PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

L’objectif général de l’expérience suivante est de démontrer trois méthodes différentes de PCR en temps réel basées sur des sondes utilisées pour quantifier les micro-ARN dans des échantillons de plasma et de sérum. La PCR en temps réel basée sur une sonde est réalisée par hydrolyse et détection de la sonde marquée par fluorescence, qui contient un rapporteur fluorescent et un extincteur. Lorsque la polymérase tack s’étend de l’amorce amont et atteint l’extrémité cinq prime de la sonde, elle conduit à une dissociation physique de l’émetteur fluorescent de l’extincteur.

Ensuite, une seule molécule de fluoro quatre est libérée, qui est enregistrée par le détecteur et présentée comme une augmentation progressive du signal fluorescent de cette réaction. En fin de compte, la quantité de produit PCR générée peut être mesurée en fonction de l’augmentation de la fluorescence, ce qui permet une quantification précise de l’amplification cible amplifiée. Cette méthode s’avère prometteuse pour découvrir de nouveaux biomarqueurs pour divers cancers et d’autres maladies telles que le diabète.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’abondance des microARN dans le sérum et le plasma, elle peut également être appliquée à d’autres échantillons tels que les cellules et les tissus périphériques. Une démonstration visuelle de ce protocole est essentielle car certaines des étapes impliquées dans le scellement de la lame du réseau nanofluidique peuvent être difficiles à apprendre en lisant simplement le protocole Pour la détection quantitative en temps réel de micro ARN matures par PCR basée sur une sonde à 4,2 microlitres des mélanges de réactifs QPCR individuels à chaque puits d’une plaque optique à 96 puits, suivi de 0,8 microlitre de la solution réactionnelle de CDNA fraîchement préparée appropriée. Scellez la plaque avec le couvercle optique approprié, puis démarrez la QPCR sur le système de PCR en temps réel.

Pour préparer une carte de réseau microfluidique avec un à 1000 nanogrammes d’ARN total en entrée de départ, décongelez d’abord le tampon d’amorces des pools A et B, les phosphates de nucléotides désoxydésoxy, le chlorure de magnésium et l’inhibiteur d’ARN sur de la glace. Ensuite, pour effectuer la transcription inverse, aliquote 100 nanogrammes de chaque échantillon d’ARN dans un tube de pool A ou de pool B, suivi de l’ajout du volume approprié d’eau sans nucléase pour porter le volume total de chaque tube à trois microlitres. Ensuite, aliquote de 4,5 microlitres du réactif de transcription inverse approprié mélangé dans les tubes correspondants appropriés.

Placez ensuite les échantillons dans le thermocycleur et lancez la transcription inverse. Alors que la transcription inverse progresse. Pour des entrées totales d’échantillons d’ARN comprises entre un et 350 nanogrammes, décongelez le pool prédéfini d’amorces de préamplification sur de la glace lorsque les échantillons sont prêts, aliquote 22,5 microlitres du réactif de préampli approprié.

Mélangez dans les tubes de la piscine A et de la piscine B et ajoutez 2,5 microlitres de l’échantillon de CDNA transcrit à l’envers dans chacun. Chargez ensuite les échantillons dans le thermocycleur et démarrez le cycle de préampli. À la fin du cycle, ajoutez 75 microlitres de tampon 0,1 x tris EDTA au CDNA pré-amplifié pour charger la carte microfluidique.

Ensuite, ajoutez 450 microlitres de mélange de réactifs QPCR à neuf microlitres d’ADNC amplifié PREPL dilué pour la carte A, utilisez le produit amplifié PREPL préparé à l’aide du pool d’amorces A et ajoutez 441 microlitres d’eau sans nucléases à un volume final de 900 microlitres. Ensuite, une fois qu’elle atteint la température ambiante, retirez la carte de réseau basse densité tack man de son emballage et placez-la, côté feuille vers le bas, sur une zone propre. Ajouter 100 microlitres de réaction PCR.

Mélangez dans chacun des huit ports de remplissage de la carte. Faites tourner la carte pendant une minute à 331 GS et à température ambiante. Ensuite, d’un trait lent, régulier et uniforme, poussez le chariot sur la carte jusqu’à ce qu’il atteigne le point final de la scelleuse.

Retirez la carte de matrice scellée et coupez les réservoirs. Vérifiez ensuite que le couvercle chauffé par le bloc et le support d’échantillon appropriés sont installés dans le système de PCR en temps réel du réseau microfluidique. Pour charger les réseaux nanofluidiques, décongelez le prepl dilué, le CDNA amplifié et le réactif QPCR en temps réel tack man.

