. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume par réaction (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primaires (10x) </td><td> 0,75 </td></tr><tr><td> dNTP avec dTTP (100 mM) </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> MultiScribe la transcriptase inverse (50 U / ul) </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0,75 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0,9 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la RNase (20 U / ul) </td><td> 0,09 </td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 0,35 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tableau 3A: RT composants de mélange réactif dans un 5 pi RT préparation de réaction pour le panneau nanofluidique miARN basé sonde. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume par réaction (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primaires (10x) </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> L&#39;eau sans nucléase </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tableau 3B:. PreAmp composants réactifs de mélange dans une préparation de réaction 25 pi pré-amplification pour le panneau nanofluidique miARN base de sonde REMARQUE: Le complémentaire interactive feuilles de calcul Excel fournies pour les trois plates-formes, représente déjà l&#39;ajout de 5% afin de compenser pour le pipetage erreur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Échantillon A </td><td> Exemple Une répétition </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tableau 4: circulation miRNA profilage U6 microfluidique carte de tableau. L&#39;utilisation de deux cartes de réseau microfluidique (A et B). Les valeurs Ct de miARN de commande de U6 de l&#39;échantillon A (total = 8). Contrôle de U6 Conformément miRNA abondance observée entre les pistes.

MicroARN qui circulent ont récemment émergé comme biomarqueurs prometteurs et novateurs en vue de divers cancers et d&#39;autres maladies. Le but de cet article est de discuter de trois plateformes de PCR différents basés sonde en temps réel et les méthodes qui sont disponibles pour quantifier et déterminer l&#39;abondance des microARN circulation.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de démontrer trois méthodes différentes de PCR en temps réel basées sur des sondes utilisées pour quantifier les micro-ARN dans des échantillons de plasma et de sérum. La PCR en temps réel basée sur une sonde est réalisée par hydrolyse et détection de la sonde marquée par fluorescence, qui contient un rapporteur fluorescent et un extincteur. Lorsque la polymérase tack s’étend de l’amorce amont et atteint l’extrémité cinq prime de la sonde, elle conduit à une dissociation physique de l’émetteur fluorescent de l’extincteur.Ensuite, une seule molécule de fluoro quatre est libérée, qui est enregistrée par le détecteur et présentée comme une augmentation progressive du signal fluorescent de cette réaction. En fin de compte, la quantité de produit PCR générée peut être mesurée en fonction de l’augmentation de la fluorescence, ce qui permet une quantification précise de l’amplification cible amplifiée. Cette méthode s’avère prometteuse pour découvrir de nouveaux biomarqueurs pour divers cancers et d’autres maladies telles que le diabète.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’abondance des microARN dans le sérum et le plasma, elle peut également être appliquée à d’autres échantillons tels que les cellules et les tissus périphériques. Une démonstration visuelle de ce protocole est essentielle car certaines des étapes impliquées dans le scellement de la lame du réseau nanofluidique peuvent être difficiles à apprendre en lisant simplement le protocole Pour la détection quantitative en temps réel de micro ARN matures par PCR basée sur une sonde à 4,2 microlitres des mélanges de réactifs QPCR individuels à chaque puits d’une plaque optique à 96 puits, suivi de 0,8 microlitre de la solution réactionnelle de CDNA fraîchement préparée appropriée. Scellez la plaque avec le couvercle optique approprié, puis démarrez la QPCR sur le système de PCR en temps réel.Pour préparer une carte de réseau microfluidique avec un à 1000 nanogrammes d’ARN total en entrée de départ, décongelez d’abord le tampon d’amorces des pools A et B, les phosphates de nucléotides désoxydésoxy, le chlorure de magnésium et l’inhibiteur d’ARN sur de la glace. Ensuite, pour effectuer la transcription inverse, aliquote 100 nanogrammes de chaque échantillon d’ARN dans un tube de pool A ou de pool B, suivi de l’ajout du volume approprié d’eau sans nucléase pour porter le volume total de chaque tube à trois microlitres. Ensuite, aliquote de 4,5 microlitres du réactif de transcription inverse approprié mélangé dans les tubes correspondants appropriés.Placez ensuite les échantillons dans le thermocycleur et lancez la transcription inverse. Alors que la transcription inverse progresse. Pour des entrées totales d’échantillons d’ARN comprises entre un et 350 nanogrammes, décongelez le pool prédéfini d’amorces de préamplification sur de la glace lorsque les échantillons sont prêts, aliquote 22,5 microlitres du réactif de préampli approprié.Mélangez dans les tubes de la piscine A et de la piscine B et ajoutez 2,5 microlitres de l’échantillon de CDNA transcrit à l’envers dans chacun. Chargez ensuite les échantillons dans le thermocycleur et démarrez le cycle de préampli. À la fin du cycle, ajoutez 75 microlitres de tampon 0,1 x tris EDTA au CDNA pré-amplifié pour charger la carte microfluidique.Ensuite, ajoutez 450 microlitres de mélange de réactifs QPCR à neuf microlitres d’ADNC amplifié PREPL dilué pour la carte A, utilisez le produit amplifié PREPL préparé à l’aide du pool d’amorces A et ajoutez 441 