Mélangez et mélangez le flacon de réactif QPCR en remuant. Ensuite, ajoutez 22,5 microlitres de mélange de réactifs QPCR à 22,5 microlitres de prépl dilué, CDNA amplifié. Ajoutez ensuite cinq microlitres de chaque échantillon dans huit puits de la plaque d’échantillonnage à 384 puits du flux de travail du réseau nanofluidique, en prenant soin de placer le pool A et le pool B de chaque échantillon.

Dans les huit blocs de puits adjacents, lorsque tous les échantillons ont été transférés, couvrez chaque section de la plaque avec des morceaux de scelleuse de plaques d’échantillons à réseau ouvert. Ensuite, décongelez la première lame du réseau nanofluidique à température ambiante après environ 15 minutes. Confirmez que le couvercle d’édition de bloc et le support d’échantillon corrects sont installés dans le système de réseau nanofluidique, puis desserrez le piston de la seringue de fluide d’immersion en tirant doucement.

Retirez le bouchon, mettez l’embout en place et rincez l’air de l’embout. Placez ensuite les pointes du système de chargement dans le système de chargement. Ouvrez le couvercle et placez la plaque d’échantillon dans le système de chargement.

Maintenant, mettez une paire de gants bien ajustés. Ouvrez délicatement l’emballage de la diapositive et inclinez lentement la diapositive hors de l’emballage sans toucher le haut. Placez la glissière dans le système de chargement avec le code-barres sur la gauche.

Retirez ensuite la scelleuse de la partie de la plaque d’échantillon destinée au chargement et utilisez le logiciel du système de chargement pour entrer la position de la glissière du code-barres de la glissière, la position de l’échantillon et la configuration de la pointe. Pendant le chargement de la diapositive, retirez le plastique transparent et rouge du bas du couvercle de la diapositive. Ensuite, retirez et scellez soigneusement la glissière dans les 90 secondes suivant la fin du processus de chargement.

Placez la glissière à l’intérieur de la pince à plaque et le couvercle coulissant sur la glissière pendant 30 secondes en confirmant que le couvercle est positionné de manière à ce que le code-barres s’affiche correctement. Positionnez ensuite la seringue de liquide d’immersion à l’intérieur de la lame de manière à ce que l’embout appuie contre le couvercle et remplissez lentement la lame de liquide d’immersion en veillant à ce que le liquide coule le long du couvercle. Une fois la glissière pleine, scellez-la avec le bouchon en tournant la vis jusqu’à ce que la poignée se brise.

Enfin, retirez le couvercle en plastique sur le dessus du couvercle de la diapositive et placez soigneusement la lame dans le support de lame du système de PCR en temps réel. Prenez soin de soutenir le bas de la glissière pendant qu’elle est abaissée sans toucher le haut de la glissière. Ensuite, initialisez le système de PCR et démarrez le programme de PCR quantitative dans l’heure qui suit le chargement des échantillons.

En utilisant cette procédure, un volume de réaction de cinq microlitres peut produire des résultats similaires à ceux obtenus avec un volume de 20 microlitres avec une forte corrélation. Jusqu’à 39 cycles ici, des graphiques d’Altman et de corrélation fades sont montrés pour les 754 micro-ARN testés sur le même échantillon à l’aide de cartes de réseau microfluidique, comme cela vient d’être démontré Les microARN qui ont des valeurs CT comprises entre zéro et 19,99 dans les deux pistes présentent également des expressions similaires avec un coefficient de détermination de 98 %. Dans ce graphique, les données de la plate-forme de réseau nanofluidique pour les 754 microARN sont présentées.

Il est important d’examiner les courbes d’amplification pour s’assurer que les résultats sont indicatifs d’une véritable amplification. Les microARN d’entretien, tels que U six, doivent également être examinés pour déterminer leur variabilité. Par exemple, dans ce graphique, un regroupement typique de U, six répétitions affichant un faible écart-type sont montrées, ce qui indique la fiabilité des données.

Enfin, ces données illustrent la variabilité accrue de U six répétitions dans un deuxième échantillon. Les technologies basées sur des sondes à haut débit, telles que les réseaux de microfluidique et de fluidique Nana, offrent la facilité de détecter de manière reproductible et efficace l’abondance de plusieurs microARN dans un grand nombre d’échantillons en très peu de temps. Chacun des flux de travail est conçu pour répondre à différents débits en fonction du nombre de cibles de microARN et du nombre d’échantillons à analyser.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer différentes techniques de PCR en temps réel basées sur des sondes pour majorer l’abondance des micro-NA.