microlitres d’eau sans nucléases à un volume final de 900 microlitres. Ensuite, une fois qu’elle atteint la température ambiante, retirez la carte de réseau basse densité tack man de son emballage et placez-la, côté feuille vers le bas, sur une zone propre. Ajouter 100 microlitres de réaction PCR.Mélangez dans chacun des huit ports de remplissage de la carte. Faites tourner la carte pendant une minute à 331 GS et à température ambiante. Ensuite, d’un trait lent, régulier et uniforme, poussez le chariot sur la carte jusqu’à ce qu’il atteigne le point final de la scelleuse.Retirez la carte de matrice scellée et coupez les réservoirs. Vérifiez ensuite que le couvercle chauffé par le bloc et le support d’échantillon appropriés sont installés dans le système de PCR en temps réel du réseau microfluidique. Pour charger les réseaux nanofluidiques, décongelez le prepl dilué, le CDNA amplifié et le réactif QPCR en temps réel tack man.Mélangez et mélangez le flacon de réactif QPCR en remuant. Ensuite, ajoutez 22,5 microlitres de mélange de réactifs QPCR à 22,5 microlitres de prépl dilué, CDNA amplifié. Ajoutez ensuite cinq microlitres de chaque échantillon dans huit puits de la plaque d’échantillonnage à 384 puits du flux de travail du réseau nanofluidique, en prenant soin de placer le pool A et le pool B de chaque échantillon.Dans les huit blocs de puits adjacents, lorsque tous les échantillons ont été transférés, couvrez chaque section de la plaque avec des morceaux de scelleuse de plaques d’échantillons à réseau ouvert. Ensuite, décongelez la première lame du réseau nanofluidique à température ambiante après environ 15 minutes. Confirmez que le couvercle d’édition de bloc et le support d’échantillon corrects sont installés dans le système de réseau nanofluidique, puis desserrez le piston de la seringue de fluide d’immersion en tirant doucement.Retirez le bouchon, mettez l’embout en place et rincez l’air de l’embout. Placez ensuite les pointes du système de chargement dans le système de chargement. Ouvrez le couvercle et placez la plaque d’échantillon dans le système de chargement.Maintenant, mettez une paire de gants bien ajustés. Ouvrez délicatement l’emballage de la diapositive et inclinez lentement la diapositive hors de l’emballage sans toucher le haut. Placez la glissière dans le système de chargement avec le code-barres sur la gauche.Retirez ensuite la scelleuse de la partie de la plaque d’échantillon destinée au chargement et utilisez le logiciel du système de chargement pour entrer la position de la glissière du code-barres de la glissière, la position de l’échantillon et la configuration de la pointe. Pendant le chargement de la diapositive, retirez le plastique transparent et rouge du bas du couvercle de la diapositive. Ensuite, retirez et scellez soigneusement la glissière dans les 90 secondes suivant la fin du processus de chargement.Placez la glissière à l’intérieur de la pince à plaque et le couvercle coulissant sur la glissière pendant 30 secondes en confirmant que le couvercle est positionné de manière à ce que le code-barres s’affiche correctement. Positionnez ensuite la seringue de liquide d’immersion à l’intérieur de la lame de manière à ce que l’embout appuie contre le couvercle et remplissez lentement la lame de liquide d’immersion en veillant à ce que le liquide coule le long du couvercle. Une fois la glissière pleine, scellez-la avec le bouchon en tournant la vis jusqu’à ce que la poignée se brise.Enfin, retirez le couvercle en plastique sur le dessus du couvercle de la diapositive et placez soigneusement la lame dans le support de lame du système de PCR en temps réel. Prenez soin de soutenir le bas de la glissière pendant qu’elle est abaissée sans toucher le haut de la glissière. Ensuite, initialisez le système de PCR et démarrez le programme de PCR quantitative dans l’heure qui suit le chargement des échantillons.En utilisant cette procédure, un volume de réaction de cinq microlitres peut produire des résultats similaires à ceux obtenus avec un volume de 20 microlitres avec une forte corrélation. Jusqu’à 39 cycles ici, des graphiques d’Altman et de corrélation fades sont montrés pour les 754 micro-ARN testés sur le même échantillon à l’aide de cartes de réseau microfluidique, comme cela vient d’être démontré Les microARN qui ont des valeurs CT comprises entre zéro et 19,99 dans les deux pistes présentent également des expressions similaires avec un coefficient de détermination de 98 %. Dans ce graphique, les données de la plate-forme de réseau nanofluidique pour les 754 microARN sont présentées.Il est important d’examiner les courbes d’amplification pour s’assurer que les résultats sont indicatifs d’une véritable amplification. Les microARN d’entretien, tels que U six, doivent également être examinés pour déterminer leur variabilité. Par exemple, dans ce graphique, un regroupement typique de U, six répétitions affichant un faible écart-type sont montrées, ce qui indique la fiabilité des données.Enfin, ces données illustrent la variabilité accrue de U six répétitions dans un deuxième échantillon. Les technologies basées sur des sondes à haut débit, telles que les réseaux de microfluidique et de fluidique Nana, offrent la facilité de détecter de manière reproductible et efficace l’abondance de plusieurs microARN dans un grand nombre d’échantillons en très peu de temps. Chacun des flux de travail est conçu pour répondre à différents débits en fonction du nombre de cibles de microARN et du nombre d’échantillons à analyser.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer différentes techniques de PCR en temps réel basées sur des sondes pour majorer l’abondance des micro-NA.

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